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Immunology and Infection

एकल-टी सेल या इम्यूनोलॉजिकल सिंगल-सेल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए सिंगल-पार्टिकल के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोप कैनटाइलवर्स का कार्यात्मककरण

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59609
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

Summary

हम एक एकल टी सेल और प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए मनका कण के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) cantilevers functionalize करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। AFM द्वारा एकल जोड़ी टी सेल-डेन्ड्रिटिक सेल बाइंडिंग की जांच करने के लिए और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एएफएम द्वारा एक ठोस कण के लिए मैक्रोफेज की वास्तविक समय सेलुलर प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए प्रक्रियाओं दिखाए जाते हैं।

Abstract

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी आधारित एकल सेल बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (AFM-SCFS) जीवित कोशिकाओं के biophysical गुणों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. इस तकनीक एक जीवित कोशिका झिल्ली पर बातचीत ताकत और गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति देता है, कोशिकाओं के बीच उन सहित, रिसेप्टर और ligands, और कई अन्य विविधताओं के साथ. यह भी एक spatiotempoly नियंत्रित तरीके से एकल कोशिकाओं पर एक भौतिक या जैव रासायनिक उत्तेजना देने के लिए एक तंत्र के रूप में काम करता है, इस प्रकार विशिष्ट सेल सक्रियण और बाद में सेलुलर घटनाओं वास्तविक समय में नजर रखी जा करने की अनुमति जब लाइव सेल के साथ संयुक्त प्रतिदीप् ति इमेजिंग. उन AFM-SCFS माप में महत्वपूर्ण कदम AFM-cantilver functionalization है, या दूसरे शब्दों में, cantilever के लिए ब्याज का एक विषय संलग्न. यहाँ, हम प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए क्रमशः एक टी सेल और एक एकल polystyrene मनका के साथ AFM cantilevers को संशोधित करने के लिए तरीकों मौजूद है. पूर्व एक bioसंगत गोंद है कि जोड़ों एक समाधान में एक फ्लैट cantilver की नोक करने के लिए एकल टी कोशिकाओं शामिल है, जबकि बाद हवा के वातावरण में एकल मनका आसंजन के लिए एक epoxy गोंद पर निर्भर करता है. दो प्रतिरक्षा अनुप्रयोगों प्रत्येक cantilver संशोधन के साथ जुड़े के रूप में अच्छी तरह से प्रदान की जाती हैं. यहाँ वर्णित विधियों को आसानी से विभिन्न प्रकार के सेल और ठोस कणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), एक बहुमुखी उपकरण, सेल जीव विज्ञान अनुसंधान1,2,3,4,5में कई अनुप्रयोगों पाया गया है। इसकी उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग क्षमता के अलावा, मूल बल-प्रस्तावित सुविधा जीवित कोशिकाओं के जैवभौतिक गुणों की एकल-कोशिका स्तर6,7पर सीधे सिटू में जांच करने की अनुमति देती है। इनमें उपकोशिकीय संरचनाओं या यहां तक कि पूरी कोशिकाओं की कठोरता8,9,10,11,12, विशिष्ट लिगन्ड/ कोशिका पृष्ठ13पर एकल अणु स्तर तथा आसंजन बल ठोस कणों तथाकोशिकाओं के एकल-युग्मों के बीच अथवा दो कोशिकाओं 1,2,14,15के बीच होते हैं। बाद के दो अक्सर एकल कोशिका बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं (SCFS)16. विभिन्न वसंत निरंतर के साथ आसानी से उपलब्ध cantilevers के कारण, AFM के लिए सुलभ बल रेंज बल्कि कुछ piconewtons से व्यापक है (pN) micronewtons के लिए ($N), जो पर्याप्त रूप से सेलुलर कुछ दसियों से बलों को शामिल घटनाओं की पूरी रेंज को शामिल किया गया पीएएन की, जैसे रिसेप्टर-आधारित एकल-अणु बंधन, एन एन के लिए, जैसे कि फैगोसाइटिक सेलुलर इवेंट15। इस बड़े गतिशील बल रेंज AFM ऑप्टिकल / चुंबकीय चिमटी और एक biomembrane बल जांच के रूप में अन्य बल-प्रोबेक्ट तकनीकों पर फायदेमंद बनाता है, के रूप में वे कमजोर बल माप के लिए अधिक उपयुक्त हैं, बल के साथ आम तौर पर कम से कम 200 pN17 , 18. इसके अतिरिक्त , एएफएम एक उच्च परिशुद्धता हेरफेर के रूप में कार्य कर सकता है ताकि एकल कोशिकाओं पर विभिन्न उत्तेजनाओं को एक spatiotempoly परिभाषित तरीके से4,19में वितरित किया जा सके . यह वास्तविक समय एकल सेल सक्रियण अध्ययन के लिए वांछनीय है. लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ संयुक्त, विशिष्ट उत्तेजना के लिए बाद में सेलुलर प्रतिक्रिया समवर्ती नजर रखी जा सकती है, इस प्रकार AFM आधारित SCFS बेहद मजबूत बनाने के रूप में ऑप्टिकल इमेजिंग सेलुलर संकेतन की जांच करने के लिए एक व्यावहारिक उपकरण प्रदान. उदाहरण के लिए, एएफएम का उपयोग ऑस्टियोब्लास्ट्स20में कैल्शियम के क्षणिकों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक उपभेदों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इस काम में, कैल्शियम यात्रियों को एक AFM टिप के साथ सुसंस्कृत ऑस्टियोब्लास्ट्स पर स्थानीय बलों के आवेदन के बाद कैल्शियम अनुपातइमेजिंग के माध्यम से फ्लोरोसेंट ट्रैक किया गया। हाल ही में, AFM कोलेजन फाइब्रिल्स जिस पर यकृत stellate कोशिकाओं (HSC) बड़े हो रहे थे और इस mechano-transduced HSC सक्रियण वास्तविक समय एक फ्लोरोसेंट एस आरसी biosensor, जिसका फॉस्फोरिलेशन द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में द्वारा निगरानी की गई थी खींच करने के लिए नियोजित किया गया था बायोसेंसर की प्रतिदीप्ति तीव्रता एचएससी सक्रियण3से संबंधित है।

