Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.
A microscopia de dois fótons é uma ferramenta fundamental para a neurociência, pois permite a investigação do cérebro de animais vivos em escalas espaciais variando de subcelulares a níveis de rede e em escalas temporais de milissegundos a semanas. Além disso, a imagem de dois fótons pode ser combinada com uma variedade de tarefas comportamentais para explorar as relações causais entre a função cerebral e o comportamento. Entretanto, nos mamíferos, a penetração e o espalhamento limitados da luz limitaram a imagem latente intravital do dois-fóton na maior parte às regiões superficiais do cérebro, assim impedindo a investigação longitudinal de áreas do profundo-cérebro tais como o hipocampo. O hipocampo está envolvido na navegação espacial e memória episódica e é um modelo de longa data usado para estudar celulares, bem como processos cognitivos importantes para a aprendizagem e recordação, tanto na saúde e na doença. Aqui, uma preparação que permita o acesso ótico crônico ao hipocampo dorsal em ratos vivos é detalhada. Esta preparação pode ser combinada com a imagem latente ótica do dois-fóton na definição celular e subcellular na cabeça reparada, ratos vivos anestesiados durante diversas semanas. Estas técnicas permitem a imagem latente repetida da estrutura neuronal ou da plasticidade atividade-evocada em dezenas a centenas de neurônios no CA1 hippocampal dorsal. Além disso, esta preparação crônica pode ser usada em combinação com outras técnicas tais como a microendoscopia, a microscopia de campo larga cabeça-montada ou a microscopia do três-fotão, assim expandindo extremamente a caixa de ferramentas para estudar os processos celulares e da rede envolvidos na aprendizagem e na memória.
Em mamíferos, o hipocampo é uma região-chave do cérebro para a codificação e recordação de memórias episódicas, bem como para a navegação espacial1,2,3,4. Por esta razão, o hipocampo tem sido-e ainda é-um modelo muito importante para estudar os mecanismos básicos que permitem que o cérebro para codificar e recordar memórias5,6,7 ou para navegar em um ambiente8 ,9 coletando recompensas e evitando perigos. Além disso, a formação do hipocampal é uma das regiões cerebrais onde novos neurônios são gerados ao longo da vida de roedores10,11 e, possivelmente, de humanos12,13. Finalmente, a degeneração ou o comprometimento da formação do hipocampal estão associados a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo a doença de Alzheimer14.
Em camundongos, o hipocampo está localizado aproximadamente 1 mm abaixo da superfície do cérebro15. Sua posição impediu o acesso ótico no cérebro intacto e conseqüentemente, os estudos longitudinais da dinâmica hippocampal confiaram na maior parte na imagem latente da ressonância magnética (Sr.), na electrofisiologia, e em análises ex vivo da imagem latente. O Sr. métodos da imagem latente permite o seguimento de processos biológicos (por exemplo, mudanças da expressão de gene16) no mesmo animal sobre dias múltiplos, mas falta a definição espacial para discriminar únicos neurônios. As técnicas electrofisiológicas clássicas in vivo oferecem uma resolução temporal muito elevada e uma sensibilidade requintada às alterações do potencial de membrana. No entanto, eles têm uma resolução espacial limitada e eles não têm a capacidade de controlar de forma confiável as mesmas células em períodos de tempo mais longos. A imagem latente ótica permite que os processos mais diversos sejam estudados em virtude de suas resoluções temporais e espaciais elevadas. Entretanto, a imagem latente ex vivo fornece somente instantâneos de processos em curso, e assim não é apropriado para estudos longitudinais durante que os animais aprendem e recordam a informação.
A imagem latente ótica de in vivo combina algumas vantagens do Sr. imagem latente e da electrofisiologia com as aquelas da imagem latente ótica. Conseqüentemente, é muito poço-serido para análises longitudinais e correlativo da dinâmica e do comportamento do cérebro do rato. Isso é relevante em estudos de processos biológicos com escalas de tempo muito rápidas (milissegundos a segundos) ou muito lentas (dias a semanas). Exemplos para tais processos que são relevantes para a neurociência são a dinâmica de tensão de membrana, CA2 + transientes, plasticidade celular e mudanças estruturais, que são todos acreditados para ser muito importante para a formação da memória e recordação. Diferentes métodos ampliaram a imagem latente in vivo para o hipocampo dorsal18,19,20,21,22. As preparações agudas permitiram o rastreamento da atividade do neurônio piramidal (PN), bem como seus dendritos e espinhos dendríticos por várias horas20,22. Este período temporal, entretanto, não permite que as mudanças estruturais a longo prazo, que puderam fundamentam a aprendizagem incremental, sejam estudadas. Preparações crônicas-em combinação com microendoscópios23,24 ou com distância de trabalho longa (WD) os objetivos do microscópio padrão21 -permitiram a imagem latente repetida do hipocampo dorsal sobre diversos Semanas.
Aqui, nós descrevemos uma preparação crônica que forneça o acesso ótico periódico ao secundário-campo CA1 do hipocampo dorsal de ratos vivos usando uma cânula permanentemente introduzida da imagem latente. Esta preparação permite o acesso repetido ao CA1 sem distúrbio funcional e é apropriada para a imagem latente intravital do dois-fotão (2P) ou da epifluorescência do largo-campo. Dois exemplos da imagem latente crônica profunda do cérebro 2P no CA1 dorsal de ratos vivos são detalhados: imagem latente longitudinal da estrutura dendríticas e da dinâmica dendríticas da espinha e da imagem latente longitudinal da plasticidade atividade-evocada. As vantagens e as limitações salientes da técnica são discutidas.
Aqui, um procedimento para a imagem latente repetida de 2P do CA1 dorsal em ratos vivos é descrito. Após a cirurgia, o mouse geralmente se recupera dentro de 2 dias. O procedimento induz a Astrogliose mínima26,43. A hemorragia e o edema que puderam seguir a cirurgia são geralmente re-adsorbed dentro de 10 a 14 dias. Geralmente, a partir de 14 dias após a implantação, a preparação é suficientemente clara para realizar imagens intravitais. O sucesso da cirurgia não depende de trabalhar em um ambiente estéril. No entanto, é crucial manter um alto nível de higiene, para evitar complicações devido a infecções associadas à cirurgia. Isso é obtido por meio da limpeza meticulosa dos instrumentos cirúrgicos antes e após a cirurgia e pelo calor-esterilizando-os imediatamente antes de cada uso (passo 2.1.1). A cânula ótica é mantida em um recipiente limpo, esterilizado e enxaguada com soro fisiológico estéril pouco antes da implantação. A realização de práticas cirúrgicas comuns de desinfecção de mãos e limpeza da estação cirúrgica também é muito importante. A preparação permanece estável e permite imagens de resolução celular e subcelular por várias semanas26,35.
Etapas críticas, modificações e solução de problemas.
É importante descascar a cápsula externa até que as fibras mais profundas sejam expostas. A não exposição do alveus pode resultar na incapacidade de se concentrar no soma de PNS, ou em espinhas dendríticas de imagem de resolução reduzida, ao usar objetivos comerciais com WD de 3 ou 4 mm. Para este objetivo, é útil para ablação o neocórtex muito lentamente usando uma agulha de 0,9 mm de diâmetro e, em seguida, mudar para uma agulha de 0,3-0,5 mm de diâmetro (24-29 gauge) para um controle mais fino de sucção ao remover as fibras mais dorsal. Alternativamente, o fórceps fino pode ser usado para remover o córtice restante após a exposição da fibra36.
Sangramento durante a cirurgia pode ser problemático, como o sangue obstrui a visão. À espera do coágulo para formar e, em seguida, enxaguar com soro fisiológico para lavar afastado sangue residual é recomendado. Repita o que for necessário.
Um ajuste confortável entre a cânula e a craniotomia ajuda a aumentar a estabilidade da preparação, mantendo a cânula no lugar antes da aplicação do cimento, especialmente se a borda externa da cânula é nivelada com o crânio. Desde que os tamanhos da broca do trephine e da cânula são combinados, um ajuste frouxo pode levantar-se por causa das irregularidades no lado da cânula-que exigem craniotomias ligeiramente maiores caber (veja a etapa 2.3.14)-ou de uma craniotomia irregular. Todas as irregularidades da cânula devem ser arquivadas fora (etapas 1,3 e 1,12) e o trephine deve ser prendido perpendicular ao crânio até que a craniotomia esteja terminada (etapa 2.3.12). Removendo o trephine do crânio antes que a craniotomia esteja terminada pode conduzir às craniotomias irregulares.
Limitações- Invasividade e estabilidade da preparação.
É difícil avaliar o efeito da ablação cortical, pois é árdua definir com precisão as áreas afetadas direta e indiretamente. Em geral, a cirurgia remove parte do córtex parietal e parte do córtex sensorial do Visual e do retromembro21. O córtex ablado não projectou diretamente para o hipocampo e o tecido hipocampal não é tocado nem ferido. Importante, mostrou-se que a implantação de uma cânula da imagem latente não altera grosseiramente a função hippocampal e especificamente a aprendizagem hippocampal-dependente21,36,37,38, 39. Ainda assim, seria importante quantificar até que ponto a cânula e a parte externa do implante (placa de suporte principal e tampão acrílico dental) são estressores crônicos avaliando os níveis sanguíneos de corticosterona e o peso da glândula adrenal em comparação com ratos não implantados.
A preparação geralmente permanece estável de semanas a meses26. A longo prazo, o crescimento da pele e do osso tendem a deslocar a tampa acrílica e a aumentar a instabilidade da preparação da imagem latente.
Limitações ópticas.
A microscopia convencional de 2P permite a imagem latente até aproximadamente 1 milímetro profundamente no tecido neokortikalny40,41. Consistente com isso, é possível a imagem dendritos e espinhos dendríticos localizados no SR (Figura 2D-F) ou SLM36. Entretanto, a imagem latente através de uma cânula levanta limitações ao NA eficaz. Para atingir a resolução máxima, o diâmetro e a profundidade das cânulas de imagem devem ser combinados com a imagem NA, pois diâmetros menores e profundidades mais longas irão grampear a luz dos objetivos de alta NA. Por exemplo, quando a imagem latente com um objetivo da imersão da água de 1,0 NA através de uma cânula longa de 1,6 milímetros, um diâmetro interno de 3,65 milímetros é necessário para manter o NA completo. Entretanto, usar uma cânula deste diâmetro aumentará a compressão no hipocampo e pôde afetar a saúde do tecido, por esta razão, nós usamos uma cânula com um diâmetro menor. Quando a imagem latente com um objetivo da imersão da água de 0,8 NA através de uma cânula longa de 1,6 milímetros, um diâmetro interno de 2,5 milímetros seria suficiente para manter o NA completo. No entanto, os objetivos de imersão NA água 0,8 NA têm uma WD mais curta (3 mm no nosso caso), o que pode impedir a focagem no SP.
Estes cálculos aplicam-se ao centro do campo de visão na parte inferior da cânula. No entanto, movendo o campo de imagem de visão lateralmente-mais perto das bordas da cânula-ou concentrando-se mais profundamente no tecido-mais longe da superfície de vidro da cânula-diminui ainda mais o eficaz na no plano focal e, assim, reduz a resolução. Isto conduzirá à definição não-homogênea através dos volumes diferentes de tecido imaged e pode ser uma preocupação para a imagem latente quantitativa na definição subcellular, especial ao usar técnicas da super-definição tais como a microscopia 2P-STED42. Estas edições são menos importantes quando imagem latente na definição celular.
Movimento tecidual.
O movimento dentro do tecido-originando da respiração e do batimento cardíaco em animais anestesiados-tende a tornar-se mais severo com distância aumentada da cânula da imagem latente. Isto é possivelmente porque a cânula da imagem latente aplica a pressão mecânica ao cérebro que contraindo assim algum do movimento na vizinhança da cânula (similarmente às preparações neokortikalny). Assim, embora a imagem latente de espinhas dendríticas seja possível em Sr e em SLM, em nossas mãos, é dorsal o mais robusto ao so até ≈ 200 μm da superfície da cânula. Para compensar o movimento, usamos scanners ressonantes e média offline. Várias imagens (4 a 6 repetições) são adquiridas por plano de imagem de uma pilha z na velocidade máxima disponível (30 frames/s). Todas as repetições para cada plano z são então desvolvido (usando o software comercial, AutoQuant), registrado (usando ImageJ) e em média em uma única imagem26. Para a imagem latente dos SOMATA, o movimento é frequentemente insignificante em cima da anestesia35 e duas médias são frequentemente suficientes compensar artefatos do movimento.
Futuras aplicações ou direções do método .
A preparação pode ser combinada com microendoscópios26,43. Os micro-endoscópios são pontas de prova ópticas rígidas que usam microlentes do índice refração do inclinação (grin) para guiar a luz a e do tecido profundo18. O uso de microendoscópios permite cânulas de diâmetros menores ou mesmo sem cânulas. No entanto, microendoscópios comerciais são menos bem corrigidos para aberrações ópticas e têm menor NA do que os objetivos comerciais. As sondas atuais atingem resoluções laterais e axiais de ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respectivamente17,18,44. O uso de microendoscópios também possibilita a combinação desta preparação com os microscópios integrados de campo Widefield45,46,47.
O método presta-se igualmente para usar-se em ratos não-anestesiados, e tem sido usado para investigar a atividade celular usando sensores de CA2 + em ratos cabeça-fixos acordados21,37,48,49. Nesses casos, devido às escalas de tempo rápido das mudanças de fluorescência, é aconselhável implementar o registro de linha50. Também é possível adaptar a preparação para imagens de outras sub-regiões hipocampais, como o giro dentado (DG)39,51,52. Combinando esta preparação com 3P excitação53,54 com 1 MHz freqüência pulsada laser sintonizado para 1400 nm, fomos capazes de imagem mais profunda na formação do hipocampal atingindo a camada molecular, camada de células de grânulo e os da DG (Figura 4) sem retirar o CA1 sobrepondo.
Em conclusão, apresentamos um método que fornece acesso óptico ao hipocampo dorsal e permite estudos longitudinais e correlativos da dinâmica da estrutura e atividade do hipocampal. Essa técnica amplia as possibilidades de análise da função hipocampal condições fisiológicas e patológicas.
The authors have nothing to disclose.
A U. A. F. é apoiada pela Fundação Schram; C.-W. T. P. e W. G. são apoiados pela sociedade Max Planck; L.Y. e R.Y. são apoiados pela sociedade Max Planck e Instituto Nacional de saúde (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. é apoiada por uma subvenção do 7º PQ do Conselho Europeu de investigação, dos programas ERANET e I-CORE, do gabinete cientista-chefe do Ministério da saúde de Israel, do Ministério Federal da educação e da investigação, Roberto e Renata Ruhman, Bruno e Simone Lich, o Nella e Leon Benoziyo centro de doenças neurológicas, o Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, a Fundação de ciência de Israel a família Perlman, adelis, Marc Besen, Pratt e Irving I. fundações Moskowitz; A. a. é apoiada pela sociedade Max Planck, pela Fundação Schram e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). As imagens 3P foram adquiridas durante o curso avançado de técnicas de neuroimagem no Max Planck Florida Institute for Neuroscience. O curso avançado de técnicas de neuroimagem é apoiado pela sociedade Max Planck, o programa de bolsa científica da Florida State Max Planck e pelo programa de parceria da Max Planck Florida Institute Corporation. Gostaríamos de agradecer a Thorlabs, coerente e SpectraPhysics para fornecer suporte e equipamentos para o sistema de imagem 2P/3P durante o curso. Estamos também gratos a Henry Haeberle e Melissa Eberle para obter assistência com o sistema durante o curso.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |