Summary
Vi beskriver en ny gange analysesystem, Paw-print analyse av kontrast-Enhanced innspillinger (narrestreker), en åpen tilgang automatisert system for kvantifisering av gange egenskaper i rotter som utnytter en roman delvis gjennomsiktig gulv til automatisk kvantifisere gange. Dette systemet ble validert ved hjelp av haloperidol modell av Parkinsons sykdom.
Abstract
Gange analyse brukes til å kvantifisere endringer i motorisk funksjon i mange gnager modeller av sykdom. Til tross for viktigheten av å vurdere gange og motorisk funksjon i mange områder av forskningen, de tilgjengelige kommersielle alternativene har flere begrensninger som høye kostnader og mangel på tilgjengelig, åpen kode. For å løse disse problemene, utviklet vi narrestreker, Paw-print analyse av kontrast-forbedret Recordings, for automatisert kvantifisering av gange. Kontrasten-forsterket registreringene er produsert av benytter en gjennomskinnelig gulvet det tilslører emner ikke inne berøring med det overflate, effektivt isolere rotta ' pote Printer idet den går. Ved hjelp av disse videoene, måler vårt enkle program pålitelig en rekke spatiotemporal gange parametere. For å demonstrere at narrestreker nøyaktig kan oppdage endringer i motorisk funksjon, brukte vi en haloperidol modell av Parkinsons sykdom (PD). Vi testet rotter ved to doser haloperidol: høy dose (0,30 mg/kg) og lav dose (0,15 mg/kg). Haloperidol betydelig økt holdning varighet og hind pote kontaktområde i lav dose tilstand, som kan forventes i en PD-modell. I den høye dose tilstand, fant vi en tilsvarende økning i kontaktområdet, men også en uventet økning i skrittlengde. Med videre forskning, fant vi at dette økt skrittlengde er konsistent med oppkvikkende-Escape fenomenet vanligvis observert ved høyere doser av haloperidol. Således, narrestreker var kjøpedyktig merker begge to ventet og uventede endre inne gnager gange mønstre. I tillegg har vi bekreftet at narrestreker er konsistent og nøyaktig sammenlignet med manuell scoring av gange parametere.
Introduction
Gnagere er ofte brukt som modeller for å studere et bredt spekter av sykdommer og skader, inkludert leddgikt1, Parkinsons sykdom (PD)2,3, nevromuskulær lidelser4,5, hydrocephalus6 og ryggmargsskade7. I disse forholdene, kan symptomer som smerte, balanse, og motorisk funksjon måles ved å studere dyrene ' gange mønstre. Disse mønstre er kvantifisert benytter en sette av spatiotemporal gange parameterene det sammenfatte lokaliseringen og beregner av pote Printer likeledes idet arealet av pote sette i forbindelse med på bakken.
Selv om det finnes mange alternativer for gange analyse, har dagens systemer flere ulemper. I tradisjonelle blekk-og papir tester er et dyrs poter belagt med blekk før det går over et ark med hvitt papir (figur 1a). De resulterende pote utskrifter kan deretter måles for skrittlengde og holdning bredde, men nøkkelen Temporal gang parametre som hastighet eller trinn varighet kan ikke vurderes. Moderne video-baserte systemer er mer pålitelige, men video analyse krever arbeidskrevende frame-by-frame scoring med mindre et egnet automatisert system brukes8. Det er mange kommersielle automatiserte scoring systemer for tiden tilgjengelig, men disse systemene kan være uoverkommelig dyrt. I tillegg er disse systemene avhengige av klare gulv eller i noen tilfeller, tredemøller, som begge endrer naturlige bevegelser. Tredemøller har vist å maskere motor underskudd i noen sykdom modeller9, mens klare gulv (figur 1B) fører til mus å bruke mer tid på omkretsen av et åpent felt, indikerer økt angst10. Ideelt sett ville en gange analyseapparater ikke stole på heller, produsere de mest naturlige bevegelse mønstre med minst stress til dyret.
Anvendelig åpen-kilde og reklamen valgmulighetene bruk en variasjon av metoder å seire over vanskelighetene av isolere en footprint fra det dyrene ' kropp til tross for variabel lighter vilkårene, dyr fargen, og avtrykk former. Noen forsterke kontrasten av kontakter paws bruker overflater som slipper lys som svar på trykk7,11,12, men disse er dyre og teknisk vanskelig å konstruere. Andre systemer utnytte flere visninger vinkler som tillater observasjon av hele kroppen koordinering8,13. Selv om disse alternativene gir fordeler for å måle ekstra motor parametre utover gange, er de unødvendig komplisert for enkel gange analyse. Videre er alle disse teknikkene avhengige av klare gulv, som endrer naturlig atferd.
Narrestreker er basert på det vi kaller kontrast forbedrede innspillinger, som bruker en kombinasjon av belysning og en delvis gjennomsiktig gulv for å forbedre påvisning av utskrifter. Sett fra nedenfor, dette skaper en høykontrastbilde (Paw print) mens skjule visningen av objekter som ikke er i kontakt med overflaten (dyrets kropp) (figur 1d). Sett ovenfra, vises gulvet ugjennomsiktig. Den resulterende salience av poter i vår metode tillater nøyaktig identifisering av en rekke gange og Locomotor egenskaper av vårt nyutviklede automatiserte system. I denne studien beskriver vi apparater, vår gange analyse protokoll, og vårt automatiserte scoring system, narrestreker. Vårt apparat er lett monteres og narrestreker kan brukes til å vurdere motor underskudd i et bredt spekter av sykdom og skade modeller.
For å demonstrere at narrestreker kan brukes til å oppdage unormale gange mønstre, brukte vi en haloperidol modell av PD, en enkel modell for forbigående induksjon av Locomotor endringer14. Haloperidol er en dopamin reseptor motstander mye brukt som en antipsykotiske1. Det påvirker motor systemer ved å endre dopamin signalering i striatum, en viktig komponent i motoren veien i basal ganglia14. Selv en enkelt dose haloperidol raskt reduserer ekstracellulære dopamin nivåer i striatum, forårsaker Parkinsonspasienter-lignende motor defecits15. De atferdsmessige effektene er muskelstivhet, akinesi, og catalepsy, som er definert som en manglende evne til å gå tilbake til en normal holdning etter å ha blitt plassert i en uvanlig posisjon11,16. Akutte doser av haloperidol forårsaker Locomotor underskudd som identifiseres i rotarod test av motorisk funksjon17. Vi begrunnet at haloperidol-mediert Locomotor nedskrivninger vil også være tydelig i en rekke egenskaper tilgjengelig for automatiserte gange analyse.
Selv om responsen på haloperidol varierer mye på tvers av studier, cataleptic effekter av haloperidol oppstår ved doser på 0,5 mg/kg og høyere, mens redusert respons og motorisk svekkelse er synlig ved lavere doser (0,1-0,3 mg/kg)16, 17. i et forsøk på å unngå de cataleptic virkningene av haloperidol, bestemte vi oss for å teste to doser haloperidol: en høy dose (0,30 mg/kg) og en lav dose (0,15 mg/kg). Som vist i tabell 1undersøkte eksperiment 1 effekten av høy dose haloperidol, mens eksperiment 2 testet effekten av lav dose haloperidol. Vi brukte en innen-faget design der hver rotte ble testet i høy dose, lav dose, og kontroll (saltvann) forhold. Rekkefølgen på tilstanden ble balansert på tvers av rotter. Vi spådde at akutt administrering av haloperidol ville forårsake gange nedskrivninger som ligner på de som finnes i andre modeller av PD som redusert hastighet, redusert skrittlengde, og lengre holdning varighet3,14,18 ,19. Vi observerte atferdsendringer inkludert akinesi etter haloperidol administrasjon ved begge doser. Inne det lav dose forfatning, rotter fikk viktig forhøyet holdning varigheten og hind pote kontaktområde, som forventet. Disse gange endringene er sammenlignbare med den langsomme, stokke trinn vanlig blant PD pasienter2,20. I den høye dose tilstand, men vi så en økning i skrittlengde, samt en økning i labben kontaktområdet. Selv om økningen i skrittlengde var uventet, viste ytterligere gjennomgang av litteraturen at det sannsynligvis er en del av et haloperidol-indusert svar som unnslipper. Vi konkluderer med at narrestreker er faktisk i stand til å oppdage Parkinsonspasienter-lignende endringer i gnager gange i samsvar med bruk av nevroleptika.
Protocol
Alle prosedyrer var i samsvar med Brown University institusjonelle Animal Care og use Committee retningslinjer.
1. analyseapparat for gange
- Forbered gange analyse gangvei bestående av en klar plexiglass lukket gangvei (36 "L x 3" W x 4,5 "H) plassert på et klart plexiglass gulv (figur 2a). Gjør plexiglass gulvet delvis gjennomsiktig ved å dekke det med et stykke av 16 LB bomull fiber utkast velin kuttet til samme bredde som gangvei.
Merk: det finnes andre metoder for å gjøre gulvet delvis gjennomsiktig. - Plasser et kamera med en bildefrekvens på minst 30 bilder per sekund (FPS) rett under gangvei for å fange midten av sporet (figur 2b).
- Sikre en stripe av 12 V LED-lys med 18 lysdioder/fot ca 2 inches unna og 1 tomme over gulvet på gangvei for å belyse sporet.
2. forberedelse til dyr
- La dyrene acclimate til vivarium i minst 1 uke før håndtering. Hånd rottene for det vil si 5 dager tidligere for begynnelse eksperiment. Denne studien brukte 8 mannlige Long Evans rotter ca 3 måneder gammel.
-
Venne dyrene til testrommet og gangvei med rommet lysene slått av
- Sted rotta ' hjem bur for overflaten plan flate på slutten av det gange gangvei å tjene som en mål bokse med. Note det hvis hjemmet bur er dyp, gammel eller Locomotor-svekket rotter kanskje høste fordel av en ramp eller steg å skaffe lettere adgang å hjemmet bur.
- Tillate rotta å gå fra det eksperimentator ' hånd ned lengden av det gangvei å rekkevidde dens hjem bur.
- Rotter ville ofte opphøre bak i det gangvei å blikk i nærheten tidligere springer ned inn i hjem bur. Hvis en rotten tar lengere enn 1 min å utgangen det gangvei, oppmuntre den å gå inn dens hjem bur med en mild presse.
- Hvis rotta dreier i nærheten, bruk en liten stykke plexiglass å hindre det "starte" enden på det gangvei. Gjenta for totalt 3 runs.
- Venne for det vil si 2 dager eller til rottene er behagelig overgang det gangvei med ett fast skritt uten fryser.
tredje gange testing prosedyre
- Juster innstillingene på webkamera programvaren for å oppnå det klareste bildet av labb utskrifter. Slå av rommet lys for alle gange testing.
- Ta opp hver kjøre separat og etiketten hensiktsmessig for bruk med automatiserte analyseprogrammet.
- Sørg for at det ikke er flekker eller rusk på velin. Starte innspillingen et par sekunder tidligere rotta går inn i gangvei og opphøre en gang rotta utgangen det gangvei og går dens hjem bur.
- Fortsett til enten tre akseptable kjøringer er fullført eller 10 minutter er utløpt.
- Tørk ned gangvei med etanol i mellom hver rotte og erstatte velin etter behov.
Merk: en akseptabel prøve er definert som en der dyret går konsekvent og uten pause for de første 4 trinn av kjøringen. Hvis dette er vanskelig å oppnå, kan du justere kriteriene for å inkludere forsøk der det er 4 påfølgende trinn på et hvilket som helst punkt i kjøringen som skjer uten pauser eller brå akselerasjon.
4. narrestreker automatisert analyse
- Sett alle videoer som skal analyseres i en mappe.
- Launch narrestreker ved å kjøre Python-skriptet narrestreker. Narrestreker vil analysere videoene basert på trinnene illustrert i Figur 3 og Figur 4.
- I hurtigmenyen velger du den angitte mappen ved å trykke på knappen Velg en mappe . Velg egendefinerte alternativer for analyse hvis du ønsker det. Du finner detaljerte beskrivelser av hver parameter ved å klikke på spørsmålstegnet ved siden av dem. Klikk Fortsett når du er ferdig.
- Definer en region av interesse (ROI) på bildet av gangvei som vises. For å gjøre dette, venstre klikk for å definere en øvre kant og høyreklikk for å definere en nedre kant. Hvis boksen som vises, er riktig, trykker du N for å fortsette. Hvis ikke, trykker du på Z for å angre. Når N er trykket, vil programmet kjøres automatisk.
- Når narrestreker er fullført, avslutter du programmet ved å trykke på Enter i terminalen.
- For å manuelt se resultatene output av narrestreker, Kjør Python-skriptet GaitEditorGUI og velg riktig. MP4-fil for hver video. Hvis det er nødvendig, korrigerer du eventuelle feil identifiserte eller flettede utskrifter.
- For å trekke ut romlige og timelige gange parametere, kjører du Python-skriptet ParameterAnalyzer. Velg antall bak bilder som skal analyseres, og mappen med videoer som skal analyseres, og klikk deretter på Fortsett. Dette vil sende ut en CSV-fil for hver video som inneholder en rekke vanlige gange parametre, som er beskrevet i tabell 2 og illustrert i figur 5.
Merk: den fullstendige skript, samt instruksjoner for å lese og analysere data, er tilgjengelig på forfatterens GitHub (www.github.com/hayleybounds). Vi implementerte denne algoritmen ved hjelp av gratis, åpen kildekode Python-biblioteket OpenCV21. Også inkludert på GitHub er instruksjoner for å bygge vår gange analyse gangvei.
Representative Results
Haloperidol prosedyre
Vi bebygget denne gange analysesystem å sammenligne gange parameterene inne administrere rotter å dem inne eksperimentelle rotter ventet å viser en variasjon av Locomotor, gange, og balanse nedsatt. Vi brukte en innen-faget design der hver rotte ble testet i saltvann, høy dose haloperidol og lav dose haloperidol forhold. Rotter ble delt inn i to grupper (A og B) for å tillate counterbalancing; gang testing var balansert for tid på dagen og rekkefølge av tilstand. Hver test var adskilt av 48 h. rotter var lett anesthetized med isoflurane tidligere mottar intraperitoneal (IP) injeksjoner av enten den ene eller den andre av saltvann eller haloperidol. Gange ble testet 1 h post-injeksjon, noe som peker haloperidol bør være på toppnivå15,16,17.
Atferds resultater
Vi observerte fremtredende atferdsendringer hos dyr som ble behandlet med haloperidol. I den høye dose tilstand, fem av de åtte rotter hadde perioder med immobilitet ved starten av gangvei, der de var ikke svarer til eksperimentator berøre dem og motstandsdyktig mot å bli flyttet. Inne noe sakene, denne begrunne holdt for adskillige minuttene til rotta var fjernet fra det gangvei. I andre tilfeller vil Immobile rotte plutselig bevege seg raskt eller "bundet" over gangvei og deretter gå tilbake til Immobile staten nær slutten. Inne det lav dose forfatning, 3 av det 8 rotter fikk lignende perioder av immobilitet. På denne doseringen var det bare én forekomst av bindings atferd. Ingen bindings ble observert da dyrene ble behandlet med saltvann.
Vi analyserte effekten av haloperidol på følgende gang parametre: base for støtte, skrittlengde, skritt hastighet, holdning varighet, holdning til swing ratio, maksimal kontaktområde, og interlimb avstand. Fordi mange gang parametre for front og bakbeina er identiske og haloperidol generelt har ensartede virkninger på alle lemmer, beregnet vi parametre for bare bakbena og ikke separate data for venstre og høyre lemmer. For hver rotte, beregnet vi gjennomsnittet av hver gang parameter fra alle brukbare går fra hver test dag. Alle parametre (annet enn hastighets variasjon) ble beregnet som gjennomsnittet for de 4 første brukbare trinnene i en løpetur. For å vurdere om hver dosering av haloperidol betydelig påvirket gange, brukte vi en sammenkoblet sample t-test. I eksperiment 1 var det en betydelig økning i skrittlengden (figur 6a; t (7) =-2,962, p = 0,021) og maksimal kontaktflate (figur 6a; t (7) =-2,51, p = 0,04) hos dyr behandlet med høy dose haloperidol. Base for støtte, hastighet, holdning varighet og holdning til swing ratio var ikke signifikant. I eksperiment 2 viste dyr som fikk lav dose haloperidol en signifikant økning i holdning varighet (figur 6b; t (7) =-2,444, p = 0,044) og maksimal kontaktområde (figur 6b; t (7) =-3,085, p = 0,018) sammenlignet med saltvann tilstand. Ingen andre gange parametre var betydelig. I tillegg var det en signifikant forskjell mellom den høye dosen og lav dose haloperidol forhold i base av støtte (figur 6C; t (7) = 2,651, p = 0,033), maksimal kontaktområde (figur 6C; t (7) = 4,635, p = 0,002) og interlimb avstand ( Figur 6C; t (7) = 3,098, p = 0,017).
Din posisjonsnøyaktighet og feil i det automatiserte systemet
For å vurdere nøyaktigheten av narrestreker, sammenlignet vi den automatiserte analysen til manuell scoring av 21 tilfeldig utvalgte videoer fra en egen gruppe på 6 kontroll rotter. For hånd scoring formål, videoene ble konvertert til en sekvens av bilder, som deretter ble brukt til å manuelt markere plasseringen av utskrifter. For effektivitet, fokuserte vi vår analyse på romlige data målt fra hind utskrifter bare. Vi hentet gjennomsnittlig skrittlengde og BOS for hver video og sammenlignet den med automatiserte verdier. Mens gjennomsnittlig skrittlengde ikke var signifikant forskjellig mellom manuell scoring og narrestreker analyse (figur 7b; t (20) =-0,01, p = 0,99), var base for støtte signifikant (figur 7a; t (20) =-2,21, p = 0,038). Selv om den automatiserte og manuelle scoring var generelt godt korrelert, rapporterte det automatiserte systemet en 5% større BOS i gjennomsnitt. Denne forskjellen kan skyldes avvik i centroid utvalg i stedet for å oppdage feil. For manuell scoring, var utskrifts plasseringen merket tegne en oval rundt bunnen av hver hind print, som det ville være vanskelig å manuelt gjenskape narrestreker metode for sentrum av massen estimering. Den klare trenden var for narrestreker å overvurdere BOS, kanskje fordi noen dyr kan splay sine tær ut på en asymmetrisk måte, forårsaker narrestreker å observere mer ekstreme centroids enn manuell scoring. Andre systemer har også bemerket betydelige økninger i BOS mellom manuell og automatisert scoring til tross for konsistent skrittlengde måler17. Tatt i betraktning de små forskjellene observert og konsistens med andre systemer, konkluderer vi at narrestreker er et pålitelig mål på gange parametere.
Det er viktig å merke seg at all nøyaktighet analyse skjedde etter manuell korreksjon av automatiserte produksjonen ble utført ved hjelp narrestreker ' s GUI. Som i eksisterende kommersielle systemer, er dette trinnet nødvendig både for å korrigere feil i scoring og for å eliminere kjøringer som ikke oppfyller kriteriene22. Vi innstilt narrestreker å feile på side av false positiv, idet disse er lettere å korrekt post-hoc. Vi har aldri observert narrestreker ikke klarer å oppdage en ekte ut under manuell korreksjon av over 500 videoer. Andre typer feil ble imidlertid observert. Disse falt i 3 kategorier: falske oppdagelser (påvisning av en ikke-print som en utskrift), misclassifications (Print feilmerket som front/hind eller venstre/høyre), og falske kombinasjoner (to utskrifter feilaktig fusjonert). Disse feilene er lett korrigeres i den med følgende GUI, og vanligvis forekommer i bare en liten prosentandel av videoer filmet under normale forhold. Selv med slike rettelser, narrestreker markant reduserer mengden manuell arbeidskraft involvert i gang analyse. Vi anslår at for hver video tar det ca 3 min til å kjøre narrestreker og korrigere eventuelle output feil (om nødvendig), mens det ville ta nesten 10 min å manuelt score og analysere den samme videoen.
Figur 1. Sammenligning av metoder for gange analyse. (A) den tradisjonelle blekk og papir metoden produserer unøyaktige utskrifter av pote form og plassering. (B) video opptak med gjennomsiktig gulv gir en detaljert visning av labb utskrifter, men inneholder mange fremtredende funksjoner fra rotte kroppen som kompliserer automatisert scoring. (C) lett papir over en klar etasje skaper et støyende bilde og mister detaljer. (D) bruk av velin for å skape et gjennomskinnelig gulv produserer svært detaljerte utskrifter mens visuelt eliminere kroppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk illustrasjon av gange apparat og videoopptak. (A) rotta går gjennom en klar gangvei med et gjennomskinnelig gulv til hjemmet buret målet boksen mens registreres fra nedenfor. I dette tilfellet dekker velin et gjennomsiktig gulv for å gjøre det gjennomskinnelig. Gangvei er opplyst av LED strimler plassert langs dens lengde på et nivå mellom dyrets føtter og kropp. (B) et skjermbilde av en videoopptak demonstrere virkningene av gjennomskinnelig gulvet. To paws er klare synlig, bortsett fra rotta ' kropp er i all vesentlighet undetectable. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Oppdagelsen forarbeide for ettall rammen av en pote avtrykk. (A) det opprinnelige bildet er de-noised og deretter utsatt for bakgrunn subtraksjon (B). (C) en kant gjenkjennings algoritme brukes, og resultatene konverteres til en serie med X-, Y-koordinater kalt konturer (D). (E) konturer er gruppert etter nærhet og det konvekse skroget (markeringsrammen) til gruppen er tatt for å produsere en enkelt kontur som omfatter utskriften. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Konvertering av individuelle oppdagelser til et klassifisert trykk. (A) Paw utskrifter er først identifisert i et sett med rammer. (B) individuelle objekt påvisning gis et tall som identifiserer dem som en utskrift, som representerer en enkelt plassering av en labb (C). (D) til slutt, de er hemmelig idet igjen eller rett basert på deres plasseringen i forhold til midtlinjen av det dyrene ' sti, og forside eller bakben basert på deres plasseringen i forhold til gårsdagen pote Printer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Illustrasjon av gange parametere analysert. (A) et eksempel utgang som viser identifisering og plassering av labb utskrifter. Original oppdagede kanter vises i svart. Final oppdaget paws og omtrentlig område er vist i farger som indikerer labb klassifisering. I dette tallet, gul: foran til venstre, grønn: hind venstre, cyan: foran til høyre, og magenta: hind høyre. Imidlertid kan fargene endres i Python-skriptet i henhold til brukerens preferanser. (B) et plott som illustrerer to store timelige parametre: hvor lenge hver labb er i kontakt med bakken (holdning fase) og i luften (swing fase). Fargede blokker indikerer holdning fase og de hvite mellomrommene indikere sving fasen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Effekter av haloperidol på gange. (A) resultater av eksperiment 1: høy dose haloperidol (HALH) betydelig økt skrittlengde og maksimal kontaktområde i forhold til saltvann tilstand (sal). (B) eksperiment 2 resulterte i mer typiske Parkinsonspasienter symptomer; lav dose haloperidol (HALL) betydelig økt holdning varighet og maksimal kontaktområde. (C) ved sammenligning av haloperidol behandlet forhold fra begge eksperimenter, høy dose haloperidol økt base for støtte, maksimal kontaktområde og interlimb avstand sammenlignet med lav dose tilstand. Data er betyr ± SEM, n = 8. Parede prøvene t-test forskjellene var som følger: # p < 0,05, # # p < 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Nøyaktigheten av automatisert analyse. (A) det automatiserte systemet avviker vesentlig fra manuell scoring ved måling av BIM, men dette kan skyldes variasjoner i manuell centroid utvalg i stedet for deteksjons feil. (B) det automatiserte systemet er ikke signifikant forskjellig fra manuell scoring for skrittlengde. Disse nøyaktighets resultatene samsvarer med de fra andre tilgjengelige systemer. Data er betyr ± SEM, n = 21. Parede prøver t-test forskjeller var som følger: # p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Sammenligning av timelige parametre. Temporal gange mønstre for et dyr behandlet med saltvann (A) og lav dose haloperidol (B). (C) en illustrasjon av det oppkvikkende-Escape respons fra en rotte gitt høy dose haloperidol. Som i figur 5, fargede blokker indikerer når labben var i kontakt med bakken (holdning fase) og den hvite mellomrom indikere når labben var i luften (swing fase). Forkortelser: FL, foran til venstre; HL, hind venstre; Fr, foran til høyre; HR, hind høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperiment 1 | Eksperiment 2 | |||||||
| Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Test 6 | Test 7 | Test 8 | |
| Gruppe A | HALH | Sal | HALH | Sal | Sal | HALL | Sal | HALL |
| Gruppe B | Sal | HALH | Sal | HALH | HALL | Sal | HALL | Sal |
Tabell 1. Eksperimentell design. Denne tabellen illustrerer den eksperimentelle designen som brukes i denne studien. Vi anvendt en innen-motiv tegning i hvilket enhver rotten var testet inne det høy dose haloperidol (HALH), lav dose Haloperidol (HALL) og Saline (sal) vilkårene. Rotter var delt i to grupper; testing var balansert for tid på dagen og rekkefølgen på tilstanden.
| Parameteren | Definisjon |
| Skrittlengde | Avstand mellom etterfølgende kontakter av samme labb |
| Trinn lengde | Avstand mellom etterfølgende kontakter av kontralateral foran eller bak paws langs aksen av bevegelsesretningen |
| Støtte Base (BOS) | Avstand mellom påfølgende kontralateral foran eller bak poter, vinkelrett på aksen i bevegelsesretningen |
| Maksimalt kontaktområde | Det maksimale oppdagede området på et |
| Interlimb avstand | Avstand mellom ipsilateral front og bakben |
| Holdning varighet | Hvor lang tid en labb var i kontakt med bakken |
| Sving varighet | Hvor lenge en labb ikke var på bakken |
| Holdning til swing ratio (SSR) | Holdning varighet/sving varighet |
| Diskret hastighet | Stride lengde/(holdning varighet + sving varighet) for en labb |
| Gjennomsnittlig hastighet | Gjennomsnitt av diskrete hastigheter i perioden som brukes i analysen |
| Variasjoner i hastighet | Prosentvis endring i diskrete hastigheter under en kjøring |
| Kjør hastighet | Tid for å krysse tunnelen/lengden av tunnelen |
Tabell 2. Beskrivelse av parametere for gange. Denne tabellen beskriver de mest brukte gange parametrene. de som brukes i denne studien er angitt i fet skrift.
Discussion
I denne studien, testet vi narrestreker, en ny automatisert gange analysesystem som utnytter kontrast forbedret videoer produsert ved hjelp av et gjennomskinnelig gulv for å skjule dyrets kropp og å gi klart definerte labb utskrifter for enkel automatisert deteksjon. Narrestreker nøyaktig identifiserer labb utskrifter og er følsom for endringer i motorisk funksjon. Vi brukte narrestreker til å vurdere gange endringer i en akutt haloperidol modell av PD. Selv om haloperidol ikke induserer forventet motor underskudd av en robust PD-modell, var vi likevel i stand til å demonstrere at narrestreker kan nøyaktig oppdage endringer i gange mønstre. Til slutt, kvantifisert vi nøyaktigheten av narrestreker og demonstrerte at målingen av nøkkelen gange parametere kan sammenlignes med manuell scoring.
I begge haloperidol behandlet forhold, observerte vi en høy forekomst av frysing atferd (akinesi) etterfulgt av en flukt respons på løping eller hoppende fremover. Mens akinesi har blitt observert ved en tilsvarende dose (0,25 mg/kg) i flere studier16,23, denne bindings atferd er ikke forenlig med typiske Parkinsonspasienter symptomer3,14,19, 24. Interessant, fant vi at høy dose haloperidol behandling resulterte i betydelig økt skrittlengde. Dette funnet var i utgangspunktet overraskende fordi andre haloperidol modeller av PD har vist en nedgang i skrittlengde3,19. Men de gir mening i lys av "oppkvikkende-Escape" atferd mønster beskrevet av de Ryck et al. (1980), som rapporterte at rotter løpe å flykte etter akinetiko perioder, og at høyhastighets gaits som løping og hoppende er forbundet med økt skrittlengde lengde4,25 (figur 8c). Høy dose behandling resulterte også i betydelig økt maksimal kontaktområde av bakbena. Lav dose haloperidol behandling resulterte i mer karakteristiske PD gange endringer inkludert en betydelig økning i holdning varighet og maksimal kontaktområde (figur 8a-B). Disse resultatene kan være en refleksjon av muskelstivhet forbundet med haloperidol-indusert akinesi.
Til tross for uvanlig oppkvikkende-Escape atferd, var vi i stand til å demonstrere at narrestreker kan faktisk oppdage endringer i gange. Vi viste at i riktig lysforhold, kan et gjennomskinnelig gulv produsere en svært kontrast og detaljert bilde av poter. I denne studien, gjorde vi et gjennomsiktig gulv gjennomskinnelig ved å dekke det med velin. Den samme effekten kan oppnås ved å plassere en annen gjennomskinnelig dekker, slik som mylar, over et gjennomsiktig gulv. Alternativt kan gulvet i seg selv være gjennomskinnelig ved hjelp, for eksempel, frostet plexiglass. Den gjennomsiktige gulv og enkel plexiglass gangvei er billig og kan konstrueres i en ettermiddag. Vårt kontroll BAS ert analysesystem er motstandsdyktig mot mange variasjoner i apparatet og tilbyr justerbare terskler for å tilpasse systemet til forskjellige oppsett, sykdoms modeller eller mindre dyr som mus.
Enkelte parameter analyser for gange ble endret fra konvensjonelle formler på grunn av aspekter ved gangvei. For eksempel er vår metode for å beregne hastighet forskjellig fra andre gange studier; gjennomskinnelig gulv kombinert med LED-belysning tilslører visningen av kroppen, så det er ikke mulig å spore kroppens posisjon til å beregne hastigheten som er vanligvis gjøres. For denne studien, ble hastigheten beregnes ved å dele avstanden reist mellom to kontakter av samme labb av tiden fra første kontakt til andre kontakt. Selvfølgelig kan andre formler brukes. For eksempel, hvis et samlet mål på hastighet er nødvendig, kan man dele avstanden fra gjennomsnittet av fire steder på begynnelsen og slutten av kjøringen av varigheten av kjøringen.
