この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。
2光子顕微鏡は、細胞下からネットワークレベルに至るまでの空間スケールで生きた動物の脳の調査を可能にし、ミリ秒から数週間の時間的スケールで生きている動物の脳の調査を可能にする神経科学の基本的なツールです。さらに、2光子イメージングは、脳機能と行動の因果関係を探索するために、様々な行動タスクと組み合わせることができます。しかし、哺乳類では、光の浸透と散乱が限られているため、主に表面的な脳領域に対する2光子のインビタルイメージングが制限され、海馬などの深脳領域の縦方向の調査が妨げられています。海馬は、空間ナビゲーションとエピソード記憶に関与し、健康と病気の両方で、学習とリコールのために重要な細胞だけでなく、認知プロセスを研究するために使用される長年のモデルです。ここで、生きているマウスにおける後部海馬への慢性的な光学アクセスを可能にする調製方法について詳しく説明する。この調製は、頭部固定における細胞および細胞内分解能における2光子光学イメージングと組み合わせることができ、数週間にわたって生きたマウスを麻酔した。これらの技術は、後部海馬CA1のニューロンの数十から数百のニューロンでニューロン構造または活性誘発可塑性の繰り返しイメージングを可能にします。さらに、この慢性的な調製物は、微小内視鏡検査、ヘッドマウントワイドフィールド顕微鏡、3フォトン顕微鏡などの他の技術と組み合わせて使用することができ、したがって、関与する細胞およびネットワークプロセスを研究するためにツールボックスを大幅に拡大学習と記憶の中で。
哺乳類では、海馬はエピソード記憶の符号化とリコール、ならびに空間ナビゲーション1、2、3、4のための主要な脳領域である。このため、海馬は、脳が記憶5、6、7をエンコードして記憶を呼び出したり、環境8をナビゲートすることを可能にする基本的なメカニズムを研究するための非常に重要なモデルです。 、9報酬を収集し、危険を回避します。さらに、海馬形成は、げっ歯類10、11、およびおそらくヒト12、13の生涯を通じて新しいニューロンが生成される脳領域の一つである。最後に、海馬形成の変性または障害は、アルツハイマー病14を含む神経学的および精神疾患に関連している。
マウスでは、海馬は脳表面15の約1mm下に位置する。その位置は、無傷の脳内の光学アクセスを妨げ、その結果、海馬ダイナミクスの縦方向の研究は、主に磁気共鳴(MR)イメージング、電気生理学、およびex vivoイメージング分析に依存してきました。MRイメージング法は、同じ動物における生物学的プロセス(例えば、遺伝子発現変化16)を複数日にわたって追跡することを可能にするが、単一ニューロンを判別する空間分解能を欠いている。生体内電気生理学的技術の古典的なは、膜電位の変化に非常に高い時間分解能と絶妙な感度を提供します。しかし、空間分解能は限られており、長期間にわたって同じセルを確実に追跡する能力がありません。光学イメージングは、その高い時間的および空間的分解能のおかげで、より多様なプロセスを研究することができます。しかし、ex vivoイメージングは進行中のプロセスのスナップショットのみを提供するため、動物が情報を学習してリコールする縦方向の研究には適していません。
インビボ光学イメージングは、MRイメージングと電気生理学のいくつかの利点と光学イメージングの利点を兼ね備えています。したがって、マウスの脳のダイナミクスと行動の縦方向および相関解析に非常に適しています。これは、非常に速い(ミリ秒から秒)または非常に遅い(数日から数週間)時間スケールを持つ生物学的プロセスの研究に関連しています。神経科学に関連するそのようなプロセスの例は、膜電圧ダイナミクス、Ca2+過渡、細胞可塑性および構造変化であり、これらはすべて記憶形成およびリコールにとって非常に重要であると考えられている。異なる方法は、後部海馬18、19、20、21、22に生体内イメージングで拡張されています。急性製剤は、ピラミッド型ニューロン(PN)活性ならびにその樹状突起および樹状脊椎の追跡を数時間20、22時間可能にした。しかし、この時間的な時間枠では、段階的な学習の根本にある長期的な構造変化を研究することはできません。慢性的な製剤 – マイクロ内視鏡23、24または長い作業距離(WD)標準顕微鏡目標21との組み合わせで- いくつかの上の後部海馬の繰り返しイメージングを可能にしました週間。
ここでは、永久に挿入されたイメージングカニューレを用いて生きているマウスの後部海馬のCA1サブフィールドへの再発光学アクセスを提供する慢性的な製剤について説明する。この準備は機能的妨害なしでCA1への繰り返しアクセスを可能にし、生命体の2光子(2P)または広視野のエピ蛍光イメージングのために適している。生きたマウスの背部CA1における2P深部脳慢性イメージングの2つの例は、樹状構造の縦方向イメージングと樹状脊椎ダイナミクスおよび活性誘発可塑性の縦方向イメージングである。この手法の顕著な利点と制限について説明します。
ここで、生きているマウスにおける後部CA1の2P撮像を繰り返す手順について説明する。手術後、マウスは通常2日以内に回復する。手順は、最小限のアストログリオシス26、43を誘発する。手術後に起こる出血および上皮は、通常10〜14日以内に再吸着される。一般に、移植後14日目以降の調製物は、インビタルイメージングを行うのに十分に明らかである。外科の成功は無菌の環境で働くにかかっている。しかし、手術に関連する感染症による合併症を避けるためには、高い衛生状態を維持することが重要です。これは、手術の前後に手術器具を細心の注意を払って洗浄し、各使用の直前に熱殺菌することによって得られます(ステップ2.1.1)。光学カニューレはきれいな、殺菌された容器に保たれ、注入の直前に無菌生理生理ですすいですすいだ。手の消毒と外科ステーションのクリーニングの一般的な外科的慣行を行うことも非常に重要です。調製は安定したままで、数週間26、35の細胞および細胞内分解能イメージングを可能にする。
重要な手順、変更、トラブルシューティング。
最も深い繊維が露出するまで、外部カプセルを剥離することが重要です。3-または4mm WDで商用目的を使用する場合、PNのソマに焦点を当てることができない場合や、解像度の低下画像樹状脊椎に焦点を当てることができない可能性があります。この目的のために、0.9 mmの直径の針を使用してネオコルテックスを非常にゆっくりとアブレートし、最も後部繊維を取り除くとき吸引のより細かい制御のための0.3-0.5 mmの直径(24-29ゲージ)の針に切り替えると有用である。あるいは、微細鉗子は、繊維曝露36後に残りの皮質を除去するために使用されてもよい。
手術中の出血は、血液が視界を妨げるので、問題を引き起こす可能性があります。血栓が形成され、残りの血液を洗い流すために生理生理生ですすいでお勧めします。必要に応じて繰り返します。
カニューレと開頭術の間にぴったりフィットは、特にカニューレの外縁が頭蓋骨と同じである場合は、セメントの塗布前にカニューレを所定の位置に保つことによって、調製の安定性を高めるのに役立ちます。トレフィンドリルとカニューレのサイズが一致しているため、カニューレの側面の凹凸(ステップ2.3.14を参照)または不規則な開頭術を必要とするカニューレの側面の凹凸のために緩いフィット感が生じる可能性があります。カニューレの不規則性は(ステップ1.3および1.12)オフに提出しなければならず、トレフィンは頭蓋切開が完了するまで頭蓋骨に垂直に保持されなければならない(ステップ2.3.12)。頭蓋切開術が完了する前に頭蓋骨からトレフィンを取り除くと、不規則な頭蓋切開が起こり得る。
制限事項 –調製の侵襲性および安定性。
皮質切除の効果を評価することは困難であり、直接的および間接的に影響を受ける領域を正確に定義することは困難です。一般に、手術は頭頂皮質の一部および視覚および後肢感覚皮質21の一部を取り除く。海馬に直接突出する皮質と海馬組織は触れられず、負傷もしない。重要なことに、イメージングカニューレの移植は海馬機能を大きく変えないことが示されており、特に海馬依存型学習21、36、37、38、 39.それでも、カニューレとインプラントの外部(ヘッドホルダープレートと歯科アクリルキャップ)の両方がコルチコステロン血中濃度と副腎体重を評価することによって慢性的なストレッサーであるかを定量化することが重要です。未移植マウス。
準備は一般的に週から数ヶ月26まで安定したままです.長期的には、皮膚および骨の成長は、アクリルキャップを置き換え、イメージング製剤の不安定性を増加させる傾向がある。
光学的な制限。
従来の2P顕微鏡検査は、新生物組織40、41に深さ約1mmまでのイメージングを可能にする。これと一致して、SR(図2D-F)またはSLM36に位置する樹状脊椎および樹状脊椎を画像化することができる。しかし、カニューレを介したイメージングは、有効なNAに制限をもたらす。最大解像度を達成するためには、イメージングカニューレの直径と深さは、より小さな直径と長い深さが高いNA目的の光をクリップするように、イメージングNAと一致する必要があります。例えば、1.6mmの長さのカニューレを通して1.0 NAの水浸しの目的でイメージを撮影する場合、完全なNAを維持するために3.65 mmの内径が必要です。しかし、この直径のカニューレを使用すると海馬の圧縮が増加し、組織の健康に影響を与える可能性があり、このため、我々は、より小さな直径を持つカニューレを使用します。長さ1.6mmのカニューレを通して0.8 NAの水浸漬目的でイメージングする場合、内径は2.5mmで完全なNAを維持するのに十分です。しかし、0.8 NAの水浸しの目的は、SPでの焦点を合わせるのを防ぐことができる短いWD(私たちの場合は3ミリメートル)を持っています。
これらの計算は、カニューレの下部にある視野の中心に適用されます。しかし、画像化視野をカニューレの縁に近づけるか、組織に深く焦点を合わせると、カニューレのガラス表面から遠く離れた場所に移動すると、焦点面での有効なNAがさらに低下し、解像度が低下します。これは、画像化された組織の異なる容積にわたって非均質な分解能につながり、特に2P-STED顕微鏡検査42などの超分解能技術を使用する場合、細胞内分解能での定量イメージングの懸念となりうる。これらの問題は、細胞分解能でイメージングする場合にはそれほど重要ではありません。
ティッシュモーション。
麻酔動物の呼吸と心拍に起因する組織内の運動は、イメージングカニューレからの距離が増加すると、より重篤になる傾向がある。これは、イメージングカニューレが脳に機械的圧力を加え、カニューレ付近の運動の一部を打ち消す(新生児製剤と同様に)ためである。したがって、SRおよびSLMでは樹状脊椎のイメージングが可能であるが、我々の手の中では、カニューレの表面から最大200μmまでのSOに対して最も堅牢な背部である。動きを補正するために、共振スキャナとオフライン平均を使用します。Z スタックのイメージ プレーンごとに、使用可能な最大速度 (30 フレーム/秒) で複数の画像 (4 ~ 6 回の繰り返し) が取得されます。各Z平面のすべての繰り返しは、(商用ソフトウェア、AutoQuantを使用して)デコンボルブされ、登録(ImageJを使用)、単一の画像26に平均化される。ソマタのイメージングでは、麻酔35では運動が無視されることが多く、2つの平均値が運動アーティファクトを補正するのに十分であることがよくあります。
メソッドの将来のアプリケーションまたは方向.
調製物は、マイクロ内視鏡26、43と組み合わせることができる。マイクロ内視鏡は、深部組織18との間で光を導くために勾配屈折率(GRIN)マイクロレンズを使用する剛性光学プローブです。マイクロ内視鏡の使用はより小さい直径のカニューレ、あるいは全くカニューレを可能にする。しかし、市販のマイクロ内視鏡は、光学収差に対してあまりよく補正され、商業的な目的よりもNAが低い。現在のプローブは、横および軸の解像度に達します ≥0.6-1 μm, ≥10-12 μm, それぞれ17,18,44.マイクロ内視鏡の使用はまた頭部取付けされた統合された広視野顕微鏡45、46、47とのこの準備の組合せを可能にする。
この方法は、非麻酔マウスにおいても使用するように自ら貸し出し、および覚醒ヘッド固定マウス21、37、48、49におけるCa2+センサを用いて細胞活動を調製するために使用されている。これらの場合、蛍光変化の速い時間スケールのために、ライン登録50を実施することをお勧めします。また、歯状ジャイル(DG)39、51、52などの他の海馬サブ領域の撮像のための調製物を適応させることも可能である。この調製物を3P励起53、54、1MHz周波パルスレーザーで1400nmに調整し、分子層、顆粒細胞層及び造粒細胞層及び及び1400nmに到達する海馬形成をより深く画像化することができた。オーバーレイ CA1 を取り外すことなく DG (図4) の hilus。
結論として,後部海馬への光学的アクセスを提供し,海馬の構造と活動のダイナミクスの縦方向および相関的研究を可能にする方法を提示する.この技術は、生理的および病理学的条件下での海馬機能の分析の可能性を拡張する。
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. はシュラム財団によって支援されています。C.W. T. P. と W. G. はマックス・プランク・ソサエティによって支援されています。L.Y.とR.Y.は、マックスプランク協会と国立衛生研究所(R01MH080047、1DP1NS096787)によってサポートされています。A. C. 欧州研究評議会、ERANETおよびI-COREプログラム、イスラエル保健省のチーフサイエンティストオフィス、連邦教育省、ロベルトとレナータ・ルーマン、ブルーノとシモーネ・リッチからのFP7助成金によってサポートされています。ネラとレオン・ベノジヨ神経疾患センター、ヘンリー・チャノック・クレンター生物医学イメージング・ゲノミクス研究所、イスラエル科学財団パールマン・ファミリー、アデリス、マーク・ベセン、プラット、アーヴィング・I・モスコウィッツ財団。A. A. マックス・プランク・ソサエティ、シュラム財団、ドイツ・フォルシュンゲミンシャフト(DFG)が支援しています。3P画像は、マックスプランクフロリダ神経科学研究所の神経イメージング技術の高度なコース中に取得されました.神経イメージング技術の高度なコースは、マックスプランク協会、フロリダ州マックスプランク科学フェローシッププログラムとマックスプランクフロリダ研究所株式会社パートナーシッププログラムによってサポートされています。コース中に2P/3Pイメージングシステムのサポートと機器を提供してくださったThorlabs、コヒーレント、スペクトル物理学に感謝します。また、ヘンリー・ヘーバールとメリッサ・エバールがコース中にシステムを支援してくれたことに感謝しています。
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |