Summary
Bu protokol, hücreleri hareketsiz etmek için aljinat hızlı fiziksel jelleşme tarafından bir hücre kapsülleme yöntemi gösterilmektedir. Elde edilen mikroboncuk zaman içinde amiloid-β kontrollü ve sürekli salgılanmasını sağlar ve salgılanan amiloid-β in vitro ve in vivo modellerde etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Amiloid Cascade hipotezi uyarınca, Alzheimer hastalığının (AD) gelişiminde en erken tetikleyici, zehirli amiloid-β (Aβ) parçaların birikimidir, sonunda hastalığın klasik özelliklerine yol açan: amiloid plaklar, neurofibriller Tangles ve sinaptik ve nöronal kayıp. Hastalık ilerlemesini yansıtan ilgili olmayan transjenik preklinik modellerin eksikliği etkili ilaç tedavilerinin keşfi engelleyen ana faktörlerden biridir. Bu amaçla, kronik Aβ üretiminin etkilerini incelemek için yararlı amiloid salgıcı hücreleri içeren alginat mikroboncuk imalatı için bir protokol geliştirdik.
Bu çalışmada, daha önce bir insan APP geni ile nakledilen Çin hamster yumurtlama hücreleri, Aβ (örneğin, 7PA2 hücreleri) salgıyla kullanıldı. Aβ sürekli salınımı için üç boyutlu (3D) in vitro model Alginate 7PA2 hücrelerin kapsülleme tarafından imal edilmiştir. Bu süreç, 500-600 μm ' lik bir boncuk çapını hedef almak için optimize edilmiştir. Alginat içinde 7PA2 hücreli kapsülleme optimizasyonu üretim parametrelerini değiştirerek gerçekleştirildi, örneğin, alginat konsantrasyonu, jel debi, elektrostatik potansiyel, kafa titreşim frekansı, jelleşme çözeltisi. Salgılanmış Aβ seviyeleri zaman içinde analiz edildi ve alginat boncuk ve standart hücre kültürü yöntemleri arasında karşılaştırıldığında (kadar 96 h).
1,5 x 106 7pa2 hücreler/ml ve bir aljinat konsantrasyonu 2% (w/v) HEPES ile tamponlu ve sonraki gelasyon 0,5 M kalsiyum klorür 5 dakika için en istikrarlı mikroboncuk imal bulunmuştur. Fabrikasyon mikroboncuk 1) üniforma boyutu, 2) 550 μm, 3) ortalama çapı ile yaklaşık 100-150 hücre başına mikroboncuk ve 4) Aβ salgılayabilecektir içerir.
Sonuç olarak, amiloid üreten 7PA2 hücrelerini içeren istikrarlı aljinat mikroboncuk üretimi için optimize edilmiş yöntemimiz, hem in vitro hem de in vivo olarak AD 'nin önemli yönlerini modellemede olanaklı hale gelebilir.
Introduction
Nörodejeneratif hastalığın modelleme beynin kompleks ve karmaşık doğası nedeniyle zordur. Alzheimer hastalığı (AD), sinaptik fonksiyon ve nöronların ölüm Progressive kaybı sürekli aşırı üretim ve amiloid Beta (Aβ) peptidler, amiloid öncüsü anormal işlenmesi sonrasında birikiminin bir aşağı etkisi olduğuna inanılmaktadır proteini (APP) amiloid basamaklama hipotezi1' e göre.
Bu amiloid kaynaklı patolojinin mekanizmalarını anlamak ve yeni tedavi hedeflerini tanımlamanıza yardımcı olmak için bilim adamları çeşitli in vivo Preklinik modeller geliştirmişlerdir. Modellerin bir kategori sıçan beyin içine sentetik Aβ peptid bir bolus enjeksiyon kullanır2,3,4. Bu tür modellerin ana sınırlama, tek bir kerede tüm yatırılan yüksek konsantrasyonlarda Aβ peptidler ile sadece bir nokta veya tekrarlanan tedaviler güveniyor olmasıdır. Bu hastalık5Aβ salınımı kronik, sürekli doğası ile tutarsız. İn vivo modellerinin başka bir kategorisi, hastalığın ailesel varyasyonları ile bağlantılı bir veya daha fazla genetik mutasyonları ifade eden transgenik hayvan modelleridir6,7,8,9, 10. ancak, ailesel ad sadece daha az için hesaplar beri 5% tüm Alzheimer vakalarının11, Insanlarda sporadik ad tercüme bu modellerin alaka sorgulanabilir12. Transgenik yaklaşımın bir başka dezavantajı da, hastaların 12 ' inde sporadik AD 'de hastalığın ilerlemesini andıran bilişsel fonksiyon ve patolojik değişikliklerle çok hızlı ve agresif biçimde eksiklik haline gelen hızlandırılmış Aβ oluşumudur. . Örneğin, 5x FAD modeli 1,5 ay13kadar az plaklar üretir.
İlginç bir şekilde, her iki kategoride de reklam araştırma2,3,4,5,6alaka bilişsel fonksiyon değişiklikleri neden ve bazen onlar eşliğinde amiloid plaklar6,8, Tau fosforilasyon6,7 ve/veya sinaptik ve nöronal kayıp gibi hastalığın patolojik damgalar görünümü7,9, 14oldu. Ancak bu tür modeller bize genellikle AD sonraki aşamalarını ile ilişkili beyin, amiloid yüksek düzeylerde etkileri içine bir fikir verebilir iken, onlar Aβ kronik ve sürekli pozlama yanıt olarak sergilenen önceki değişiklikleri yansıtmak için başarısız peptit12, sinaptik işaretçileri değiştirilmiş ifade gibi15 ve bileşenler içi matris16. Bu nedenle, hala bir kronik model oluşturmak için bir ihtiyaç daha doğru bir şekilde sürekli Aβ salgısı in vivo biliş üzerinde etkilerini göstermektedir ve patolojide değişiklikler göstermektedir kalır.