AFM आधारित SCFS प्रयोगों में, AFM cantilevers के उचित functionalization सफल माप की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है. चूंकि हमारे अनुसंधान ब्याज प्रतिरक्षा कोशिकाओं सक्रियण पर केंद्रित है, हम नियमित रूप से इस तरह के एक ठोस कणों कि phagocytosis को गति प्रदान कर सकते हैं और / , 15 और एकल टी कोशिकाओं है कि प्रतिजन पेश कोशिकाओं के साथ एक प्रतिरक्षा synapse फार्म कर सकते हैं, जैसे सक्रिय डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी)2. एकल ठोस कणों को आम तौर पर हवा के वातावरण में एक epoxy गोंद के माध्यम से एक cantilver करने के लिए युग्मित कर रहे हैं, जबकि एकल टी कोशिकाओं, उनके गैर चिपकने वाला प्रकृति के कारण, समाधान में एक bioसंगत गोंद के माध्यम से atilever करने के लिए functionalized हैं. यहाँ, हम cantilver संशोधन के इन दो प्रकार के प्रदर्शन और दो संबद्ध अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से देने के लिए तरीकों का वर्णन. पहला आवेदन सेल यांत्रिकी दृष्टिकोण से नियामक टी कोशिकाओं के दमनकारी तंत्र को समझने के लिए एएफएम-एससीएफएस के साथ टी सेल/डीसी बातचीत की जांच करना है। दूसरा एक जीवित सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एएफएम के संयोजन शामिल है वास्तविक समय में एक ठोस कण के लिए मैक्रोफेज की सेलुलर प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए रिसेप्टर स्वतंत्र फॉस्फेटीलिनोसिटोल के आणविक तंत्र प्रकट 4,5-bisphosphate (PIP2)- मोसिन मध्ये फागोसाइटोसिस. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ रूपरेखा प्रदान करने के लिए डिजाइन और प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए AFM आधारित एकल सेल विश्लेषण के साथ अपने स्वयं के प्रयोगात्मक सेटिंग्स को लागू करने के लिए है.

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Protocol

माउस प्रयोग प्रोटोकॉल Tsinghua विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशा निर्देशों का पालन करता है

1. एकल टी कोशिकाओं के साथ Cantilver कार्यात्मककरण

  1. माउस तिल्ली कोशिकाओं की तैयारी
    1. माउस बलिदान (8-16 उम्र के सप्ताह (या तो सेक्स); उदा., C57BL/6 तनाव) कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद.
    2. 75% इथेनॉल के साथ माउस को साफ और एक midline त्वचा चीरा splenectomy के बाद बनाते हैं.
    3. पीबीएस के 4 एमएल में तिल्ली को 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) कांच की स्लाइडों का उपयोग करके और 70 डिग्री जाल नायलॉन छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करके समुच्चय और मलबे को हटा दें।
    4. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनेंट को त्याग दें और 2 एमएल लाल रक्त कोशिका lysis बफर (कमरे के तापमान पर संतुलित) में कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए समाप्त करें। पीबीएस समाधान के 8 एमएल जोड़कर lysis प्रतिक्रिया को समाप्त करें।
    5. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और पीबीएस में 1 x 108 सेल/एमएल के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से तैयार करें जिसमें 2% एफबीएस और 1 एमएम ईडीटीए (समाधान ए के रूप में लेबल किया गया है), आमतौर पर 0.25-2 एमएल सेल घनत्व के आधार पर। एक 5 एमएल (12 x 75 मिमी) polystyrene दौर नीचे ट्यूब के लिए resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण.
  2. माउस CD4 + टी कोशिकाओं की तैयारी
    1. 50 डिग्री सेल्सियस/एमएल चूहा सीरम जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें ) और 50 डिग्री एल/एमएल सीडी 4 + टी सेल अलगाव कॉकटेल (सामग्री की तालिकादेखें) चरण 1.1.5 से प्राप्त सेल नमूने के लिए। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिक्स और इनक्यूबेट करें।
    2. भंवर शेयर streptavidin लेपित चुंबकीय कण समाधान (सामग्री की मेजदेखें) के लिए 30 s या जब तक कणों समान रूप से बिखरे हुए दिखाई देते हैं.
    3. सेल नमूने में 75 डिग्री सेल्सियस/एमएल स्ट्रेप्टाविडिन-कोटेड चुंबकीय कणों को जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2.5 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    4. सेल के नमूने को 2.5 एमएल तक ऊपर करने के लिए समाधान A जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे 2-3 बार के लिए पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें।
    5. चुंबक में नमूना ट्यूब (बिना ढक्कन के) रखें (सामग्री की तालिकादेखें) और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ध्यान से एक नया 5 एमएल polystyrene दौर नीचे ट्यूब में समृद्ध सेल निलंबन डालना.
    6. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। अतिनैंट को त्याग दें और समृद्ध टी कोशिकाओं को समाधान ए के 500 डिग्री एल में पुन: तैयार करें।
      नोट: समृद्ध CD4 + टी कोशिकाओं दोनों पारंपरिक और नियामक टी कोशिकाओं होते हैं।
  3. नियामक टी कोशिकाओं पारंपरिक टी कोशिकाओं से जुदाई
    1. चरण 1-2-6 से प्राप्त समृद्ध टी सेल नमूने में FcR अवरोधक का 25 $ल जोड़ें (सामग्री की सारणीदेखें)। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    2. टी सेल के नमूने में नियामक टी सेल सकारात्मक चयन कॉकटेल का 25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिक्स और इनक्यूबेट करें।
    3. पीई चयन कॉकटेल के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) टी सेल नमूने के लिए. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    4. 30 s के लिए या कणों समान रूप से बिखरे हुए दिखाई देते हैं जब तक स्टॉक डेक्सट्रन लेपित चुंबकीय कण समाधान भंवर (सामग्री की तालिकादेखें)।
    5. टी सेल नमूने के लिए डेक्सट्रन लेपित चुंबकीय कणों के 10 डिग्री एल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    6. 2.5 एमएल में टी सेल के नमूने को टॉप अप करने के लिए समाधान A जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे 2-3 बार के लिए पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
    7. टी सेल नमूना ट्यूब (बिना ढक्कन) चुंबक में रखें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए supernatant डालना.
      नोट: supernatant समृद्ध पारंपरिक CD4 + टी कोशिकाओं में शामिल हैं।
    8. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर समृद्ध पारंपरिक CD4+ टी कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और 4 एमएल RPMI1640 में कोशिकाओं को पुन: असाइन करें जिसमें 10% एफबीएस, 0.05 एमएम जेड-मरकैप्टोथेनोल, 0.01 एम एचईपी और 1% पेनिसिलिन/
    9. ट्यूब जिसमें नियामक टी कोशिकाओं चुंबक से समृद्ध कर रहे हैं निकालें. 2.5 एमएल हलहल A को ट्यूब में मिलाकर 2-3 बार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे डालकर मिलाइए। ट्यूब चुंबक में वापस रखो, 5 मिनट के लिए incubate, और फिर ध्यान से बंद डालना और supernatant त्यागें. इस चरण को तीन बार दोहराएँ.
    10. मध्यम बी के 2 एमएल में समृद्ध नियामक टी कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    11. दोनों शुद्ध पारंपरिक टी कोशिकाओं और नियामक टी कोशिकाओं के साथ 100 U/mL आईएल -2 रात भर या कम से कम 4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ cantilever functionalization के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से पहले.
  4. डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं की तैयारी
    1. पिरान्हा समाधान तैयार करें, 30% एच2ओ2 (30%) का मिश्रण और 70% एच2SO4 (conc) (v/ धीरे-धीरे लगातार हिलाते हुए और ठंडा होने के कारण 3 एमएल H2O2 को 7 एमएल H2SO4 में डाल दिया जाता है।
      चेतावनी: पिरान्हा समाधान अत्यधिक संक्षारक है, और यह शरीर के ऊतकों को जला और नष्ट कर सकता है। इसलिए, यह एक हुड के तहत पिरान्हा समाधान का उपयोग करें और उचित सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए सुरक्षित है, के रूप में मिश्रण बीकर के आसपास छप जाएगा. उपयोग के बाद पीएच 7 के लिए NaOH के साथ समाधान को बेअसर।
    2. पिरान्हा के घोल में 24 मिमी व्यास के गिलास कवरस्लिप को 30 मिनट के लिए विसर्जित करें और बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें।
    3. ठंड कीटाणुशोधन के लिए 30 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में नुकीले च्मिज़ की एक जोड़ी डुबकी.
    4. चीत्व द्वारा एक 6-वेल संस्कृति प्लेट में साफ ग्लास coverslips परिचय।
    5. एक 6 सेमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान जिसमें DC2.4 कोशिकाओं मध्यम बी के 4 एमएल और aspirate सभी माध्यम के साथ पूर्व-संस्कृत थे झुकाव। DC2.4 कोशिकाओं कुल्ला और पीबीएस त्याग करने के लिए संस्कृति पकवान में पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें. इस rinsing कदम दो बार दोहराएँ.
    6. 2 मिनट के लिए संस्कृति पकवान में 0.25% trypsin EDTA के 1 एमएल जोड़ें. एंजाइम पाचन प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए इस डिश में मध्यम बी के 1 एमएल जोड़ें. पचे हुए सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और मध्यम बी में 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर DC2.4 कोशिकाओं को पुन: स्फूर्त करें।
    8. कांच पर बीज DC2.4 कोशिकाओं चरण 1.4.4 पर तैयार लिपियों को कवर और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट .
      नोट: दो एकल कोशिकाओं के बीच बातचीत बलों को मापने के लिए, DC2.4 कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम एकाग्रता (यानी, और 10% संगम) कोशिकाओं के बीच एक उचित रिक्ति के लिए आवश्यक है.
  5. एएफएम कैन्टीलवर तैयारी
    नोट: Cantilevers कि एकल सेल बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं कम वसंत स्थिरांक के साथ उन लोगों को कर रहे हैं, आम तौर पर की सीमा में 0.01-0.06 N/ यहाँ, नरम टिप-कम cantilevers एकल कोशिकाओं और एकल ठोस कणों functionalization के लिए पसंद कर रहे हैं.
    1. पिरान्हा उपचार या प्लाज्मा या यूवी-ओजोन सफाई द्वारा कैनटाइलवर्स को साफ करें।
    2. AFM स्कैनिंग सिर करने के लिए साफ cantilver माउंट.
    3. शुद्ध पानी से भरा एक साफ नमूना कक्ष तैयार करें और पहले संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए कांच सब्सट्रेट पर एक बल वक्र चलाने के द्वारा पानी के समाधान में cantilver जांचना (आ वक्र के प्रतिकर्षण भाग पर रैखिक फिट की ढलान) और फिर AFM के अनुदेश पुस्तिका के अनुसार वसंत निरंतर निकालने के लिए एक थर्मल शोर स्पेक्ट्रम रिकॉर्डिंग.
    4. AFM स्कैनिंग सिर समाधान से निकालें, शुद्ध इथेनॉल की कुछ बूंदों के साथ घुड़सवार cantilver धोने, और स्कैनिंग सिर पर cantilver सूखी रखने के लिए.
  6. कैन्टीलीवर के लिए एकल टी कोशिकाओं संलग्न
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ रहने वाले सेल पर्यावरण बाड़े को प्रीहीट करें।
    2. एक नमूना कक्ष विधानसभा के लिए चरण 1.4.8 से उस पर हो DC2.4 कोशिकाओं के साथ कांच coverslip माउंट, तुरंत कक्ष में मध्यम बी के 600 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए, और फिर AFM नमूना चरण पर विधानसभा डाल दिया.
    3. आईएल-2 इनक्यूबेट ्डेड सीडी 4+ टी कोशिकाओं (या तो पारंपरिक या नियामक टी कोशिकाओं) को नमूना कक्ष में जोड़ें।
      नोट: कुल नमूना वॉल्यूम 1 एमएल से अधिक नहीं होना चाहिए।
    4. अतिरिक्त CD4+ T कक्ष पूरी तरह से कवरस्लिप के नीचे बस जाने तक प्रतीक्षा करें.
      नोट: एयर बुलबुले प्रयोग करने के लिए बड़ी अशांति का कारण होगा, इसलिए, यह step1.6.2 और 1.6.3 में किसी भी हवा बुलबुले से बचने के लिए सलाह दी जाती है.
    5. चित्र 1 में दिखाए गए के रूप में एक pippette के साथ घुड़सवार cantilver के अंत पर bioसंगत गोंद के 2 डिग्री एल की एक बूंद जोड़ें और फिर जल्दी से नमूना चरण पर स्कैनिंग सिर जगह है, इस प्रकार दे cantilever bioसंगत गोंद के साथ लेपित immerse में समाधान.
      चेतावनी: पिपेट टिप के साथ ग्लास ब्लॉक या कैंटिलवर को न छुएं। चूंकि यहाँ इस्तेमाल किया bioसंगत गोंद हवा में ऑक्सीकरण के लिए प्रवण है, इस कदम के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए.
    6. नमूना चरण ले जाकर माइक्रोस्कोप के नीचे मोटे तौर पर कैन्टीलवर की नोक के नीचे एक स्वस्थ टी सेल का पता लगाएँ और फिर स्कैनिंग सिर को ले जाकर स्थिति को सूक्ष्म रूप से समायोजित करें।
      नोट: एक स्वस्थ CD4 + टी सेल आम तौर पर एक अपेक्षाकृत बड़े आकार, चिकनी किनारों, और ऑप्टिकली ट्रांसरेमिसिंग उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग में है।
    7. चरण-आकार से शुरू होने वाले चरण-आकारों के साथ मैन्युअल रूप से कम करें 10, 5, 2 और 0.5 $m धीरे-धीरे stepper मोटर्स को नियंत्रित करके. stepper मोटर्स की स्थिति पकड़ो और cantilver टिप और सेल के बीच बेहतर संरेखण के लिए स्कैनिंग सिर की स्थिति को समायोजित, एक बार cantilver लक्ष्य टी सेल के साथ एक फर्म संपर्क बनाता है के रूप में लेजर बीम के एक छोटे से विस्थापन द्वारा संकेत दिया 0ण्5ण्5-1ण् 0-1-5 एन के एक विशिष्ट बल श्रेणी से संबंधित फोटोडिटेक्टर में स्थिति।
      नोट: यह चरण भी सेट-पॉइंट (सेल के लिए लागू बल) और संपर्क समय सॉफ्टवेयर में अच्छी तरह से परिभाषित किया जा सकता है जिसमें एक एकल बल माप चलाने के द्वारा किया जा सकता है। हालांकि, टी कोशिकाओं के गैर चिपकने वाला प्रकृति के कारण, मैनुअल दृष्टिकोण लक्ष्य को नियंत्रित करने में अधिक लचीलापन प्रदान करता है, स्थिति, और संपर्क समय से स्वत: आ करता है और यह टी सेल आसंजन के लिए मज़बूती से काम करता है. भविष्य प्रयोगात्मक दोनों मैनुअल और स्वत: आ पता लगाने के लिए जो ब्याज की अपनी प्रणालियों के लिए बेहतर काम करता है की कोशिश करनी चाहिए.
    8. संपर्क के 30 s के बाद cantilver वापस लें.
      नोट: यदि कक्ष cantilver के साथ चलता है, तो अनुलग्नक सफल होता है। यदि नहीं, तो चरण 1.6.6 दोहराएँ, लेकिन किसी भिन्न T कक्ष पर. जैव संगत गोंद आसानी से ऑक्सीकरण है. चरण 1.6.5-1.6.7 5 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए. इसके अलावा, यदि वही कैन्टीलवर टी सेल अनुलग्नक के लिए तीन बार विफल रहता है, तो एक नया कैन्टीलवर का उपयोग किया जाना चाहिए, और अनुलग्नक प्रक्रिया चरण 1.5.2 से फिर से शुरू होनी चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: घुड़सवार कैन्टीलवर पर bioसंगत गोंद की एक छोटी सी बूंद जोड़ने के Schematic प्रतिनिधित्व. cantilever कांच ब्लॉक धारक है कि AFM स्कैनिंग सिर पर स्थापित किया गया है पर एक clamping वसंत के माध्यम से घुड़सवार है (यहाँ तैयार नहीं). स्कैनिंग सिर एक समतल सतह पर खड़ा है, जब cantilver ड्राइंग में दिखाया गया है के रूप में खड़ी उन्मुख है। के बारे में 2 $L bioसंगत गोंद एक माइक्रो-पिपेट के साथ cantilver की नोक करने के लिए जोड़ा जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एकल जोड़ी टी सेल की फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी /
    नोट: सेल / सेल बातचीत की जांच करने के लिए, एक AFM के साथ एक $ रेंज पारंपरिक 10-15 डिग्री मीटर से बड़ा क्रम में पूरी तरह से दो कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है. यहाँ प्रयुक्त एएफएम में 100 डिग्री मीटर की सीमा है, जो सेल/सेल संपर्क के बाद डेन्ड्रिटिक सेल से टी सेल को अलग करने के लिए पर्याप्त है।
    1. नमूना चरण और/अथवा स्कैनिंग शीर्ष को ले जाकर संलग्न टी सेल को एक अलग DC2.4 कक्ष के ऊपर रख दें (चित्र 2देखें ).
    2. उचित पैरामीटर सेट करें और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी चलाएँ.
      नोट: निम्न कुंजी सेटिंग्स आम तौर पर उपयोग किया जाता है: Setpoint 0.5 एनएन, लंबाई खींच 50 डिग्री, $ आंदोलन लगातार गति, गति बढ़ाएँ 5 $m/s, संपर्क समय 10 s, देरी मोड लगातार बल. प्रत्येक टी-डीसी युग्मों के लिए, बल वक्रों की 20 दोहराव एकत्र की जाती हैं तथा निम्नतम 14 बल वक्रों का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए किया जाता है।
    3. माउंट एक नया साफ cantilver, यह चरण 1.5.3 में के रूप में शुद्ध पानी में जांचना, और एक अलग टी-डीसी जोड़ी के लिए चरण 1.6 और 1.7 दोहराने के लिए एक ही टी-डीसी कोशिकाओं के नमूने के लिए वापस जाओ। प्रत्येक शर्त के लिए कम से कम 5 जोड़े की जांच करें।

Figure 2
चित्र 2: एक टी सेल और डीसी के बीच बल-जांच का प्रायोगिक विन्यास। (ए) प्रायोगिक विन्यास का योजनाबद्ध आरेखण जिसमें कैन्टीलवर से संबद्ध एक टी सेल को बल-जांच के लिए सबस्ट्रेट पर उगाए गए डीसी में लाया जाता है। (बी) एक टी सेल-कार्यात्मक कैन्टीलवर और एक डीसी की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल बार, 20 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. एकल पॉलीस्टाइरीन मोती के साथ कैन्टीलवर कार्यीकरण

  1. एकल मोती तैयारी
    1. 100% इथेनॉल में 6 डिग्री मीटर पॉलीस्टाइरीन मोती के स्टॉक निलंबन को कम करें।
      नोट: पतला मोती समाधान की एकाग्रता काफी कम होना चाहिए ताकि जब एक गिलास coverslip सतह में जोड़ा, व्यक्तिगत मोती अच्छी तरह से विलायक वाष्पीकरण के बाद महत्वपूर्ण क्लस्टरिंग के बिना अलग कर रहे हैं.
    2. इथेनॉल के साथ 24 मिमी व्यास ग्लास कवरस्लिप को साफ करें और एन2 हवा के प्रवाह से किसी भी धूल को हटा दें।
    3. एक नमूना कक्ष विधानसभा के लिए साफ ग्लास coverslip माउंट और माइक्रोस्कोप पर विधानसभा डाल दिया।
    4. बाईं ओर पतला मोती समाधान की एक बूंद रखो, लेकिन coverslip के केंद्र के करीब (चित्रा 3देखें ) और एक 20x उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप के तहत उज्ज्वल क्षेत्र में विलायक वाष्पीकरण के बाद मोती के बीच रिक्ति की जाँच करें. यदि अलग-अलग मोती अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
    5. एक micropipette टिप या एक अच्छी तरह से मिश्रित epoxy गोंद में एक टूथपिक डुबकी और फिर सही पक्ष पर लगातार कोमल छू के साथ तीन अलग अलग स्थानों पर इस तरह के गोंद की एक छोटी राशि हस्तांतरण लेकिन coverslip के केंद्र के करीब.
      नोट: तीन गोंद स्पॉट खड़ी गठबंधन किया जाना चाहिए (चित्र 3देखें). गोंद की कम से कम राशि के साथ अंतिम स्थान बाद में इस्तेमाल किया जाएगा.

Figure 3
चित्र 3: एक-मोद के कार्य प्रवाह के लिए कार्य प्रवाह का Schematic प्रतिनिधित्व cantilver पर कार्यीकरण. अच्छी तरह से अलग micron आकार मोती सब्सट्रेट के बाईं ओर तैयार कर रहे हैं और epoxy गोंद की एक छोटी राशि के माध्यम से सब्सट्रेट के दाईं ओर स्थानांतरित कर दिया है 3 लगातार कोमल छू, 3 गोंद धब्बे में जिसके परिणामस्वरूप. केवल गोंद के कम से कम राशि के साथ अंतिम स्थान (एक चक्र द्वारा इंगित) cantilver के बहुत अंत कोट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बाईं ओर से गोंद में cantilever दृष्टिकोण और फिर cantilver पिछड़े कदम एक बार यह गोंद में डूब जाता है के लिए cantilver के बहुत अंत में गोंद सीमित है. लक्ष्य मनका cantilver के नीचे लाने के लिए और उन्हें ठीक से संरेखित करने से पहले एक फर्म से संपर्क करें (आमतौर पर 2-5 एनएन) मनका आसंजन के लिए. जब मनका सफलतापूर्वक कैन्टीलवर पर कार्यात्मक है, एक नया cantilver एक नया functionalization चक्र शुरू करने के लिए घुड़सवार किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एएफएम कैन्टीलवर तैयारी
    1. AFM स्कैनिंग सिर के लिए एक साफ टिप-कम cantilver माउंट.
    2. वसंत स्थिरांक प्राप्त करने के लिए एक साफ सतह के साथ हवा में इस cantilver कैलिब्रेट करें।
  2. कैन्टीलवर के लिए एकल मोती संलग्न करना
    1. चित्र 3 में दर्शाए अनुसार अंतिम एपॉक्सी गोंद स्थान की बाईं सीमा पर कैन्टीलवर टिप को स्थिति दें।
    2. छोटे कदम आकार के साथ stepper मोटर्स को कम करके धीरे धीरे गोंद के करीब cantilver लाओ.
    3. टिप गोंद में डूब जाता है मैन्युअल रूप से एक बार AFM स्कैनिंग सिर पीछे (बाएं करने के लिए) ले जाकर बाद में गोंद से दूर तेजी से दूर खींचो.
      नोट: सुनिश्चित करें कि गोंद की केवल एक छोटी राशि टिप के बहुत अंत का पालन करता है. यदि नोक पर अत्यधिक गोंद है, यह एक खाली सतह पर टिप फिसलने के बाद छू द्वारा गोंद की मात्रा को कम करने के लिए संभव है.
    4. एक अच्छी तरह से अलग एकल मनका के शीर्ष पर cantilver टिप ले जाएँ.
    5. धीरे-धीरे एकल मनका के लिए cantilver दृष्टिकोण और मनका के साथ एक फर्म संपर्क बनाने के लिए (के रूप में photodetector में लेजर बीम स्थिति के विस्थापन द्वारा संकेत दिया 2-5 एन एन की एक विशिष्ट बल रेंज के लिए इसी) के बारे में 10 s के लिए जिसके दौरान टी का एक अच्छा समायोजन आईपी स्थिति बाद में बेहतर टिप के बहुत अंत में मनका का पता लगाने में मदद मिलेगी. संपर्क के अंत में टिप वापस लें.
      नोट: मूल फोकल विमान से बहुत मनका के गायब होने के एक सफल अनुयायी घटना इंगित करता है.
    6. मनका-संशोधित कैन्टीलवर को सावधानी से कम करें और गोंद के पूर्ण ठोसीकरण के लिए रात भर एक कैन्टीलवर बॉक्स में स्टोर करें।
  3. एएफएम द्वारा वितरित एक एकल मनका को मैक्रोफेज की सेलुलर प्रतिक्रिया की फ्लोरोसेंट इमेजिंग।
    नोट: फ्लोरोसेंट इमेजिंग एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप स्टैंड के आधार पर एक घर का बना उद्देश्य प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया गया था। इस इमेजिंग प्रणाली 4 लेजर स्रोतों (405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम, 647 एनएम), दो रंग का पता लगाने के लिए एक विभाजक दर्शक, और एक इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज युग्मित डिवाइस (EMCCD) के साथ सुसज्जित है व्यापक क्षेत्र इमेजिंग के लिए.
    1. 5% सीओ2 आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गिलास कवरस्लिप पर RAW264.7 कोशिकाओं को बढ़ाएँ।
    2. Transfect Moesin-EGFP और PLC$-PH-mCherry RAW264.7 कोशिकाओं के लिए एक transfection किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार फ्लोरोसेंट मोसिन और फॉस्फेटाइलिनोसिटॉल 4,5-bisphosphate (PIP2) अणुओं कल्पना करने के लिए क्रमशः.
      नोट: Moesin एक ITAM आकृति है कि सिडक, phagocytosis में एक प्रमुख खिलाड़ी को सक्रिय कर सकते हैं. PIP2 कोशिका झिल्ली के लिए Moesin भर्ती करने के लिए जाना जाता है.
    3. एक नमूना कक्ष विधानसभा पर कोशिकाओं के साथ कांच coverslip रखो और AFM नमूना मंच पर विधानसभा माउंट.
    4. एएफएम स्कैनिंग सिर के लिए मनका संशोधित cantilver माउंट.
    5. किसी रिक्त क्षेत्र में बल वक्र चलाएँ तथा इस वक्र से संवेदनशीलता के साथ बल को जांचा तथा चरण 2ण्2-2 में मापे गए स्प्रिंग स्थिरांक।
    6. 488/561 एनएम उत्तेजना के साथ दोनों हरे (मोसिन-ईजीएफपी) और लाल (PLC$-PH-MCherry) चैनलों में उचित फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ एक अच्छी तरह से अलग सेल का पता लगाएं।
    7. 1 एन एन निरंतर बल और 500 s संपर्क समय के साथ सेल सतह के लिए AFM के साथ नग्न 6 m polystyrene मनका उद्धार.
    8. विश्लेषण के लिए मनका के साथ संपर्क में सेल की रिकॉर्ड फ्लोरोसेंट छवि श्रृंखला (आमतौर पर 10 फ्रेम /
      नोट: फ्लोरोफोर्स के photobleaching को कम करने के लिए, ब्याज की कोशिकाओं को खोजने के लिए एक अपेक्षाकृत कम उत्तेजना शक्ति का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, एक आंतरायिक उत्तेजना योजना यदि सेल प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता एक धीमी समय पैमाने पर है फ्लोरोसेंट समय निशान को लम्बा करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

