이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
2 광자 현미경 검사법은 세포 이하에서 네트워크 수준에 구역 수색하고 밀리 초에서 주에 시간 규모에 구역 수색하는 공간 규모에 살아있는 동물의 두뇌의 조사를 허용하기 때문에 신경 과학을 위한 기본적인 공구입니다. 추가로, 2 광자 화상 진찰은 두뇌 기능 과 행동 사이 인과 관계를 탐구하기 위하여 행동 작업의 다양한 결합될 수 있습니다. 그러나, 포유류에서, 빛의 제한된 침투 및 산란은 표면적인 두뇌 지구에 주로 2 광자 내 생명 화상 진찰을 제한했습니다, 따라서 해마와 같은 깊은 두뇌 지역의 경도 조사를 배제하. 해 마 공간 탐색 및 에피소드 메모리에 관여 하 고 학습 및 기억에 대 한 중요 한 인지 프로세스 뿐만 아니라 세포를 공부 하는 데 사용 하는 오랜 모델, 건강 및 질병모두에서. 여기서, 살아있는 마우스에서 등쪽 해마에 대한 만성 광학 접근을 가능하게 하는 제제는 상세히 설명되어 있다. 이 제제는 몇 주에 걸쳐 두 개의 세포 및 세포 내 해상도에서 2 광자 광학 이미징과 결합될 수 있다. 이 기술은 등측 해마 CA1에 있는 신경 구조 또는 활동 가능하게 한 가소성의 수십에서 수백의 신경성의 반복한 화상 진찰을 가능하게 합니다. 또한, 이 만성 제제는 마이크로 내시경 검사, 헤드 마운트 와이드 필드 현미경 또는 3 광자 현미경 검사법과 같은 다른 기술과 함께 사용할 수 있으므로 관련 세포 및 네트워크 프로세스를 연구하기 위해 도구 상자를 크게 확장할 수 있습니다. 학습과 기억에서.
포유류에서, 해마는 에피소드 기억의 인코딩 및 회상뿐만 아니라 공간 탐색 1,2,3,4의주요 뇌 영역이다. 이러한 이유로, 해마는 – 그리고 아직도 – 뇌가 기억을 인코딩하고 기억 할 수있는 기본메커니즘을 연구하는 매우 중요한 모델 5,6,7 또는 환경8 ,9 보상을 수집하고 위험을 피하기. 또한, 해마 형성은 설치류10,11 및 아마도 인간12,13의수명 동안 새로운 뉴런이 생성되는 뇌 영역 중 하나입니다. 마지막으로, 해마 형성의 변성 또는 손상은 알츠하이머병(14)을 포함하는신경및 정신장애와 연관된다.
마우스에서, 해마는 뇌 표면15의 밑에 대략 1 mm 위치. 그것의 위치는 손상되지 않은 두뇌에 있는 광학 접근을 방지하고 그 결과로, 해마 역학의 경도 연구 결과는 자기 공명 (MR) 화상 진찰, 전기 생리학 및 ex vivo 화상 진찰 분석에 주로 의존했습니다. MR 화상 진찰 방법은 생물학적 과정의 추적을 허용합니다 (예를 들어, 유전자 발현 변경16)여러 날에 걸쳐 동일한 동물에서, 그러나 단일 뉴런을 구별하는 공간 적 해상도가 부족하다. 고전 생체 내 전기 생리학 기술은 멤브레인 전위 변화에 매우 높은 시간적 해상도와 절묘한 감도를 제공합니다. 그러나, 그(것)들은 한정된 공간 해결책을 가지고 있고 더 긴 기간 동안 확실하게 동일 세포를 추적하는 기능이 부족합니다. 광학 이미징은 높은 시간적 및 공간적 해상도덕분에 보다 다양한 공정을 연구할 수 있게 해줍니다. 그러나, 생체 내 화상 진찰은 진행중인 프로세스의 스냅샷을 제공하고, 따라서 동물이 정보를 배우고 기억하는 동안 경도 연구 결과를 위해 적합하지 않습니다.