Bu amaçla, biz, daha sonra model yönlerini yetişkin sıçan beyin içinde implante edilebilir hidrojel mikroboncuk içinde amiloid-salgıcı hücreleri immobilizing tarafından kontrollü bir şekilde Aβ sürekli, sürekli salgılanmasını sağlayan bir sistem geliştirdik , sporadik AD.
Alginate, biyolojik olarak uyumlu olduğu için seçilen biyomateryal oldu ve içinde vivo17implante herhangi bir olumsuz tepkiler vermez. Alginat Hidrojeller hücre kapsülleme iyi son dört yıl içinde kurulmuştur. Kliniğe çevirisinin ilk örneği tip 1 Diabetes mellitus17tedavisinde bildirilmiştir. Langerhans izletlerinin başarılı kapsülleme ilk raporu 1980 için geri tarih. İnsülin salgıcı hücreleri içeren mikrobilyeleri transplantasyon Diyabetik hastalar için tedavi seçenekleri devrim pankreas fonksiyon restore olarak, insülin enjeksiyon tedavisi için ihtiyaç ortadan kaldırılması18. Bu çalışmalar hücre kapsülleme onları dış stresden nasıl koruyabilirsiniz hakkında rapor, mekanik veya kimyasal olsun. Aslında, alginat boncuklar bir bariyer olarak hareket ve çevre ortamlarından onların fenotipi koruyarak hücreleri izole, besinleri ve hücresel yan ürünler19temizlenmesi için çevredeki medya için yeterli erişim sağlayan iken. Dahası, aljinat kullanımı yumuşak doku mekanik özelliklerinin eşleşmesini sağlar20. Aljinat hidrogeller sadece alginat konsantrasyonu ve çapraz bağlama yoğunluğu20,21değişen tarafından, 1-30 kPa bir sertliği için ayarlanabilir. Bu temel bir yönü, sadece kapsüllü hücrelerin fenotipik ifade korumak için değil, aynı zamanda Engraftman in vivo sonra herhangi bir inflamatuar etkileri önlemek için22.
Bu protokolde, 7pa2 hücreleri-bir insan App V717F mutasyona uğramış gen23 ile stabil transfekte bir Çinli hamster yumurtalı hücre hattı-kullanılır. Bu hücreler, Aβ1-4224,25dahil olmak üzere uygulama katalitik ürünler sürekli üretmek ve preklinik, akut in vivo çalışmalar26sentetik üretime alternatif olarak Aβ üretmek için kullanılmıştır. Biz ' yumuşak ' alginat mikroboncuk içinde 7PA2 hücreleri immobilizing için bir imalat yöntemi tarif, biomolecules sürekli salgılanmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Kavram kanıtı olarak, biz zaman içinde Aβ1-42 peptid serbest bırakmak hakkında rapor. Kullanılan alginat, bir molekül ağırlığı, 120000-190000 g/mol ve 1,56 (M/G) guluronik oranı mannuronik bir düşük viskozite alginat olduğunu.
Daha fazla çalışmada, bu mikroboncuk güvenli bir şekilde AD (örneğin, hipokampus) ile alaka fare beyni bölgeleri içinde, kronik Aβ salgılanması davranışları üzerinde in vivo ve patoloji ex vivo etkilerini incelemek için nakledilebilir. Buna ek olarak, bu sistem in vitro ve ex vivo uygulamalarda kronik Aβ salınımı etkilerini incelemek için kullanılabilir. Örneğin, 7PA2 içeren alginat mikroboncuk, kronik Aβ pozlamasını AD ile ilişkili hücresel mekanizmaların etkilerini değerlendirmek için nöronal veya astrositik kültürlerle Co-kültürlü olabilir. Ayrıca bu yöntem, ex vivo elektrofizyolojisinde kronik Aβ üretimi ile uzun vadeli potansiyasyon arasındaki ilişkiyi incelemek için de kullanılabilir.
Bu protokolün vurgu, üretim yönteminin modülerlik ve esnekliğidir, bu da ince ayar üretim parametreleri ile alginat boncukların bir hedef boyut ile üretimlerini sağlar. Uygulamaya bağlı olarak, protokol mikroboncuk boyutu, kapsüllenmiş hücrelerin yoğunluğu ve mikroboncuk sertlik açısından ısmarlama hedefler elde etmek için ayarlanabilir. Bu protokol, çeşitli hücre türlerinin kapsüllenme için kullanılabilir, farklı patolojileri incelemek için daha alakalı üç boyutlu (3D) in vitro modelleri geliştirmek. Geçenlerde nasıl Alginate-kapsüllü hücreler kanser ilerlemesi erken aşamalarında model için kullanılabilir rapor20.
Kapsülleme sürecinin kavramı bir nozul aracılığıyla alginat çözeltisi içinde askıya alınan hücrelerin bir laminar Jet ekstrüzyon dayanmaktadır. Titreşimli bir kafa, aynı büyüklükte aljinat bazlı damlacıklar ile sonuçlanan kontrollü bir frekans ile Jet bozar. Harici bir elektrik alanı, kalsiyum iyonları gibi divalent iyonlarında zenginleştirilmiş bir çözelti ile temas ettiğinde, küresel şeklini koruyarak hızlı bir şekilde çapraz bağlantı kurabilen, oluşturulan aljinat bazlı damlacıklar ayrılması sağlar. Jelleşme çözeltisi içinde kuluçak homojen bir fiziksel hidrojel içinde hücreler içeren küresel mikroboncuk oluşumu sağlar27. Mikro boncuk ve alginat Hidrojeller hedef boyutu uzun süre (hafta) için hücre kültürü medya ile besins ve oksijen değişimi sağlar. Şekil 1 A kullanılan kapsülleme cihazının şematik bir gösterimini göster (Şekil 1B).
Şekil 1 : Kapsülleme sistemi. (A) kapsülleme sisteminin şematik temsili. Bir aljinat hücresi süspansiyonu bir şırıngaya (2) yüklenir ve şırınga pompasında bulunan ekstrüzyon hızında bir rezervuar aracılığıyla beslenir (1). Rezervuar içinde, bir titreşim şapka (3) bir dalga şekli jeneratör tarafından ayarlanan bir frekans titreşir (4) eşit aralıklarla akışı bozmak için, eşit büyüklükte damlacıklar şekillendirme. Solüsyon bir nozul (5) ve damlacıklar kullanılarak beslendiği için, akıntının püskürtücü bir sonucu olarak yayılmasına izin veren bir voltaj jeneratörü (6) tarafından ayarlanan bir elektrodu (7) boyunca elektrostatik bir potansiyel uygulanır. elektrostatik kuvvetler. Damlacıklar jelleşme banyosu (8) ile meşgul olarak, CA2 +-küresel mikroboncuk oluşumunda alginat sonuçlarının çapraz bağlama odaklı. (B) alginat mikroboncuk üretiminde önce kapsülör fotoğrafı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Mikro boncuk boyutu amaçlanan kullanıma bağlı olarak değiştirilebilir. Mikro boncuk boyutunu kontrol etmek için, Şekil 1A ve protokolünde özetlenen çeşitli parametreler buna göre ayarlanır. Kullanılan meme iç çapı damlacıklar boyutu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir; daha fazla ayarlama kapsülleme parametreleri, yani ekstrüzyon hızı, titreşim frekansı ve voltaj, tutarlı bir boyut dağılımı elde etmek için anahtardır. Tablonuzda 1 , farklı parametrelerin bu sistemle elde edilen mikroboncuk boyutlarını nasıl değiştireceğinizi özetliyor.
| Parametre | Nozul boyutu | Titreşim frekansı | Akış hızı | Elektrot gerilimi |
 |
|
|
|
|
| Boncuk boyutu |
|
 |
|
– |
Tablo 1: İmalat parametreleri ve mikroboncuk boyutu üzerindeki etkileri. Tablo her parametrenin, meme ve kullanılan çözümün viskozitesi ne olursa olsun, fabrikasyon mikroboncuk sonuç boyutunu nasıl etkileyeceğini gösterir.
Protocol
1. preparatlar
- Hazırlamak 100 ml ~ 4% (w/v) aljinat stok çözüm.
- Ağırlığı 4,4 g alginat sodyum tuz ve kuru toz ekleyin 100 mL HEPES-tamponlu tuz (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) ile 150 mM NaCl (0,877 g) deiyonize su sağlayan hidrasyon.
- Tam aljinat hidrasyon sağlamak için dakika başına ~ 500 devir (rpm) ve 50 °C ' ye kadar ısı ile manyetik karıştırıcı kullanın.
Not: aljinat tamamen susuz olması için bir veya iki saat gerekebilir. Zamanında tasarruf etmek için, aljinat solüsyonu kapsülleme protokolünden bir gün önceden alınabilir ve ertesi güne kadar 4 °c ' de saklanır. Aljinat soğutulmuş olduğunda, su banyosu veya sıcak plaka kullanarak 37 °C ' ye hafifçe ısınır ve kullanmadan hemen önce manyetik karıştırıcı ile karıştırılır. - Steril filtre, kullanmadan önce 0,22 μm gözenek politersülfon (PES) filtresini kullanarak alginat çözümünü kullanır. Filtreleme, 37 °C ' de kolay alginat akışına izin vermek için önerilir. Sıcaklığın düşmesi durumunda viskozite artacaktır.
- Hazırlamak 1.000 mL 0,5 M CaCl2.
- 55,49 g susuz CaCl2 ağırlığında ve 1.000 ml HBS (20 mm hepes ve 150 mm nacl, 1.000 ml deiyonize su) içinde çözülür.
- 0,22 μm gözenek PES filtresini kullanarak steril filtre.
- Hazırlamak 100 mL çözünme karışımı.
- Bir 100 mM HEPES (23,83 g) ve 500 mM Trisodyum sitrat dihydrat (147,05 g) çözeltisi fosfat-tamponlu tuz hazırlayın.
- NaOH veya HCl kullanarak pH 7,4 için ayarlayın.
2. kapsülleme sisteminin ayarlanması
- Laminar akış kaputu temizleyin.
- % 70 v/v etanol çözeltisi ile püskürtme sonrasında UV pozlama kullanarak kapsülleme içeren laminar akış kaput sterilize.
- Kapsüllü sistemi 10 ml 70% v/v etanol çözeltisi ile temizler ve ardından 10 mL steril deiyonize su.
- 300 μm nozulu takın ve 2.1.2 Adımını tekrarlayın.
- Filtre edilen alginat solüsyonu içeren şişeyi sprey, filtre edilen kalsiyum klorür solüsyonu içeren şişe ve 70% v/v etanol çözeltisi ile kullanılan herhangi bir araç, ekipman ve boş kültür plakaları ve laminar akış kaputu içine yerleştirin. Kullanmadan önce, tamamen sterilize etmek için 30 dakika boyunca tekrar UV ışığı açın.
- Bir biyolojik dereceli dezenfektan çözeltisi ile dolu bir atık kabı hazırlayın ve kaput içine kabı yerleştirin.
- 100 ml steril CAcl2 (sulu) çözeltisi ile bir kabı doldurun ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Karıştırma hızını 100 RPM 'ye ayarlayın. Nozulu, meme ucundan 18 cm yükseklikte bir manyetik platforma yerleştirin. Bu kabı aljinat boncuk toplamak ve onların jelasyon izin kullanılır.
- Hücreleri Kapsülleme için hazırlayın.
- Kuluçkasından hücreleri çıkarın ve 0,25% Trypsin-EDTA çözeltisi kullanarak yakın konfluent Flask dan ayırın ve 5-10 dakika için 37 °C ' de inküye.
- Hücre yoğunluğu tahmin için bir örnek izole ve sonra bir hücre Pelet elde etmek için 5 dakika 1.000 rpm 'de kalan hücreleri santrifüjler.
- HBS (20 mm HEPES ve 150 mm NaCl) içinde Pelet pelletini (örneğin, 1,5 x 106 hücreler/ml son konsantrasyon için, 3 x 106 hücreler/ml konsantrasyon elde etmek için HBS hücreleri pelletini) son istenen hücre konsantrasyonu çift.
- Bir 50 mL santrifüjli tüpte, hücre süspansiyonu bir 1:1 oranı ile karıştırın ~% 4 (w/v) alginat çözeltisi, istenen hücre konsantrasyonunu içeren son bir süspansiyon elde etmek için (örn., 1,5 x 106 hücreler/ml) bir ~ 2% (w/v) alginat çözeltisi.
- Kapsülleme parametrelerini ayarlayın.
- Kapsülleme makinesinin hızını maksimum ekstrüzyon hızına (8,9 mL/dak), 1,0 kV 'a ve frekans ile 5.500 Hz 'ye ayarlayın.
Not: Bu parametreler daha önce 550 μm çapı mikroboncuk elde etmek için optimize edilmiştir.
- Kapsülleme makinesinin hızını maksimum ekstrüzyon hızına (8,9 mL/dak), 1,0 kV 'a ve frekans ile 5.500 Hz 'ye ayarlayın.
3. imalat
- Mikroboncukların imalatı.
- 20 mL şırıngasında, hücre-alginat süspansiyon 5 mL yükleyin ve kapsülör bir şırınga takın.
- Hücre-aljinat süspansiyonunu besleyiciden itecek akışı etkinleştirerek kapsülleyiciyi başlatın. Bir damlacıklar akışı meme aracılığıyla ekstrüze edilecektir.
- İlk Non-Uniform akışı geçersiz kılmak için Atık kabı birinci 1 ml toplayın.
- Kalan 4 ml çalıştırmak için damlacıklar CAcl2 jelleşme banyosu içine düşmek izin devam edin. Her mililitre ayrı olarak çalıştırılabilir (ancak sürekli olarak) ve gerekirse dört farklı jelasyon banyosuna toplanır.
Not: jelleşme banyosu ile temas ettikten sonra, damlacıklarda bulunan alginat, jelleşme banyosunda kalsiyum iyonlarının anında çapraz bağlantı kuracaktır ve küresel mikroboncuk oluşturur. - Bir dakika sonra, manyetik platformdan jelleşme kabı kaldırmak ve mikroboncuk daha fazla oturmak için izin 4 agitasyon olmadan dakika (Oda sıcaklığında mikroboncuk boyunca tam jelleşme izin vermek için gerekli zaman).
- Mikroboncuk alın.
- Bir çift steril Cımbız kullanarak herhangi bir büyük alginat enkaz veya eserler çıkarın ve daha sonra bir 74 μm Mesh filtre transfer etmek için steril bir plastik pipet kullanın jelleşme banyosundan mikroboncuk almak için.
- Mikroboncukları uygun kültür ortamını kullanarak santrifüjli bir tüpe aktarın ve hücre kültürü ortamında 5 dakika boyunca dengelenmeye izin verin.
- İnkübasyon ve daha fazla deney için bir Flask, plaka veya Petri tabağı aktarın.
Not: Gelation banyosu yeniden kullanılmamalıdır.
4. test ve mikroboncuk kullanımı
- Mikroboncuk kalitesini test edin.
- Kapsülleme ve kültürden sonra hücre canlılığı (veya diğer biyolojik okumaları) değerlendirmek için, çözünme karışımı kullanarak kapsüllenmiş hücreleri serbest bırakmak için mikro boncuk yavaşça bozar.
Not: gerekli çözünme karışımı hacmi test başına kullanılan mikroboncuk sayısına bağlıdır. Önerilen bir rasyon, kapsüllenmiş hücrelerin her 1 mL için çözünme karışımı 4 mL 'dir. Bu adımın yalnızca her mikro boncuk popülasyonunun tek bir örneğinde gerçekleştirilmesi gerekir. - Hücrelerde bir hücre kültürü kuluçvator% 5 CO2 Ile 37 °c 10 dakika için tamamlayıcı.
- Hücreleri tripan mavi ve bir hemasitometre odası kullanarak boyama tarafından her zamanki gibi çözüm şimdi hücreler için hücre canlılığı tahmin.
Not: hücre viability tahminlerini için otomatik hücre sayaçları kullanıyorsanız, bakım aljinat eserler sayılarla müdahale önlemek için alınmalıdır. Bu durumlarda, naual hücre sayımı tavsiye edilir. - Mikroboncuk stabilitesini değerlendirmek için, mikroskop ve görüntüleme yazılımı kullanarak bir zaman kursu üzerinden her bir mikroboncuk popülasyonundan bir numune için Ortalama çapı ölçün. Çapı dramatik sonraki varyasyonları aljinat bozulması göstergesi olabilir.
- Kapsülleme ve kültürden sonra hücre canlılığı (veya diğer biyolojik okumaları) değerlendirmek için, çözünme karışımı kullanarak kapsüllenmiş hücreleri serbest bırakmak için mikro boncuk yavaşça bozar.
- Salgılanmış Aβ tespiti için mikroboncuk kullanın.
- 24 saat aralıklarla standart koşullarda (2D) kültürlü 7PA2 hücrelerinden örnek hücre kültürü ortamı ve daha fazla analiz için-20 °C ' de depolar.
- 24 saat aralıklarla standart koşullarda (3D) kültürlü kapsüllenmiş 7PA2 hücrelerinden örnek hücre kültürü ortamı ve daha fazla analiz için-20 °C ' de depolar.
- 7PA2 hücrelerinden Aβ salgılamasını, enzim bağlantılı İmmünosorbent Assay (ELISA) tarafından toplanan şartlandırılmış medyada algılayın (Şekil 4).
- İlgili uygulamalarda daha fazla çalışma için mikroboncuk kullanın.
Not: kapsüllenmiş 7PA2 hücreler herhangi bir veya modelde sürekli Aβ salgısı etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.- Beyin içinde Sıçan hipokampus içinde mikroboncuk Engraftman için, sıçan beynin 1 mm kalınlığında koronal bölümleri oluşturmak ve istenilen alana mikroboncuk eklemek için cerrahi aletler kullanın (Şekil 5).
- İlgi biyomoleküllerin sürekli salınımı değerlendirmek için açıklanan protokoller aşağıdaki aljinat mikroboncuk farklı hücre türlerini kapsüller. İlgili in vitro ve in vivo sistemleri daha da modellenebilir.
- Kapsüllü hücrelerin membran bağlı belirteçleri akış sitometri ve/veya immünofluorescence kullanarak ifade algılar.
Not: tümör kitle büyüme ve biyomarker ifade erken aşamalarında modelleme mikroboncuk imalat için benzer bir yöntemin kullanımı bir örnek Rios 20tarafından açıklanmıştır.
Representative Results
7pa2 hücreleri başarıyla aljinat mikrobilyeleri içinde kapsüllenir
Hazırlık sonrası, üniforma ve küresel aljinat mikroboncuk bu protokol kullanılarak başarıyla oluşturulur. Şekil 2A aşağıda Showcase görüntüleri nasıl bir parametre değiştirme (yani, voltaj) akışı ve aljinat damlacıkları akışı dağılımı değiştirir bir örnek. Şekil 2 B , jelleşme işleminden hemen sonra elde edilen alginat boncukların bir örneğini gösterir.
Şekil 2 : İmalat yöntemi optimizasyonu. (A) akış dağılımı değişiklikleri gösteren fotoğraflar. (B) parlak alan görüntü üretim hemen sonra aljinat küresel mikroboncuk gösteren. (C) en iyileştirme adımı örneği: hedef mikro boncuk boyutuna ulaşmak için seçilen imalat parametrelerini ayarlama. Seçilen grafikler, her parametre ile sonuç mikroboncuk boyutu arasındaki ilişkiyi göstermek için (en az n = 100 mikroboncuk boyutu dağılımı). Meme iç çapı, çıkartılan çözelti ve jellenme koşullarının viskozitesi de fabrikasyon boncuk boyutunu etkileyebilir unutmayın. Hata çubukları SD lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın temsil eder.
Açıklanan protokol esnektir ve uygulamaya göre bileşiminde değişen aljinat bazlı mikroboncuk farklı boyutlarda imalat sağlar. Şekil 2C'de, HEPES 'de (pH 7,2)% 2 (w/v) alginat çözeltisi ile 300 μm nozul üzerinden ekstrüze edilen aljinat debisi, voltaj ve frekansın mikroboncuk boyutunda etkisini rapor ediyoruz.
Bu çalışmanın kapsamı, sıçan beyni içine gömülebilir mikroboncuk üretmektir, 500-600 μm aralığında ortalama bir mikroboncuk çapı elde etmek için imalat parametrelerini ayarlardık. Kalite kontrol amacıyla, yöntem fabrikasyon boncuk nüfusu (yani, dar boyutu dağılımı) arasında minimal değişkenlik için optimize edilmiştir. Lütfen unutmayın (1) üretilen boncuklar 20 g iğne ile donatılmış bir Hamilton şırınga kullanarak sıçan beyninde enjekte edilebilir; ve (2) sıçan beynin bir yarımküre bu boyutta iki veya üç boncuk kadar barındırabilir.
Optimizasyon yapıldıktan sonra, 7PA2 hücrelerini 1,5 x 106 hücre/ml 'lik bir konsantrasyonda kapsülleme 2% (w/v) alginat ÇÖZELTISI, HEPES ile tamponlu ve 0,5 M kalsiyum klorür jelasyon banyosuna bırakılan istenen mikroboncuklar sağladı. Şekil 3 Aşağıda, standart hücre kültürü koşullarında bir gün sonra mikro boncuklarda eşit olarak dağıtılmış 7PA2 hücrelerinin kapsüllenmiş olduğunu gösterir. 7PA2 hücre proliferasyonu üretici protokolüne göre bir MTS tahlil kullanılarak test edildi. Yedi günlük bir dönemde aljinat ile veya olmadan yetiştirilen 7pa2 hücrelerin davranışı arasında önemli bir fark yoktu (Şekil 3B). Standart kültür koşullarında kapsüllenmiş hücreler kulyatan, hücrelerin deneme süresince çoğalırlar devam etmek bekleniyor, ve hücre kaçış küçük derecelerde bir sonuç olarak beklenebilir, diğer çalışmalar bildirilen gibi28. Bunun etkileri, daha küçük bir hücre yoğunluğuna kapsülleyerek veya mikroboncuk inkübe edilen serum konsantrasyonunu azaltarak hafifletilebilir.
Şekil 3 : Kapsüllenmiş 7PA2 hücreler. (A) aljinat mikroboncuk boyunca hücre dağılımı bile gösteren kapsüllenmiş 7PA2 hücrelerin parlak alan görüntüsü. İmalat parametreleri, boncuk başına ~ 150 7PA2 hücre elde etmek için ayarlandı. 7 gün boyunca kültürden alginat boncukların önemli bir varyasyonu görülmemiştir. (B) aljinat olmadan alginat ile inkübe edilen 7PA2 hücrelerinin genel proliferasyonu arasında gözlenen hiçbir fark yoktu. 7pa2 hücreleri büyümek ve aljinat boncuk hacmi arasında göç; Serum konsantrasyonunun azaltılması hücre büyümesini yavaşlatmak için kabul edilebilir. Hata çubukları SD lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın temsil eder.
7pa2 hücrelerini Kapsüller Alginate mikrobilyeleri zaman içinde kararlı
Elde edilen aljinat mikroboncuk boyutunu ve şeklini araştırmak için imalat ve jelleşme sonrasında mikroskop analizi yapıldı. Seçilen protokol kullanılarak elde edilen mikroboncuk için Ortalama çapı 550 ± 2 μm ' dir.
Teorik olarak, 550 μm çaplı bir mikroboncuk içinde beklenen hücre sayısı aşağıdaki gibi hesaplanabilir:
Burada V = hacim ve r = Radius. Tek bir mikroboncuk hacmi V = 8,8 x 10-5 ml; Bu nedenle, kapsülleme sırasında mikroboncuk başına hücre sayısı = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 hücreler.
Deneysel olarak, Biz üretimi hemen sonra kapsüllü hücrelerin sayısını sayılır. Alginat boncukları yavaşça çözünme karışımı ve hücreler tripan mavi solüsyon ile lekelenmiş kullanılarak bozulur. Bir hemokytometer kullanılarak, hücrelerde viability tahmini ve sayım yapıldı; elde edilen sonuçlar, mikroboncuk başına ortalama 116 ± 17 canlı hücre gösterdi (n = 5, veri raporlanmadı). Beklendiği gibi, kapsüllendikten hemen sonra teorik ve deneysel hücre sayısı arasında küçük bir fark görüldü. Bazı uygulamalar için ve özellikle zaman içinde yayımlanan Aβ miktarını belirlemek için, her bir aljinat boncuk kapsüllenmiş hücre sayısını tahmin etmek önemlidir.
İlginçtir, kapsülleme işlemi hücre viability üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir. Sonuçlar, kolorektal kanser hücrelerinin (örn. HCT-116) benzer bir yöntem kullanılarak kapsüllendiği önceki bir çalışmayla raporlanır ve 2D kontrolleri20' ye kıyasla alginat mikroboncuklar içinde hücre canlılığı farklılıkları yoktur.
Kapsülleme işleminde kullanılan alginatın kararlılığını ölçmek için, 14 günlük bir süre içinde mikroboncuk çapları ölçülmüştür (n = 100). Kapsüllendikten hemen sonra (veri bildirilmemiş) ile karşılaştırıldığında, kapsülleme işleminden 14 gün sonra ortalama çap cinsinden gözlenen değişiklikler yoktu.
Encapsulated 7PA2 hücreler zaman içinde Aβ serbest
7PA2 hücrelerinin 2D ve 3D kültürlerinden analiz edilen medya, Aβ1-42 seviyelerinde sürekli bir artış ortaya çıkarır. Hücre kültürü medya her 24 saat örneklenen ve dört gün kadar, ve ELISA kullanılarak analiz edildi. Verilerimiz, Aβ1-42 ' in Mikroboncuk (3D) ' den serbest bırakılmasından, profilde 2D kültürden çıkan (Şekil 4) benzer olduğunu gösterir.
Şekil 4 : 7PA2 hücrelerinden Aβ1-42 salgılanması oranı. (A) 2D ve 3D in vitro modellerinde (4 gün sonra normalleştirilmiş) Aβ sürümü benzer bir profile sahiptir. Her iki model de dört günlük dönemde Aβ düzeylerinde sürekli bir artış göstermektedir ve beklendiği gibi istikrarlı bir konsantrasyona ulaşılmaz. (B) aβ1-42 konsantrasyonu ilk hücre numarasına normalleştirilmiş, zaman içinde Aβ1-42 benzer salgılanmasını gösteren, kültür yöntemleri ne olursa olsun. Ne aljinat varlığı ne de kapsülleme süreci (3D in vitro model) Aβ1-42salgılanmasını değiştirebilir. Hata çubukları SD lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın temsil eder.
Kapsüllü 7PA2 hücrelerinin potansiyel uygulaması
Biz, aljinat mikroboncuk kapsüllü 7pa2 hücrelerin etkili Aβ1-42sürekli serbest bırakılması için kullanılabilir ve dolayısıyla herhangi bir preklinik modelde kronik Aβ salgılanması etkisini test etmek için kullanılan rapor. Şekil 5 altında, biz kolayca enjekte edilebilir ve bir sıçan beyni içinde bulunan aljinat mikroboncuk kullanmanın avantajlarını gösterir. Ex vivo bölümler, bir milimetre aljinat boncuk karşı fabrikasyon aljinat mikroboncuk karşılaştırarak, Illustration amaçları için kullanılır.
Şekil 5 : İlgili preklinik uygulamalar için mikroboncuk kullanma. Sıçan beynindeki Engraftman için mikroboncuk, beyin parankimatı zarar görmesini önlemek için çok büyük bir lezyon oluşturmadan gömülecek kadar küçük olmalıdır ve normal beyin fonksiyonunu olumsuz yönde etkiler. Görüntü (a) milimetre ölçekli bir boncuk ile mikrometre ölçekli bir parça yan yana arasında bir boyut karşılaştırması gösterir. (B) in vivo amacıyla beyin içinde milimetre ölçekli bir boncuk implante işe yaramazsa. Görüntü (C), bu protokol kullanılarak üretilmiş bir mikro parçası gösterir. Boyutu normal fizyoloji üzerinde zararlı bir etkiye sahip olmadan sıçan Hippocampus içinde eklemek için uygundur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Yukarıdaki görüntüler, bu tür çalışmalar için mikroboncuk boyutunu kontrol etmenin önemini vurgulamaktadır. Burada, 600 μm altında çapların mikroboncuk kullanmanın avantajı göstermektedir. Bu minimal invaziv enjeksiyon kullanımını sağlar (örneğin, Hamilton şırınga) daha iyi beyin içinde enjekte boncuk yerini kontrol etmek.
Özetle, 7PA2 hücrelerini kapsülleme mikroboncuk büyüklüğü, kapsüllenmiş hücreler sayısı ve mikroboncuk (örn., konsantrasyon, serbest profil) salgılanan Aβ tahmini sayısını kontrol sağlar. Mikroboncuk boyutunun kontrol edilmesi iki nedenden dolayı önemlidir: 1) serbest bırakılan Aβ konsantrasyonu üzerinde ince ayarlı kontrole izin vermek ve 2) sıçan beynin kontrollü bir bölgede implantasyona izin vermek. Burada elde edilen sonuçlar, aljinat mikroboncukların facile ayarını tarif eder ve daha fazla çalışmalar için potansiyel uygulamaları vurgulamaktadır.
Discussion
Bu makalede özetlenen Yöntem, aljinat mikroboncuk27dar boyutta dağılımı elde hücreleri Kapsüllenen için yararlıdır. Ayrıca immüno-yalıtılmış bir ortamda büyüyen hücrelerin avantajı karşılıyor17,19, dış stres onları korumak. Ayrıca, hücrelerin kapsülleme daha yakından fizyolojik koşulları taklit, özellikle hücre-hücre etkileşimleri ve matris sertliği20açısından. Bu faktörler, çevre dokusunda potansiyel bağışıklık reaksiyonları engelleyen, in vivo engraftment gibi ilgili uygulamalarda sonraki kullanım için özellikle önemlidir17. Ayrıca, bu protokol önemli bir avantajı ilgi uygulamaya göre kolay tuneability: Bu protokol değiştirmek ve daha büyük veya daha küçük ve daha yumuşak veya sert boncuk imalatı için parametreleri optimize etmek mümkündür. Açıklanan yöntem, minimal invaziv yöntemler ile enjekte edilecek kadar küçük boncuk imal etmek için kullanılır ve bir dizi hücre barındırmak için yeterince büyük ve gözlemlenebilir davranışsal ve patolojik etkilere neden Aβ yeterli bir sürüm sağlamak hayvan modellerinde enjeksiyon üzerine.
Bu protokolün başarısı, bir dizi kritik adımlara bağlıdır. Dikkatli hücre işleme ve optimum hücre kültür teknikleri hücre canlılığı ve fonksiyon korumak için önemlidir20,28. Standart kültür koşullarını kullanmak, gözlenen 7PA2 hücrelerinin normal fonksiyonunun korunmasını sağlar. Bu, 2D kültürler ile karşılaştırıldığında, kapsüllenmiş hücrelerden Aβ1-42 için benzer bir sürüm profili sağlar. Buna ek olarak, protokolün en iyi şekilde çalışması için, düşük viskoziteye sahip alginat çözeltisi, yüksek viskozite aljinat çözeltisi ile karşılaştırıldığında daha güzel sonuçlar sağlar. Bu, homojen bir laminar jetin nozul üzerinden ekstrüze edilmesini ve fabrikasyon boncuk27' nin matrisindeki hücrelerin hatta dağılımını sağlar. Hücreleri Kapsülleme için kullanılan malzemelerin çok hızlı bir jelleşme mekanizması olması gerekir, şeklin tutulması izin.
Bu protokolde başka bir kritik adım, jelleşme sonrasında fabrikasyon mikroboncuk işleme olduğunu. Burada, boncukları aktarmak için büyük diyafram plastik pipet kullanarak mikroboncuk alınmasını gösteriyoruz. Alternatif olarak, mikroboncuk içeren kalsiyum klorür solüsyonu bir Mesh filtresine dökmek boncuk alımı için kullanılabilir. Büyük (5, 10 veya 25 mL) serolojik pipet mikroboncuk çizmek için kullanılabilir ve daha sonra döküm yerine mesh filtresinde yıkanabilir. Bunun avantajı, dökme ile karşılaştırıldığında prosedürün sterilitesi daha yüksek bir güvendir. Ancak, sınırlamalar bazı boncuklar pipet tarafından sıkıştırılmış ise, daha düşük bir verim riske ek olarak mikroboncuk büyük bir oranı kurtarılamaz olabilir.
Bu yaklaşım model ve farklı hastalıklar (örneğin, kapsüllü pankreatik islet gelen insülin serbest) çalışma farklı hücre çizgileri kapsüllemek için kullanılmıştır. Bizim yaklaşım yenilik mikroboncuk Alzheimer hastalığının önemli yönlerini modelleme yararlı bir yöntem olarak bu protokol kullanılarak oluşturulan Engraftman in vivo olduğunu. Kapsüllenmiş hücrelerden Aβ sürüm profilini karşılaştırırken (Şekil 4) bir bolus enjeksiyonu ile oluşturulan Aβ düzeylerine (diğer çalışmalarda bildirilen gibi3,26), bir daha kronik ve sürekli Aβ salınımı olabilir Beklenen. Şekil 6 elde edilebilir öngörü eğilimi gösterir. In vivo modelleme için bu sistemi kullanarak daha fazla hastalık ilerledikçe ve ilaç keşif ve geliştirme daha yararlı olabilir yol ilgilidir.
Şekil 6 : Bir bolus enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında kapsüllenmiş 7PA2 hücrelerinden Aβ1-42 öngörülen yayın profili. Doğumuna 7pa2 içeren mikroboncuk Aβ serbest profili, ad ile ilgili bir hayvan modelinde kronik ve sürekli Aβ etkilerinin test edilmesini sağlar. Bunun tersine, bir bolus enjeksiyonu, kısa bir süre içinde Aβ seviyelerinde bir artış yaratacak ve ardından beyinden Aβ 'nin hızlı bir şekilde temizlenmesine neden olur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Bay Kajen suresparan, Dr Jonathan wubetu, Bay Dominik Grudzinski, Miss Chen Zhao ve Dr Thierry pilot aljinat mikroboncuk imalat, hücre kültürü ve Aβ algılama optimizasyonu ve yararlı bilimsel yardım için teşekkür etmek istiyorum Tartışma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager software | Vale Lab, UCSF, USA | v.1.46 | |
| 0.22 um PES filter | Merck, UK | SLGP033RS | |
| 15mm Netwell insert 74 um mesh filter | Constar, usa | #3477 | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae | Sigma-Aldrich,uk | A0682 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich,uk | C1016 | |
| CellTiter96 AQueous One Solution cell proliferation assay | Promega, USA | G3580 | |
| Encapsulator | Inotech | IE-50 | serial no. 05.002.01-2005 |
| HEPES | Sigma-Aldrich,uk | H4024 | |
| Hu Aβ 1-42 ELISA | ThermoFisher, UK | KHB3441 | |
| ImageJ software | ImageJ | v1.49p | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Leica microscope | Leica microsystems, UK | DMI6000B | |
| Neo sCMOS Camera | Ander, UK | 5.5 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,uk | D1408 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,uk | 433209 | |
| Trispdium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich,uk | W302600-K | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich,uk | T4049 |
References
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Karthick, C., et al. Time-dependent effect of oligomeric amyloid-β (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease. Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).
- Watremez, W., et al. Stabilized Low-n Amyloid-β Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-β1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).
- Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease. International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758 (2018).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).
- Tomiyama, T., et al. A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo. Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).
- Oddo, S., et al. Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Leon, W. C., et al. A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-β-Associated Cognitive Impairment. Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).
- Prince, M., et al. Dementia UK: Second Edition - Overview. Alzheimer's Society. , 61 (2007).
- Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward. Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation. The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Forny-Germano, L., et al. Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-β Oligomers in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).
- Masliah, E., et al. Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease. Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).
- Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).
- Calafiore, R., Basta, G. Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
- Tran, N. M., et al. Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections. PLoS One. 9 (10), 109969 (2014).
- Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (4), 045010 (2018).
- Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds. Biofabrication. 1 (4), 045002 (2009).
- Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).
- Podlisny, M. B., et al. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).
- Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of amyloid-β species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).
- Welzel, A. T., et al. Secreted amyloid β-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity. Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).
- O'Hare, E., et al. Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).
- Nedović, V., Willaert, R. Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology. Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , Focus on Biotechnology book series, Springer Link (FOBI, volume 8A) 185-204 (2004).
- Omer, A., et al. Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