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Representative Results

चित्र 4क एक उपागम-प्रतिस्था चक्र में एकल-टी सेल और एकल-डीसी के बीच बाइंडिंग इंटरैक्शन से विशिष्ट बल-दूरी वक्रों को दर्शाता है। प्रकाश लाल वक्र विस्तार वक्र है और गहरे लाल एक वापसी वक्र है. चूंकि विस्तार वक्र आमतौर पर इंडेंटेशन या कठोरता-विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, यहाँ केवल वापसी वक्र सेल आसंजन के लिए चिंतित है। वक्र में न्यूनतम मान (हरा वृत्त) अधिकतम आसंजन बल का एक माप देता है। वक्र (शेडक्षेत्र) के अंतर्गत क्षेत्र टी सेल को डीसी से अलग करने के लिए आवश्यक कार्य (ऊर्जा) का प्रतिनिधित्व करता है। एक पूर्ण जुदाई से पहले, तेज और चरणवार टूटना घटनाओं अक्सर मनाया जाता है। यह झिल्ली tethers के रूप में व्याख्या की है सेल / सेल इंटरफ़ेस पर मजबूत बंधन के कारण सेल की सतह से बाहर निकाला जा रहा है और फिर निरंतर खींच के तहत कड़ाई से तोड़ने. कोशिका झिल्ली21के यांत्रिक गुणों की विशेषता के लिए चरणों की संख्या, ऊँचाई और लंबाई का उपयोग किया जा सकता है। टी सेल-डीसी बातचीत के लिए, हम बाध्यकारी शक्ति में रुचि रखते हैं, इस प्रकार केवल अधिकतम आसंजन बल प्रत्येक वक्र के लिए विश्लेषण किया है. चित्र 4B पारंपरिक टी सेल (Tconv)/DC और नियामक टी सेल (Treg)/DC के बीच आसंजन बलों की तुलना करता है। Tconv इस तरह के डीसी के रूप में प्रतिजन-प्रपोक्षण कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड एंटीजन पहचानता है, जबकि Treg suppressor टी कोशिकाओं है कि बंद Tconv -एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अंत की ओर प्रतिरक्षा मध्यस्थता है. स्पष्ट रूप से, Treg Tconv से डीसी के साथ बहुत मजबूत बंधन से पता चलता है (चित्र 4Cदेखें). यह Treg और Tconv2के बीच टी सेल सतह पर LFA-1 के अंतर कारोबार दरों से संबंधित है. हालांकि, इस को नियंत्रित करने वाले सटीक तंत्र अभी भी जांच के अधीन है। डीसी के लिए Treg की मजबूत बाध्यकारी Treg और डीसी के बीच लंबे समय से बाध्यकारी समय के अनुरूप है vivo22में मनाया . इससे भी महत्वपूर्ण बात, अगर एक डीसी एक Treg करने के लिए prebinds, इस डीसी एक और Tconv जबरदस्ती संलग्न नहीं कर सकते (डेटा नहीं दिखाया), कम टी सेल प्राइमिंग या प्रतिरक्षा दमन2के लिए अग्रणी . इस प्रकार, टी सेल/डीसी युग्मों पर बल मापन ट्रेग के दमनकारी क्रियाविधि में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Figure 4
चित्र ााालः Treg कोशिकाओं से ही CCs को प्रबल आसंजन दिखाई देते हैं. (ए) एक Tconv सेल और एक DC2.4 के बीच विशिष्ट बल घटता है. प्रकाश लाल वक्र विस्तार वक्र है और गहरे लाल वक्र वापसी वक्र है. हरे वृत्त द्वारा इंगित गहरे लाल वक्र का न्यूनतम मान अधिकतम आसंजन बल है। छायांकित क्षेत्र दो कोशिकाओं के बीच पूर्ण पृथक्करण के लिए आवश्यक ऊर्जा का प्रतिनिधित्व करता है। (ठ) संकेतित प्रकारों के टी कोशिकाओं के लिए बल रीडिंग डीसी 2.4 कोशिकाओं के साथ सहभागिता करते हैं। प्रत्येक टी-डीसी जोड़ी में कम से कम 14 बल रीडिंग होती हैं और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए 5 स्वतंत्र डीसी-टी सेल जोड़े की जांच की गई थी। ग्रे प्रतीकTconv कोशिकाओं के लिए कर रहे हैं (5); गहरे नीले, Treg कोशिकाओं (5). सभी डेटा अंक एक ही दिन एकत्र किए गए थे। C. संकेतित प्रकारों की टी कोशिकाओं के माध्य बलों DC2.4 कोशिकाओं के साथ बातचीत. त्रुटि सलाखों SEM हैं* **, P और lt; 0.001 (छात्र के t-परीक्षण). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 5 से पता चलता है कि कैसे fluorescently लेबल phagocytic RAW264.7 सेल एक नग्न 6 m polystyrene मनका AFM4द्वारा दिया करने के लिए प्रतिक्रिया करता है. प्रायोगिक योजना चित्र 5कमें दर्शाया गया है। पीआईपी2 को पीएलसी-पीएच-मचेरी (लाल) और मोसिन द्वारा लेबल किया गया है, इसे ईजीएफपी (हरा) द्वारा लेबल किया गया है (चित्र 5खदेखें)। हालांकि वे दोनों मनका / सेल इंटरफेस पर समृद्ध कर रहे हैं, Moesin के संचय काफी हद तक PIP2 की तीव्रता परिवर्तन का पता लगाया के रूप में kymograph भूखंडों द्वारा संकेत दिया तीव्रता प्रोफाइल के रूप में संकेत सफेद रेखा के साथ समय के समारोह के रूप में चित्र 5C| साथ में तथ्य यह है कि Moesin अपने FERM डोमेन23के माध्यम से PIP2 के लिए बाध्य कर सकते हैं के साथ , परिणाम यहाँ पता चलता है कि मनका उलझाने पर, झिल्ली PIP2 पहले संपर्क साइट है, जो तो Moesin की झिल्ली भर्ती प्रेरित करता है जिसका ITAM डोमेन तो Syk-PI3K रास्ते को सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप एक phagocytic घटना में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रकार, एक नया phagocytic मार्ग PIP2-Moesin-Syk अक्ष शामिल की पहचान की गई है और सबसे महत्वपूर्ण बात, यह कोशिका झिल्ली पर किसी भी रिसेप्टर्स पर निर्भर नहीं करता है.

Figure 5
चित्र 5: Moesin संकेतन ठोस संरचना द्वारा संचालित PIP2 छँटाई के बहाव है. (क) एएफएम द्वारा वितरित मनका के साथ मनका/सेल संपर्क के फ्लोरोसेंट इमेजिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख) पीएच-पीएलसी-मचेरी और मोसिन-ईजीएफपी को RAW264.7 कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्त किया गया था। कोशिका सतह से संपर्क करने के लिए एक पॉलीस्टाइरीन मनका का उपयोग किया गया था। छवियाँ 500 s. स्केल बार के लिए एक 6 s अंतराल पर लिया गया था, 5 $m. C. PIP2 के स्थानीयकरण और Moesin संपर्क के स्थल पर (के साथ संकेत दिया "*") संकेत लाइन से उत्पन्न kymographs के साथ जांच की गई थी. यह आंकड़ा4से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

AFM आधारित एकल कोशिका बल स्पेक्ट्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं के biophysical गुणों को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए विकसित किया गया है. उन अनुप्रयोगों के लिए, cantilver ब्याज की कोशिकाओं पर विशिष्ट बातचीत या गुणों की जांच करने के क्रम में ठीक से कार्यात्मक होने की जरूरत है. यहाँ, एक टी सेल और टिप-कम कैन्टीलवर के लिए एकल माइक्रोन आकार मनका युग्मन के लिए तरीकों क्रमशः वर्णित हैं। कैन्टीलवर के लिए एक एकल टी सेल संलग्न करने के लिए, एक bioसंगत गोंद सेल चिपकने वाला के रूप में चुना गया था. यह समुद्री mussel से निकाले गए एक विशेष रूप से तैयार प्रोटीन समाधान है। इसका चिपकने वाला पनापॉलीफेनोलिक अवशेषों से उत्पन्न होता है जिसका हाइड्रैक्सिल समूह एक गैर-विशिष्ट तरीके से कोशिका की सतह पर उजागर अवशेषों के साथ हाइड्रोजन आबंधन बना सकता है। बाइंडिंग की यह विधि आमतौर पर बाध्य सेल के सेलुलर कार्यों के साथ हस्तक्षेप नहीं करती है। उचित आसंजन के लिए, संलग्न होने वाली कोशिकाओं की स्थितियां भी महत्वपूर्ण हैं। ताजा शुद्ध माउस CD4 + टी कोशिकाओं के मामले में, वे पहले मानव आईएल -2 के साथ रात भर इलाज किया जा करने के लिए इससे पहले कि वे cantilver कार्यात्मक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्यथा, वे बल्कि जल्दी सेल मौत से गुजरना होगा. यदि कोशिकाओं को अच्छी स्थिति में नहीं हैं, भले ही वे cantilver से जोड़ा जा सकता है, वे बहुत संभावना कमजोर आसंजन शक्ति के कारण जांच बल के केवल कई चक्र के बाद cantilver से अलग हो जाएगा, बल माप के एक उच्च विफलता दर के लिए अग्रणी. इस bioसंगत गोंद के नकारात्मक पक्ष यह है कि यह ऑक्सीकरण के लिए प्रवण है, इसलिए युग्मन प्रक्रिया के रूप में संभव के रूप में तेजी से समाप्त किया जाना है, जो ऑपरेटरों के लिए कभी कभी चुनौतीपूर्ण हो सकता है. जैव संगत गोंद के ऑक्सीकरण को कम करने के लिए, यह अत्यधिक cryogenic शीशियों में 30 डिग्री एल alicots एक एन 2 हवा वातावरण में स्टॉक समाधान से स्टॉक समाधान से एन2 गैस से भरा तैयार करने के लिए और उन्हें तरल एन2 में सबसे अच्छा प्रदर्शन के लिए स्टोर करने के लिए सिफारिश की है . सबसे महत्वपूर्ण बात, इस bioसंगत गोंद इस तरह के fibronectin और लैक्टिन जो cantilver/सेल संपर्क क्षेत्र में अवांछित रिसेप्टर क्लस्टरिंग पैदा कर सकता है और इस तरह टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के रूप में अन्य प्रोटीन आधारित चिपकने के विपरीत टी कोशिकाओं के लिए निष्क्रिय साबित होता है24 ,25,26. इस प्रकार, ब्याज की कोशिकाओं पर गोंद के प्रभाव प्रयोगात्मक जांच की जानी चाहिए इससे पहले कि वे सेल आसंजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह विशिष्ट आण्विक मान्यताओं पर निर्भर अन्य कैन्टीलवर-फ़ंक्शनलाइजेशन योजनाओं पर भी लागू होता है, जैसे एंटीजन/एंटीबॉडी, बायोटिन/स्ट्रेप्टाविडिन, और कोकणावेलिन ए/

टी सेल/डीसी बातचीत की जांच करने के लिए, प्रोटोकॉल में दर्शाए अनुसार अनुकूलित पैरामीटर (चरण 1.7.2) को बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए चुना गया था। उनमें से, सेट-पॉइंट मान और संपर्क समय दो कुंजी पैरामीटर हैं। सामान्यतया, सेट-पॉइंट का ऑप्टिमाइज़ेशन छोटे मानों (0.1-0.2 nN) से प्रारंभ होता है. कक्ष/कक्ष अन्योन्यक्रिया के लिए, एक उच्च सेट-पॉइंट मान ([2 nN) कोशिकाओं के बड़े विरूपण और एक बड़े संपर्क क्षेत्र की ओर जाता है। यह आम तौर पर एक बड़े आसंजन बल readout में परिणाम है. तथापि, जांच बल सेल सतहों की जटिल प्रकृति के कारण सेल/सेल अंतराफलक पर विशिष्ट और गैर-विशिष्ट दोनों अन्योन्यक्रियाओं से उत्पन्न होता है, जो कुछ हद तक संपर्क क्षेत्र के साथ स्केल होता है। इसलिए, बड़ा सेट-पॉइंट मान, बड़ा nonspecific बातचीत का योगदान. बाद क्या किसी भी बल माप में कम से कम किया जाना चाहिए है. इसके अलावा, nonspecific बातचीत के बारे में जानने के लिए, इस तरह के विशिष्ट एंटीबॉडी या नॉकआउट (या knockdown) कोशिकाओं का उपयोग कर ब्याज की विशिष्ट बातचीत को ब्लॉक करने के लिए दिए गए सेट-पॉइंट मूल्यों पर बेसल बल readout प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए के रूप में नियंत्रण बल माप . इससे परीक्षण माप में विशिष्ट इंटरैक्शन की पहचान करने में मदद मिलेगी. संपर्क समय के रूप में, यह समय पैमाने पर जिस पर जांच आणविक या सेलुलर घटनाओं जगह ले पर निर्भर करता है. इसलिए, ब्याज की घटनाओं का पूर्व ज्ञान महत्वपूर्ण है. टी सेल/इनएक्टिवेट डीसी बातचीत के मामले में, आसंजन अणु LFA-1 पर टी सेल और डीसी पर ICAM-1 एक बाध्यकारी जोड़ी फार्म. यह अंतर-अणुक आबंधन एक बार दो समकक्षों की स्थिति में होने के बाद तेजी से होता है, लेकिन अणुओं को कोशिका झिल्ली पर सही स्थानों पर प्रसार करने में समय लगता है जहां समकक्ष अणु आबंधन के लिए तैयार हैं, एक प्रसार-सीमित प्रक्रिया। इसलिए, हम Bongrand समूह27,28द्वारा कतरनी प्रवाह प्रयोगों के अनुसार फार्म करने के लिए कई LFA-1/ICAM-1 संबंध जोड़े की अनुमति देने के लिए संपर्क समय के 10 s निर्धारित करते हैं। हालांकि एक लंबे समय सेट किया जा सकता है, कुछ बिंदु पर, लंबे समय तक मदद नहीं करता है जब संबंध गठन इंटरफ़ेस पर संतृप्त है. इसके अलावा, लंबे समय से संपर्क समय डाउनस्ट्रीम सेलुलर प्रतिक्रियाओं जो ब्याज की नहीं हो सकता है में परिणाम हो सकता है. दूसरी ओर, यदि कुछ सेलुलर घटनाओं ब्याज की हैं, इस तरह के दूसरे आवेदन में वर्णित phagocytic घटना के रूप में जहां मनका आंशिक रूप से मैक्रोफेज द्वारा छा गया था, लंबे समय से संपर्क समय बिल्कुल आवश्यक है.

पर्याप्त आँकड़े संचित करने के लिए प्रत्येक टी सेल/डीसी युग्मों के लिए बल वक्रों की 20 दोहराव एकत्र की गई तथा अधिकतम आसंजन बल विश्लेषण के लिए कम से कम 14 बल वक्रों का उपयोग किया गया। प्रत्येक परीक्षण समूहों में कम से कम 5 जोड़े का परीक्षण किया गया. नमूना इतिहास को दूर करने के लिए, केवल ताजा टी सेल/डीसी जोड़े की जांच की गई, जिसका अर्थ है कि जांच के लिए चयनित टी कोशिकाओं और डीसी का किसी अन्य सेल के साथ कोई संपर्क इतिहास नहीं था। यद्यपि उपर्युक्त प्रक्रिया समग्र प्रयोगों को समय और लागत लेने वाली बनाती है, फिर भी टी सेल/डीसी युग्मों पर ऐसे बल मापन करने का शायद उचित तरीका है।

कैन्टीलवर के लिए एकल मोती संलग्न cantilver पर सेल-फ़ंक्शनलाइजेशन की तुलना में अपेक्षाकृत आसान है। के बाद से विभिन्न solidification समय के साथ epoxy गोंद बाजार में उपलब्ध हैं, यह एक लंबे solidification समय के साथ एक epoxy गोंद का चयन करने के लिए संभव है, आम तौर पर घंटे के आदेश पर. यह एक मोती नमूना में तैयार किया जा करने के लिए कई मनका संशोधित cantilevers की अनुमति देता है. वैकल्पिक रूप से, एक यूवी-curable गोंद इस्तेमाल किया जा सकता है, जो इलाज समय काफी छोटा कर सकते हैं, यूवी प्रकाश28के तहत के बारे में 10 मिनट. कोई फर्क नहीं पड़ता कि क्या गोंद का इस्तेमाल किया जा रहा है, प्रोटोकॉल भर में केवल महत्वपूर्ण कदम के लिए cantilver की नोक के लिए गोंद की एक न्यूनतम राशि संलग्न है. अतिरिक्त गोंद न केवल मनका आसानी से दफन होगा, सेल माप के दौरान मनका के बजाय गोंद के साथ संलग्न कर रही है, लेकिन यह भी cantilver के यांत्रिक गुण बदल जाते हैं, बल-अंशांकन गलत बना रही है. इसलिए, यह cantilver और गोंद के बीच संपर्क क्षेत्र को नियंत्रित करने के लिए इतना है कि गोंद की केवल एक छोटी राशि cantilver के बहुत अंत में सीमित है महत्वपूर्ण है. यहाँ वर्णित विधि अन्य माइक्रोन आकार के ठोस कणों पर भी लागू होती है, जैसे मोनोसोडियम यूरेट क्रिस्टल15, फिटकिरी14और कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल29.

बल-जांच के अलावा, AFM भी कोशिकाओं के लिए एक भौतिक या रासायनिक उत्तेजना प्रदान कर सकते हैं और बाद में सेलुलर घटनाओं वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट निगरानी की जा सकती है, के रूप में दूसरे आवेदन में प्रदर्शन किया. यह spatiotempoly अधिक जटिल जैविक घटनाओं को संबोधित करने के लिए एक महान अवसर खोलता है, इस तरह के प्रतिरक्षा synapse30के गठन के रूप में, जो पारंपरिक दृष्टिकोण से वास्तविक समय में विशेषता नहीं किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम चीन के जनरल प्रोग्राम (31370878), राज्य कुंजी कार्यक्रम (31630023) और अभिनव अनुसंधान समूह कार्यक्रम (81621002) के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD? Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

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References

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Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

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