Vår analyse bekrefter at, selv om den ikke er identisk med manuell scoring, utfører vårt automatiserte system med høy nøyaktighet og genererer pålitelige tiltak for gange. Apparatet som beskrives her, var optimalisert for en enkel, lavkostnads analyse av motorisk funksjon. Imidlertid kan flere endringer gjøres som ville utvide nytten av narrestreker. En begrensning av vårt system er at den delvis gjennomsiktige gulvet, samtidig som utmerket labb deteksjon, tilslører dyrenes kroppen aksen. Selv om vi ikke har funnet det nødvendig, kan dette løses ved å legge en overhead kamera til systemet. En annen forbedring vil være bruk av et videokamera med en høyere bildefrekvens. Mens vi var i stand til å oppnå konsistente anslag over timelige parametre, er nøyaktigheten av disse tiltakene kompromittert på bildefrekvenser under 100 fps8. Legge til en høyhastighets videokamera ville kreve ingen endring av analyseprogramvare samtidig øke nøyaktigheten og presisjonen av timelige tiltak. I tillegg bruker flere andre gange systemer et speil for å samtidig ta opp lateral og ventrale utsikt over Rat2,8,13. Legge denne funksjonen til vårt apparat ville tillate mer nøyaktig kvantifisering av hastighet og bedre observasjon av atferd under går.
I denne studien, viste vi at bruk av et delvis gjennomsiktig gulv effektivt isolerer labb utskrifter ved å blokkere synligheten av objekter som ikke er i kontakt med gangvei gulvet. Vi bebygget en automatisert scoring system det utnytter denne høy kontrasten pote avtrykk å akkurat identifisere paws. Vi viste at dette systemet, narrestreker, kvantifisert gange parametere med en nøyaktighet sammenlignes med kommersielle systemer. Vi bestemte at administrering av en høy dose med haloperidol økte skrittlengde og maksimal kontaktområde sammenlignet med saltvann. Selv om denne endringen er det motsatte av det vi forventet, tyder det på en nærmere gjennomgang av eksisterende litteratur at det sannsynligvis er en del av flukt atferden som ble observert som svar på akutt administrering av haloperidol. Lav dose haloperidol behandling resulterte i mer typiske PD symptomer som økt holdning varighet og maksimal kontaktområde. Vi konkluderer med at når akutt høy dose haloperidol administrasjon er en dårlig modell for å studere gange nedsatt i forbindelse med PD, vår studie viste likevel evne til narrestreker å nøyaktig oppdage endringer i motorisk funksjon. I fremtiden håper vi å ytterligere validere narrestreker ved å studere Locomotor endringer i andre sykdoms modeller.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Carney Institute for Brain Science ved Brown University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
|
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
|
| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
|
| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
|
| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
|
| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Williams, M. T., et al. Kaolin-induced ventriculomegaly at weaning produces long-term learning, memory, and motor deficits in rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 35, 7-15 (2014).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Pereira, J. E., et al. A comparison analysis of hindlimb kinematics during overground and treadmill locomotion in rats. Behavioural Brain Research. 172 (2), 212-218 (2006).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Márka, Z., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (50), (2015).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson’s disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
- Kulkarni, S. K., Bishnoi, M., Chopra, K. In vivo microdialysis studies of striatal level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian Journal of Experimental Biology. 47 (2), 91-97 (2009).
- Jain, N. S., Tandi, L., Verma, L. Contribution of the central histaminergic transmission in the cataleptic and neuroleptic effects of haloperidol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 139 (Part A), 59-66 (2015).
- Steinpreis, R. E., Anders, K. A., Branda, E. M., Kruschel, C. K. The Effects of Atypical Antipsychotics and Phencyclidine (PCP) on Rotorod Performance. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 63 (3), 387-394 (1999).
- Baptista, P. P. A., et al. Physical exercise down-regulated locomotor side effects induced by haloperidol treatment in Wistar rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 104, 113-118 (2013).
- Chuang, C. S., Su, H. L., Cheng, F. C., Hsu, S., Chuang, C. F., Liu, C. S. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17 (9), (2010).
- Bugalho, P., Alves, L., Miguel, R. Gait dysfunction in Parkinson’s disease and normal pressure hydrocephalus: a comparative study. Journal of Neural Transmission. 120 (8), 1201-1207 (2013).
- Bradski, G. The OpenCV Library. , (2000).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- De Ryck, M., Hruska, R. E., Silbergeld, E. K. Estrogen and haloperidol-induced versus handling-related catalepsy in male rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 17 (5), 1027-1035 (1982).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic Characterization of Speed-Associated Gait Changes in Mice Reveals Modular Organization of Locomotor Networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms. Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).