생체 내 광학 이미징은 MR 이미징 및 전기 생리학의 몇 가지 장점을 광학 이미징의 장점과 결합합니다. 따라서 마우스 뇌 역학 및 행동의 세로 및 상관 관계 분석에 매우 적합합니다. 이것은 매우 빠른 (밀리 초에서 초) 또는 매우 느린 (일 에서 몇 주) 시간 규모와 생물 학적 과정의 연구에서 관련이 있다. 신경 과학과 관련된 이러한 프로세스의 예로는 멤브레인 전압 역학, Ca2+ 과도, 세포 가소성 및 구조적 변화가 있으며, 이는 모두 메모리 형성 및 회수에 매우 중요하다고 여겨질 수 있습니다. 상이한 방법은 등쪽 해마18,19,20,21,22로생체 내 이미징을 확장했다. 급성 제제는 피라미드 뉴런(PN) 활성뿐만 아니라 수시간 동안 그들의 수상돌기 및 수지상 척추의 추적을20,22시간동안 허용하였다. 그러나 이 시간적 기간은 점진적 학습의 근간이 될 수 있는 장기적인 구조적 변화를 연구하는 것을 허용하지 않습니다. 만성 제제 – 마이크로 내시경23,24 또는 긴 작동 거리 (WD) 표준 현미경 목표(21)와 함께 – 여러 번 등쪽 해마의 반복 적 이미징을 가능하게했습니다. 주.
여기서, 우리는 영구적으로 삽입된 이미징 캐뉼라를 사용하여 살아있는 마우스의 등쪽 해마의 CA1 하위 필드에 재발하는 광학 접근을 제공하는 만성 제제를 기술한다. 이 제제는 기능적 장애 없이 CA1에 반복적으로 접근할 수 있으며, 인트라바이탈 2광자(2P) 또는 광전성 영상에 적합합니다. 살아있는 마우스의 등쪽 CA1에 있는 2P 깊은 두뇌 만성 화상 진찰의 2개의 보기는 상세한: 수지상 구조물의 종방향 화상 진찰 및 수지상 등등 역학 및 활동 불러일으킨 가소성의 경도 화상 진찰. 기술의 현저한 장점과 한계에 대해 논의합니다.
여기서, 살아있는 마우스에서 등쪽 CA1의 반복된 2P 이미징을 위한 절차가 기재되어 있다. 수술 후, 마우스는 일반적으로 2 일 이내에 회복. 절차는 최소한의 천체 성 동맥 을 유도26,43. 수술을 따를 지도 모르다 출혈 과 부종은 일반적으로 10 14 일 안에 재흡착됩니다. 일반적으로, 14 일 이식 후 이후에서 준비는 충분히 명확 하 게 활력 내 이미징을 수행 하기 위해. 수술의 성공은 멸균 환경에서의 작업에 의존하지 않습니다. 그러나, 위생의 높은 수준을 유지 하는 것이 중요 하다, 수술 관련 된 감염으로 인해 합병증을 피하기 위해. 이것은 수술 전후에 수술 기구를 꼼꼼하게 청소하고 각 사용 직전에 열 멸균하여 얻어진다 (단계 2.1.1). 광학 캐뉼러는 깨끗하고 멸균된 용기에 보관되고 이식 직전에 멸균 식염수로 헹굴 수 있습니다. 손 소독 및 수술 스테이션의 청소의 일반적인 수술 관행을 수행하는 것도 매우 중요합니다. 준비는 안정되어 있고 몇 주 동안 세포 및 세포 및 세포 이하 해상도 화상 진찰을 허용합니다26,35.
중요한 단계, 수정 및 문제 해결.
가장 깊은 섬유가 노출 될 때까지 외부 캡슐을 벗기는 것이 중요합니다. 3mm 또는 4mm WD로 상업적 목표를 사용할 경우 알베우스를 노출하지 않으면 PN의 소마에 초점을 맞출 수 없거나 해상도가 감소된 수지상 척추에 초점을 맞출 수 없습니다. 이 목적을 위해, 0.9 mm 직경 의 바늘을 사용하여 신피질을 매우 천천히 제거 한 다음 0.3-0.5 mm 직경 (24-29 게이지) 바늘로 전환하여 가장 등쪽 섬유를 제거 할 때 흡입을 보다 세밀하게 제어하는 것이 유용합니다. 대안적으로, 미세 집게는 섬유노출(36)후에 나머지 피질을 제거하는데 사용될 수 있다.
혈액이 시야를 가리기 때문에 수술 중 출혈은 문제가 될 수 있습니다. 혈전이 형성될 때까지 기다린 다음 남은 혈액을 씻어식염수로 헹구는 것이 좋습니다. 필요에 따라 반복합니다.
캐뉼라와 개두술 사이에 꼭 맞는 것은 특히 캐뉼라의 바깥쪽 가장자리가 두개골과 플러시되는 경우 시멘트를 적용하기 전에 캐뉼러를 제자리에 유지하여 준비의 안정성을 높이는 데 도움이됩니다. 트레핀 드릴과 캐뉼라의 크기가 일치하기 때문에 캐뉼라 측면의 요철로 인해 느슨한 착용감이 발생할 수 있습니다 – 약간 더 큰 두개두개미가 필요합니다 (단계 2.3.14 참조) 또는 불규칙한 개두술. 모든 캐뉼라 부정행위는 반드시 제기되어야 하며(1.3단계 및 1.12단계) 트레핀은 두개골 절제술이 완료될 때까지 두개골에 수직으로 유지되어야 합니다(단계 2.3.12). 개두술이 완료되기 전에 두개골에서 trephine를 제거하는 것은 불규칙한 두개두개절을 초래할 수 있습니다.
제한 사항- 침략과 준비의 안정성.
직접 및 간접적으로 영향을받는 영역을 정확하게 정의하는 것이 힘들기 때문에 피질 절제의 효과를 평가하기가 어렵습니다. 일반적으로, 수술은 정수리 피질의 부분과 시각 및 뒷다리 감각 피질(21)의일부를 제거합니다. 압제 된 피질은 해마에 직접 투영되지 않으며 해마 조직은 만지지도 다치지도 않습니다. 중요한 것은, 이미징 캐뉼라의 이식이 해마 기능 및 특히 해마 의존적 학습21,36,37,38, 39. 여전히, 캐뉼라와 임플란트의 외부 부분 (헤드 홀더 플레이트 및 치과 아크릴 캡)이 코르티코스테론 혈중 농도와 부신 무게를 평가하여 만성 스트레스인 정도를 정량화하는 것이 중요합니다. 이식되지 않은 마우스.
준비는 일반적으로 주에서 달26에안정적으로 남아 있습니다. 장기적으로, 피부와 뼈의 성장은 아크릴 캡을 대체하고 이미징 제제의 불안정성을 증가시키는 경향이 있다.
광학적 한계.
기존의 2P 현미경 검사법은 신피질 조직40,41에약 1 mm 깊이까지 이미징을 허용합니다. 이와 일치하여, SR(도 2D-F) 또는 SLM36에위치한 수상돌기 및 수지상 척추를 이미지화할 수 있다. 그러나, 캐뉼라를 통한 이미징은 효과적인 NA에 한계를 제기한다. 최대 해상도를 달성하기 위해 이미징 캐뉼라의 직경과 깊이는 더 작은 직경과 더 긴 깊이가 높은 NA 목표의 빛을 클립으로, 이미징 NA에 일치해야합니다. 예를 들어, 1.6mm 길이의 캐뉼라를 통해 1.0 NA 수몰입 목표를 가지고 이미징할 때, 전체 NA를 유지하기 위해 3.65mm 내경이 필요합니다. 그러나이 직경의 캐뉼라를 사용하면 해마의 압축이 증가하고 조직의 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 직경이 작은 캐뉼라를 사용합니다. 1.6 mm 길이의 캐뉼라를 통해 0.8 NA 수분 침지 목적으로 이미징할 때, 2.5 mm의 내경은 전체 NA를 유지하기에 충분할 것이다. 그러나 0.8 NA 수분 침지 목표는 WD(경우 3mm)가 짧아 SP에 초점을 맞추는 것을 방지할 수 있습니다.
이러한 계산은 캐뉼라 하단의 시야 중심에 적용됩니다. 그러나, 시야의 이미징 필드를 옆으로 움직이면 캐뉼라 가장자리에 더 가깝게 또는 조직 깊숙이 초점을 맞추거나 캐뉼라의 유리 표면에서 더 멀리 집중하면 초점 평면에서 효과적인 NA가 더 감소하여 해상도가 감소합니다. 이것은 심상 조직의 상이한 양에 걸쳐 비 균일한 해결책으로 이끌어 낼 것이고, 특히 2P-STED 현미경42와같은 초고해상도 기술을 사용하는 경우에, 세포내 체질 에서 정량적인 화상 진찰을 위한 관심사일 수 있습니다. 이 문제는 세포 해상도에서 화상 진찰할 때 보다 적게 중요합니다.
조직 운동.
조직 내의 운동 – 마취된 동물에 있는 호흡 그리고 심박동에서 유래하는 – 화상 진찰 캐뉼라에서 증가한 거리로 더 가혹하게 되는 경향이 있습니다. 이것은 아마도 이미징 캐뉼라가 뇌에 기계적 압력을 가하여 캐뉼라 부근의 일부 움직임을 중화하기 때문일 수 있습니다 (신피질 제제와 유사하게). 따라서, 수지상 척추의 이미징은 SR과 SLM에서 가능하지만, 우리의 손에, 그것은 캐뉼라의 표면에서 200 μm까지 SO에 가장 견고한 등쪽이다. 움직임을 보정하기 위해 공진 스캐너와 오프라인 평균을 사용합니다. Z 스택의 이미지 평면당 최대 사용 가능한 속도(30프레임/s)로 여러 이미지(4~6회 반복)를 획득합니다. 각 z 평면에 대한 모든 반복은 (상용 소프트웨어, AutoQuant를 사용하여), 등록 (ImageJ를 사용하여) 및 단일 이미지(26)로평균화된다. 소마타의 화상 진찰을 위해, 운동은 마취35에 수시로 무시할 수 있고 2개의 평균은 수시로 운동 아티팩트를 보상하기 위하여 충분합니다.
메서드의 향후 응용 프로그램 또는 방향 .
준비는 마이크로 내시경26,43과결합 될 수있다. 마이크로 내시경은 경부 조직(18)에서빛을 안내하기 위해 그라데이션 굴절률 (GRIN) 마이크로 렌즈를 사용하는 단단한 광학 프로브입니다. 마이크로 내시경을 사용하면 더 작은 직경의 캐뉼라를 허용하거나 캐뉼라가 전혀 없습니다. 그러나 상업용 미세 내시경은 광학 수차에 대해 덜 잘 보정되며 상업적 목표보다 NA가 낮습니다. 현재 프로브는각각 17,18,44의측면 및 축 해상도에 도달합니다 .0.6-1 μm, □10-12 μm. 마이크로 내시경의 사용은 또한 헤드 마운트 통합 광시야 현미경45,46,47와이 준비의 조합을 가능하게 합니다.
이 방법은 또한 비마취 마우스에서 사용하기도 하며, 깨어있는 머리 고정 마우스21,37,48,49에서Ca2+ 센서를 사용하여 세포 활성을 조사하는 데 사용되어 왔다. 이러한 경우, 형광 변화의 빠른 시간 척도로 인해, 라인 등록(50)을구현하는 것이 바람직하다. 또한 치과 자이러스(DG)39,51,52와같은 다른 해마 하위 영역의 이미징을 위한 준비를 적응시킬 수도 있다. 이 제제를 3P 여기53,54와 1400 nm로 튜닝된 1 MHz 주파수 펄스 레이저와 결합하여 분자층, 과립 세포 층 및 해마 형성에 더 깊이 영상을 할 수 있었습니다. 오버레이 CA1을제거하지 않고 DG (그림 4)의 힐루스.
결론적으로, 우리는 등등 해마에 광학적인 접근을 제공하고 해마 구조 및 활동의 역학의 경도 및 상관 관계 연구를 허용하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 생리적 및 병리학적 조건하에서 해마 기능 분석의 가능성을 확장합니다.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F.는 슈람 재단의 지원을 받고 있습니다. C.-W. T. P. 및 W. G. 맥스 플랑크 소사이어티의 지원을 받습니다. L.Y. 및 R.Y.는 막스 플랑크 학회 및 국립 보건 원 (R01MH080047, 1DP1NS096787)에 의해 지원됩니다. A. C. 유럽 연구위원회에서 FP7 그랜트에 의해 지원됩니다, ERANET 및 I-CORE 프로그램, 보건의 이스라엘 정부의 수석 과학자 사무실, 교육 및 연구의 연방 정부, 로베르토와 레나타 루만, 브루노와 시몬 리치, 넬라와 레온 베노지요 신경 질환 센터, 생물 의학 이미징 및 유전체학에 대한 헨리 차노흐 크렌터 연구소, 이스라엘 과학 재단 펄만 가족, 아델리스, 마크 베센, 프랫과 어빙 I. 모스코비츠 재단; A. A.는 막스 플랑크 소사이어티, 슈람 재단, 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)의 지원을 받고 있습니다. 3P 심상은 신경과학을 위한 막스 플랑크 플로리다 연구소에 신경 화상 진찰 기술에 고급 과정 도중 취득되었습니다. 신경 이미징 기술에 대한 고급 과정은 막스 플랑크 사회, 플로리다 주 맥스 플랑크 과학 펠로우십 프로그램 및 막스 플랑크 플로리다 연구소 기업 파트너십 프로그램에 의해 지원됩니다. 우리는 과정 동안 2P / 3P 이미징 시스템에 대한 지원 및 장비를 제공하는 Thorlabs, 코히런트 및 스펙트럼 물리학에 감사드립니다. 헨리 헤이벌레와 멜리사 에벌레가 이 과정을 진행하는 동안 이 시스템에 도움을 주신 것에 대해서도 감사드립니다.
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Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
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3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |