Summary
Vi presenterer en protokoll for å funksjonalisere atomkraftmikroskop (AFM) utkragning med en enkelt T celle og perle partikkel for immunologiske studier. Prosedyrer for å granske single-pair T celle-dendrittiske celle binding av AFM og å overvåke sanntids mobilnettet respons av makrofager til en enkelt solid partikkel av AFM med fluorescens Imaging vises.
Abstract
Atomic Force mikroskopi basert enkelt celle kraft spektroskopi (AFM-SCFS) er et kraftig verktøy for å studere Biofysiske egenskaper levende celler. Denne teknikken gjør det mulig for undersøkelser interaksjon styrker og dynamikk på en levende celle membran, inkludert de mellom celler, reseptor og ligander, og sammen med mange andre varianter. Det fungerer også som en mekanisme for å levere en fysisk eller biokjemiske stimulans på enkeltceller i en spatiotemporally kontrollert måte, og dermed tillater spesifikk celle aktivering og påfølgende cellulære hendelser som skal overvåkes i sanntid når kombinert med live-celle fluorescens avbildning. Nøkkelen trinn i disse AFM-SCFS målingene er AFM-cantilever funksjonalisering, eller med andre ord, knytter et emne av interesse for cantilever. Her presenterer vi metoder for å endre AFM utkragning med en enkelt T-celle og en enkelt polystyren perle henholdsvis for immunologiske studier. Den førstnevnte innebærer en biokompatible lim som par enkelt T-celler til spissen av en flat cantilever i en løsning, mens sistnevnte er avhengig av en epoxy lim for enkelt perle vedheft i luft miljøet. To immunologiske søknader knyttet til hver cantilever modifikasjon er gitt også. Metodene som beskrives her, kan enkelt tilpasses forskjellige celletyper og faste partikler.
Introduction
Atomic Force mikroskopi (AFM), et allsidig verktøy, har funnet mange programmer i Cell Biology Research1,2,3,4,5. Bortsett fra den høye oppløsning Imaging evne, den innfødte Force-undersøkelser funksjonen lar Biofysiske egenskaper levende celler som skal undersøkes direkte in situ på single-cellenivå6,7. Disse inkluderer Stivheter av subcellulære strukturer eller hele celler8,9,10,11,12, spesifikke ligand/reseptor bindende styrke ved enkelt molekylnivå på cellen Surface13, og vedheft styrker mellom enkelt par av faste partikler og celler eller mellom to celler1,2,14,15. De to sistnevnte er ofte kategorisert som single-Cell Force spektroskopi (SCFS)16. På grunn av den lett tilgjengelige utkragning med ulike våren konstant, kraften området tilgjengelig for AFM er ganske bred fra noen få piconewtons (pN) til micronewtons (μN), som tilstrekkelig dekker hele spekteret av cellulære hendelser som involverer styrker fra noen titalls av pN, slik som reseptor-baserte single-molekylet bindende, til nN, for eksempel phagocytic mobilnettet hendelser15. Denne store dynamisk kraft utvalg gjør AFM fordelaktig over andre makt-undersøkelser teknikker som optisk/magnetisk pinsett og en biomembrane kraft sonde, som de er mer egnet for svake-kraft målinger, med makt vanligvis mindre enn 200 pN17 , 18. i tillegg kan AFM fungere som en høy presisjon manipulator å levere ulike stimuli på enkeltceller i en spatiotemporally definert måte4,19. Dette er ønskelig for Real-Time single-celle aktivering studier. Kombinert med live-celle fluorescens Imaging, den påfølgende cellulære responsen til den spesifikke stimulans kan overvåkes samtidig, og dermed gjør AFM-baserte SCFS overmåte robust som optisk Imaging gir et praktisk verktøy for å granske mobilnettet signalering. For eksempel ble AFM brukt til å bestemme stammene som kreves for å lokke fram kalsium transienter i osteoblaster20. I dette arbeidet ble kalsium transienter spores fluorescensmerkete gjennom kalsium ratiometrisk Imaging etter påføring av lokaliserte styrker på kultivert osteoblaster med en AFM spissen. Nylig ble AFM ansatt for å strekke kollagen fibrils som hepatic Stel celler (HSC) ble dyrket og denne mechano-transduced HSC aktivisering var sanntid overvåkes av en fluorescerende src Biosensor, hvis fosforylering som representeres av fluorescens intensiteten av Biosensor er korrelert med HSC aktivisering3.
I AFM-baserte SCFS eksperimenter, riktig funksjonalisering av AFM utkragning er et viktig skritt mot vellykkede målinger. Siden vår forskning interesse fokuserer på immunceller aktivisering, vi rutinemessig funksjonalisere utkragning med partikler saker som enkelt faste partikler som kan utløse fagocytose og/eller sterke immunresponser4,14 , 15 og enkelt T celler som kan danne en immun synapse med antigen presentere celler, for eksempel aktiverte dendrittiske celler (DC)2. Enkelt faste partikler er normalt koblet til en cantilever via en epoxy lim i luft miljøet, mens enkelt T-celler, på grunn av deres ikke-selvklebende natur, er funksjonalisert til en cantilever via en biokompatible lim i løsningen. Her beskriver vi metodene for å utføre disse to typer cantilever modifikasjon og gi to tilhørende applikasjoner også. Det første programmet er å granske T Cell/DC interaksjoner med AFM-SCFS å forstå den undertrykkende mekanismen av regulatoriske T-celler fra cellen mekanikk synspunkt. Den andre innebærer å kombinere AFM med live-celle fluorescens Imaging å overvåke cellulære responsen av macrophage til en solid partikkel i sanntid for å avdekke den molekylære mekanismen av reseptor-uavhengige phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)- Moesin mediert fagocytose. Målet med denne protokollen er å gi en referanse rammeverk for interesserte forskere til å designe og implementere sine egne eksperimentelle innstillinger med AFM-basert enkelt celle analyse for immunologiske forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen eksperiment protokollen følger dyre omsorgen retningslinjer for Tsinghua University
1. cantilever funksjonalisering med enkelt T-celler
- Mus milt celler forberedelse
- Ofre musen (8-16 uker av alder (enten sex); f. eks, C57BL/6 belastning) ved hjelp av karbondioksid, etterfulgt av cervical forvridning.
- Rengjør musen med 75% etanol og lage en midtlinjen huden snitt etterfulgt av splenektomi.
- Homogenisere milten i 4 mL PBS inneholder 2% fosterets storfe serum (FBS) ved hjelp av glass lysbilder og fjerne aggregater og rusk ved å passere cellen suspensjonen gjennom en 70 μm mesh nylon sil.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min, kast supernatanten og resuspend cellene i 2 ml rød blod cellelyse Rings buffer (balansert ved romtemperatur) i 5 min. Avslutt lyse Rings reaksjonen ved å legge til 8 ml PBS-løsning.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min og resuspend celler med en tetthet på 1 x 108 celler/ml i PBS som inneholder 2% FBS og 1 mm EDTA (merket som Solution a), vanligvis 0,25-2 ml avhengig av celle tettheten. Overfør de resuspendert cellene til en 5 mL (12 x 75 mm) polystyren rund bunn tube.
- Mouse CD4 + T celler forberedelse
- Tilsett 50 μL/mL rotte serum (se tabell av materialer) og 50 ΜL/ml CD4 + T celle isolasjon cocktail (se tabell over materialer) til Celleprøven innhentet fra trinn 1.1.5. Bland og ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vortex aksjen streptavidin magnetisk partikkel oppløsning (se tabell av materialer) i 30 s eller til partiklene vises jevnt fordelt.
- Tilsett 75 μL/mL streptavidin magnetiske partikler til Celleprøven. Bland og ruge i 2,5 min. ved romtemperatur.
- Legg til løsning A for å fylle opp Celleprøven til 2,5 mL og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned for 2-3 ganger.
- Sett prøve røret (uten lokk) inn i magneten (se tabell over materialer) og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Forsiktig helle den beriket celle suspensjonen inn i en ny 5 mL polystyren runde-Bottom tube.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend de beriket T-cellene i 500 ΜL av Solution A.
Merk: de beriket CD4 + T-celler inneholder både konvensjonelle og regulatoriske T-celler.
- Regulatory T celler separasjon fra konvensjonelle T-celler
- Legg til 25 μL av FcR blocker (se tabell av materialer) til beriket T-Celleprøven innhentet fra trinn 1.2.6. Bland og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 25 μL av regulatoriske T-celle positiv utvalgs cocktail (se tabell over materialer) til T-Celleprøven. Bland og ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 10 μL av PE utvalg cocktail (se tabell over materialer) til T-Celleprøven. Bland og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vortex aksjen dextran magnetisk partikkel oppløsning (se tabell av materialer) i 30 s eller til partiklene vises jevnt fordelt.
- Tilsett 10 μL av dextran-belagte magnetiske partikler til T-Celleprøven. Bland og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legg til Solution A for å fylle opp T-Celleprøven til 2,5 mL og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned for 2-3 ganger.
- Plasser T-celleprøve røret (uten lokk) inn i magneten og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Hell supernatanten forsiktig i et nytt rør.
Merk: supernatanten inneholder beriket konvensjonelle CD4 + T-celler. - Sentrifuger de beriket konvensjonelle CD4 + T-celler ved 500 x g i 5 min. forkaste supernatanten og resuspend cellene i 4 ml RPMI1640 inneholdende 10% FBS, 0,05 mm β-Mercaptoethanol, 0,01 M HEPES og 1% penicillin/Streptomycin (merket som medium B).
- Fjern røret der regulatoriske T-celler er beriket av magneten. Tilsett 2,5 mL oppløsning A til røret og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned i 2-3 ganger. Sett slangen tilbake i magneten, ruge i 5 min, og deretter forsiktig helle av og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet tre ganger til.
- Resuspend de beriket regulatoriske T-cellene i 2 mL medium B.
- Ruge både renset konvensjonelle T-celler og regulatoriske T-celler med 100 U/mL hIL-2 over natten eller i minst 4 timer ved 37 ° c i en fuktet inkubator med 5% CO2 før den brukes til cantilever funksjonalisering.
- Forberedelse av dendrittiske celler
- Forbered Piranha løsning, en blanding av 30% H2O2 (30%) og 70% H2så4 (CONC) (v/v). Hell sakte 3 mL H2O2 i 7 ml h2så4 under konstant omrøring og kjøling.
FORSIKTIG: Piranha-løsningen er svært etsende, og den kan brenne og ødelegge kroppens vev. Derfor er det tryggere å bruke Piranha-løsningen under en hette og bruke egnet sikkerhetsutstyr, da blandingen vil sprute rundt begeret. Nøytralisere oppløsningen med NaOH til pH 7 etter bruk. - Dypp glass dekkglass på 24 mm diameter i Piranha-løsningen i 30 minutter og skyll grundig etterpå med det sterile ultrarent vannet.
- Dypp et par spisse pinsett i 75% etanol i 30 min for kald desinfeksjon.
- Introduser renset glass coverslips inn i en 6-brønn kultur plate av pinsett.
- Vipp en 6 cm plast kultur rett der DC 2.4 celler var pre-kultivert med 4 mL medium B og aspirer alt mediet. Tilsett 2 mL PBS i kulturen parabolen å skylle DC 2.4 celler og forkaste PBS. Gjenta dette skylletrinnet to ganger til.
- Tilsett 1 mL 0,25% Trypsin EDTA til kultur fatet i 2 min. Tilsett 1 mL medium B til denne parabolen for å avslutte enzymet fordøyelsen reaksjonen. Overfør fordøyd celle suspensjonen til en 15 mL tube.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min og resuspend DC 2.4-celler med en tetthet på 2 x 105 celler/ml i medium B.
- Seed DC 2.4 celler på glasset coverslips fremstilt på trinn 1.4.4 og ruge cellene over natten i et fuktet kammer ved 37 ° c med 5% CO2.
Merk: for å måle samarbeids krefter mellom to enkeltceller, er en relativt lav konsentrasjon av DC 2.4 celler (dvs. < 10% confluency) nødvendig å ha en riktig avstand mellom celler.
- Forbered Piranha løsning, en blanding av 30% H2O2 (30%) og 70% H2så4 (CONC) (v/v). Hell sakte 3 mL H2O2 i 7 ml h2så4 under konstant omrøring og kjøling.
- AFM cantilever forberedelse
Merk: utkragning som er egnet for enkelt celle kraft spektroskopi eksperimenter er de med lav fjær konstanter, vanligvis i området 0,01-0.06 N/m. Her foretrekkes myke tupp-mindre utkragning for enkeltceller og enkelt faste partikler funksjonalisering.- Rengjør utkragning av Piranha-behandling eller plasma-eller UV-ozon rengjøring.
- Monter renset cantilever til AFM skanning hodet.
- Forbered en ren prøve kammer fylt med rent vann og kalibrere cantilever i vann løsning ved først å kjøre en styrke kurve på glass underlaget for å oppnå følsomhet (skråningen av lineær passer over den frastøtende del av den nærmer kurve) og deretter innspillingen en termisk støy spektrum for å trekke ut våren konstant i henhold til bruksanvisningen for AFM.
- Fjern AFM skanning hodet fra løsningen, vaske montert cantilever med noen dråper ren etanol, og holde cantilever tørr på skanning hodet.
- Feste enkelt T-celler til cantilever
- Varm opp den levende celle miljø kabinett med 5% CO2 ved 37 ° c.
- Monter glass dekkglass med DC 2.4 celler dyrket på den fra trinn 1.4.8 til en prøve kammer montering, tilsett 600 μL av medium B til kammeret umiddelbart, og deretter sette forsamlingen på AFM prøven scenen.
- Legg hIL-2 inkubert CD4 + T-celler (enten konvensjonelle eller regulatoriske T-celler) i prøvekammeret.
Merk: det totale prøvevolumet bør ikke overstige 1 mL. - Vent til lagt CD4 + T-celler er helt avgjort ned på bunnen av dekkglass.
Merk: luftbobler vil forårsake stor forstyrrelse for eksperimentet, derfor er det tilrådelig å unngå eventuelle luftbobler i trinn 1.6.2 og 1.6.3. - Legg til en dråpe 2 μL av biokompatible lim på enden av den monterte cantilever med en pipette som vist på figur 1 , og plasser deretter skannehodet på prøve trinnet raskt, slik at cantilever belagt med biokompatible limet senkes i Løsning.
FORSIKTIG: ikke berør glass blokken eller cantilever med pipette spissen. Siden biokompatible limet som brukes her er utsatt for oksidasjon i luft, bør dette trinnet gjøres så raskt som mulig. - Finn en sunn T-celle under tuppen av cantilever grovt under mikroskopet ved å flytte prøvefasen og finjustere plasseringen ved å flytte skannehodet.
Merk: en sunn CD4 + T celle har vanligvis en relativt stor størrelse, glatte kanter, og optisk Transmissive i den lyse-feltet Imaging. - Senk cantilever manuelt med trinn-størrelser som starter fra 50 μm deretter til 10, 5, 2 og 0,5 μm gradvis ved å kontrollere den stepper motorer. Hold posisjonen til stepper motorer og justere plasseringen av skanning hodet for bedre innretting mellom cantilever spissen og cellen, når cantilever gjør en fast kontakt med målet T-cellen som indikert av en liten forskyvning av laserstrålen posisjon i photodetector som tilsvarer en typisk styrke rekkevidde på 0,5-1.5 nN.
Merk: dette trinnet kan også gjøres ved å kjøre en enkelt kraftmåling der set-punkt (kraften som brukes på cellen) og kontakt tid kan være godt definert i programvaren. Men på grunn av den ikke-selvklebende natur T-celler, gir den manuelle tilnærmingen mer fleksibilitet i å kontrollere sikter, posisjonering, og kontakt tid enn den automatiske nærmer seg, og det fungerer pålitelig for T celle vedheft. Future experimentalists bør prøve både manuell og automatisk nærmer seg for å finne ut hvilke som fungerer bedre for sine systemer av interesse. - Trekk tilbake cantilever etter 30 s kontakt.
Merk: Hvis cellen beveger seg med cantilever, er vedlegget vellykket. Hvis ikke, gjentar du trinn 1.6.6, men på en annen T-celle. Den biokompatible limet er lett oksidert. Trinn 1.6.5-1.6.7 skal være ferdig innen 5 min. I tillegg, hvis den samme cantilever mislykkes tre ganger for T-celle-vedlegg, en ny cantilever bør brukes, og vedlegget prosedyren skal starte fra trinn 1.5.2 på nytt.
Figur 1: skjematisk fremstilling av å legge en liten dråpe biokompatible lim på den monterte cantilever. Cantilever monteres via en klemme fjær på glass blokk holde ren som er installert på AFM skanning hodet (ikke trukket her). Når skannehodet står på en jevnet overflate, er cantilever vertikalt orientert som vist på tegningen. Om lag 2 μL biokompatible lim kan tilsettes til tuppen av cantilever med en mikro-pipette. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Force spektroskopi av single-pair T celle/dendrittiske celle interaksjon
Merk: for å granske celle/celle interaksjoner, er en AFM med en Z-Range større enn den konvensjonelle 10-15 μm nødvendig for å fullt ut skille de to cellene. Den AFM som brukes her har en Z-utvalg av 100 μm, som er tilstrekkelig til å skille T-celle fra den dendrittiske cellen etter celle/celle kontakt.- Plasser den vedlagte T-cellen over en egen DC 2.4-celle ved å bevege prøve etappen og/eller skannehodet (se figur 2).
- Angi riktige parametere og Kjør Force spektroskopi.
Merk: følgende nøkkelinnstillinger brukes vanligvis: settpunkt 0,5 nN, trekk lengde 50 μm, Z-bevegelse konstant hastighet, forlenge hastighet 5 μm/s, kontakt tid 10 s, forsinkelse modus konstant kraft. For hvert T-DC-par samles 20 repetisjoner av styrke kurver, og minst 14 kraft kurver brukes til videre analyse. - Monter en ny rengjort cantilever, Kalibrer den i rent vann som i trinn 1.5.3, og gå tilbake til samme T-DC-celleprøve for å gjenta trinn 1,6 og 1,7 for et annet T-DC-par. Sonde minst 5 par for hver tilstand.
Figur 2: eksperimentell konfigurasjon av kraft-undersøkelser mellom en enkelt T-celle og DC. (A) skjematisk tegning av eksperimentell konfigurasjon der en T-celle festet til cantilever er brakt til en DC vokst på underlaget for kraft-undersøkelser. (B) Bright-felt bilde av en T-celle-funksjonalisert cantilever og en DC. Scale bar, 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. cantilever funksjonalisering med enkelt polystyren perler
- Single perler forberedelse
- Fortynne lager suspensjon av 6 μm polystyren perler i 100% etanol.
Merk: konsentrasjonen av fortynnet perler løsningen bør være lav nok slik at når den legges til et glass dekkglass overflate, individuelle perler er godt separert uten betydelig Clustering etter løsemiddel fordampning. - Rengjør 24 mm diameter glass dekkglass med etanol og fjern støv fra N2 luftstrøm.
- Monter de renset glass dekkglass til en prøve kammer montering og sett forsamlingen på mikroskopet.
- Sett en dråpe av fortynnet perler løsning på venstre side, men nær midten av dekkglass (se Figur 3) og sjekk avstanden mellom perlene etter løsemiddel fordampning i lyse-feltet under mikroskopet med en 20x objektiv. Fortsett til neste trinn hvis enkelte perler er godt separert.
- Dypp en micropipette spissen eller en tannpirker inn i en godt blandet epoxy lim og deretter overføre en liten mengde slike lim til tre separate flekker med påfølgende milde berører på høyre side, men nær midten av dekkglass.
Merk: de tre lim flekkene skal være vertikalt justert (se Figur 3). Det siste stedet med minst av limet vil bli brukt senere.
- Fortynne lager suspensjon av 6 μm polystyren perler i 100% etanol.
Figur 3: skjematisk fremstilling av arbeidsflyt for enkelt-perler funksjonalisering på cantilever. Godt separert mikron-sized perler er forberedt på venstre side av underlaget og en liten mengde epoxy lim overføres på høyre side av underlaget gjennom 3 påfølgende milde berører, noe som resulterer i 3 lim flekker. Bare den siste plassen med minst av limet (indikert av en sirkel) brukes til å belegge helt på slutten av cantilever. Nærme cantilever inn i limet fra venstre og deretter flytte cantilever bakover når den er nedsenket i limet å begrense limet på slutten av cantilever. Bring målet perle under cantilever og justere dem riktig før du gjør en fast kontakt (vanligvis 2-5 nN) for perle vedheft. Når perlen er vellykket funksjonalisert på cantilever, en ny cantilever kan monteres for å starte en ny funksjonalisering syklus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- AFM cantilever forberedelse
- Monter en rengjort tip-mindre cantilever til AFM skanning hodet.
- Kalibrer denne cantilever i luften med en ren overflate for å oppnå fjær konstanten.
- Feste enkelt perler til cantilever
- Plasser cantilever spissen over venstre kant av det siste epoxy lim stedet som vist i Figur 3.
- Bring cantilever nær limet langsomt ved å senke stepper motorer med små trinn størrelser.
- Trekk cantilever bort raskt fra limet sideveis ved å flytte AFM skanning hodet bakover (til venstre) manuelt når spissen er nedsenket i limet.
Merk: Pass på at bare en liten mengde av limet fester helt til enden av spissen. Hvis det er overdreven lim på spissen, er det mulig å redusere mengden av limet ved å berøre etterfulgt av skyve spissen på en tom overflate. - Flytt cantilever spissen på toppen av en godt isolert enkelt perle.
- Approach cantilever til den ene perlen langsomt og gjør en fast kontakt med perlen (som indikert ved forskyvning av laserstråle posisjonen i photodetector som tilsvarer et typisk styrke område på 2-5 nN) i ca. 10 s, der en finjustering av t IP posisjonering sideveis vil hjelpe bedre finne perle helt på slutten av spissen. Tilbakekalle tipset på slutten av kontakten.
Merk: forsvinningen av selve perlen fra det opprinnelige fokalplanet indikerer en vellykket tilhenger hendelse. - Demontere perle-modifisert cantilever nøye og oppbevar den i en cantilever boks over natten for full herding av limet.
- Fluorescens Imaging av cellulære respons av macrophage til en enkelt perle levert av AFM.
Merk: fluorescens Imaging ble utført på en hjemmelaget objektiv-type total intern refleksjon fluorescens mikroskop basert på et kommersielt mikroskop stativ. Denne tenkelig system er utstyrt med med 4 laser kilder (405 NM, 488 NM, 561 NM, 647 NM), en up seer for to-fargen oppdagelsen, og en elektron multiplisere avgift koplet enhet (EMCCD) for bred-åker tenkelig.- Grow RAW 264.7 celler på et glass dekkglass ved 37 ° c i en 5% CO2 fuktet kammer.
- Transfect Moesin-EGFP og PLCδ-PH-mCherry til RAW 264.7 celler ved hjelp av en transfeksjoner Kit (se tabell over materialer) i henhold til produsentens protokoll for å Fluorescensmerkete visualisere Moesin og phosphatidylinositol 4, 5-BISPHOSPHATE (PIP2) molekyler Henholdsvis.
Merk: Moesin har en ITAM motiv som kan aktivere syk, en sentral aktør i fagocytose. PIP2 er kjent for å rekruttere Moesin til cellemembranen. - Sett glasset dekkglass med celler på en prøve kammer montering og montere forsamlingen på AFM prøven scenen.
- Monter perle-modifisert cantilever til AFM skanning hodet.
- Kjør en kraft kurve i et tomt område og Kalibrer kraften med følsomheten fra denne kurven og fjær konstanten målt i trinn 2.2.2.
- Finn en godt isolert celle med riktig fluorescens intensitet i både grønt (Moesin-EGFP) og rød (PLCδ-PH-mCherry) kanaler med 488/561 NM excitations.
- Lever det nakne 6 μm polystyren perle med AFM til cellen overflaten med 1 nN konstant kraft og 500 s kontakt tid.
- Ta opp fluorescens bildeserie av cellen i kontakt med perlen for analyse (vanligvis 10 bilder/s).
Merk: for å redusere photobleaching av fluorophores, bør en relativt lav eksitasjon effekt brukes for å søke i cellene av interesse. I tillegg kan en periodisk eksitasjon ordning benyttes for å forlenge fluorescens tid spor hvis dynamikken i celle responsen er på en langsom tidsskala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4a viser vanlige kraft avstands kurver fra bindings samhandlingen mellom enkelt-T-celle og Single-DC i én metode-trekk-syklus. Den lyse røde kurven er forlengelses kurven, og den mørke røde er en tilbaketrekking kurve. Siden forlengelsen kurve brukes vanligvis for innrykk eller stivhet-analyse, her bare tilbaketrekking kurve er bekymret for celle vedheft. Minimumsverdien (den grønne sirkelen) i kurven gir et mål på maksimal vedheft kraft. Området under kurven (skyggelagt område) representerer arbeidet (energi) som kreves for å skille T-cellen fra DC. Før en fullstendig separasjon, skarpe og trinnvis brudd hendelser er ofte observert. Dette tolkes som membran tethers blir trukket ut fra cellen overflaten på grunn av sterk binding på celle/celle-grensesnittet, og deretter bryte diskret under kontinuerlig trekking. Tallet, høyden og lengden på trinnene kan brukes til å karakterisere de mekaniske egenskapene til cellemembranen21. For T Cell-DC interaksjoner, er vi interessert i bindingen styrke, og dermed bare den maksimale vedheft kraft er analysert for hver kurve. Figur 4b sammenligner vedheft krefter mellom konvensjonelle T-celle (Tconv)/DC og regulatoriske T-celle (treg)/DC. Tconv gjenkjenner peptid antigener presentert av antigen-presentere celler som DC, mens treg er Suppressor T celler som stengte Tconv-mediert immunitet mot slutten av en immunreaksjon. Åpenbart viser treg mye sterkere binding med DC enn Tconv gjør (se figur 4c). Dette er relatert til differensial omløpshastighet på LFA-1 på T celleoverflaten mellom treg og Tconv2. Men den eksakte mekanismen som styrer dette er fortsatt under etterforskningen. Den sterke bindingen av treg til DC er konsistent med lange bindings tider mellom treg og DC observert i vivo22. Enda viktigere, hvis en DC prebinds til en treg, kan dette DC ikke engasjere en annen Tconv hardt (data ikke vises), som fører til redusert T celle grunning eller uimottakelig undertrykkelse2. Dermed gir styrke målingene på T Cell/DC-parene ny innsikt i den undertrykkende mekanismen til treg.
Figur 4: treg celler viser sterk vedheft til DCS. (A) typisk styrke kurver mellom en Tconv-celle og en DC 2.4. Den lyse røde kurven er forlengelses kurven, og den mørke røde kurven er uttrekks kurven. Den minste verdien av den mørke røde kurven indikert av den grønne sirkelen er maksimal vedheft kraft. Det skraverte området representerer energien som kreves for fullstendig separasjon mellom de to cellene. (B) Force målinger for T-celler av indikerte typer i SAMSPILL med DC 2.4 celler. Hvert T-DC-par har minst 14 styrke avlesninger og 5 uavhengige DC-T celle par ble analysert for hver celle type. Grå symboler er for Tconv celler (5); Mørk blå, treg celler (5). Alle datapunkter ble samlet på samme dag. C. Mean styrker av T celler av indikerte typer samspill med DC 2.4 celler. Feilfelt er SEM. * * *, P < 0,001 (student t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 viser hvordan fluorescensmerkete merket phagocytic rå 264.7 cellen reagerer på en enkelt naken 6 μm polystyren perle levert av AFM4. Den eksperimentelle ordningen er vist i figur 5a. PIP2 er merket med PLCδ-PH-mCherry (rød) og Moesin er merket med EGFP (grønn) (se figur 5B). Selv om de begge er beriket på perle/celle-grensesnitt, akkumulering av Moesin i stor grad spores intensiteten endringer av PIP2 som indikert av kymograph plott som viser intensiteten profilene som funksjon av tid langs den indikerte hvit linje i Figur 5c. Sammen med det faktum at Moesin kan binde til PIP2 via sin FERM domenet23, resultatet her antyder at ved å engasjere perlen, membran PIP2 er først sorteres på kontakt nettstedet, som deretter induserer membran rekruttering av MOESIN hvis ITAM domene da aktiverer syk-PI3K trasé, noe som resulterer i en phagocytic hendelse. Således, en ny phagocytic sti innvolvere PIP2-Moesin-syk akse er blitt kjennemerke og høyst betydelig, den doesnâ €™ t avhenger av alle reseptorer på cellen hinne.
Figur 5: Moesin signalering er nedstrøms av PIP2 sortering drevet av den solide strukturen. (A) skjematisk fremstilling av fluorescens avbildning av perle/celle kontakt med en perle levert av AFM. (B) pH-PLCδ-MCherry og MOESIN-EGFP var co-uttrykt i rå 264.7 celler. En polystyren perle ble brukt til å kontakte celleoverflaten. Bilder ble tatt på et 6 s intervall for 500 s. Scale bar, 5 μm. C. lokalisering av PIP2 og Moesin på kontakt stedet (indikert med "*") ble undersøkt med kymographs generert fra den angitte linjen. Dette tallet er endret fra4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM-baserte enkelt celle kraft spektroskopi har utviklet seg til å være et kraftig verktøy for å ta opp de Biofysiske egenskapene til levende celler. For disse programmene, må cantilever være funksjonalisert riktig for å granske bestemte interaksjoner eller egenskaper på celler av interesse. Her er metodene for kobling enkelt T-celle og enkelt mikron størrelse perle til spissen-mindre cantilever er beskrevet henholdsvis. For å feste en enkelt T-celle til cantilever, ble en biokompatible lim valgt som celle lim. Det er en spesielt formulert protein løsning utvunnet fra sjø blåskjell. Dens adhesivity stammer fra polyfenoliske rester som hydroksyl gruppen kan danne hydrogen binding med rester eksponert på celleoverflaten på en uspesifisert måte. Denne bindings metoden forstyrrer vanligvis ikke mobil funksjonene i den bundne cellen. For riktig vedheft, forholdene i cellene som skal festes er også viktig. I tilfelle av fersk renset mus CD4 + T-celler, må de først behandles med menneskelige IL-2 over natten før de kan brukes til cantilever funksjonalisering. Ellers vil de gjennomgå celle død ganske raskt. Hvis cellene ikke er i god stand, selv om de kan festes til cantilever, vil de svært sannsynlig løsne fra cantilever etter bare flere sykluser av makt undersøkelser på grunn av svakere vedheft styrke, fører til en høy svikt rate av styrken målinger. Ulempen med dette biokompatible limet er at det er utsatt for oksidasjon, derfor må koplings prosedyren være ferdig så fort som mulig, noe som kan være utfordrende noen ganger for operatørene. For å redusere oksidasjon av biokompatible lim, er det sterkt anbefalt å forberede 30 μL alikvoter i kryogene hetteglass fylt med N2 gass fra lager løsningen i et N2 luft miljø og oppbevar dem i flytende N2 for best ytelse . Viktigst, beviser dette biokompatible limet å være inert til T-celler i motsetning til andre protein-baserte klebemidler som fibronektin og lectins som kan føre til utilsiktede reseptor Clustering i cantilever/celle kontakt sonen og dermed aktivere T-celler24 ,25,26. Dermed effektene av lim på cellene av interesse må eksperimentelt sjekkes før de kan brukes for celle vedheft. Dette gjelder også andre cantilever-funksjonalisering ordninger som er avhengige av spesifikke molekylære anerkjennelser, slik som antigen/antistoff, biotin/streptavidin, og Concanavalin A/carbohydrated-reseptorer, for å par enkeltceller til cantilever.
For å undersøke T Cell/DC interaksjoner, de optimaliserte parametrene som angitt i protokollen (trinn 1.7.2) ble valgt for kraft spektroskopi. Blant dem, sett-punktverdi og kontakt tid er de to viktigste parametrene. Generelt, optimalisering av set-punktet begynner med små verdier (0,1-0.2 nN). For celle/celle interaksjon, en høy set-punkt-verdi (> 2 nN) fører til store deformasjon av celler og et stort kontaktområde. Dette resulterer vanligvis i en stor vedheft styrke avlesning. Imidlertid stammer analysert kraft fra både konkrete og ikke-spesifikke interaksjoner på celle/celle-grensesnittet på grunn av komplisert natur celle overflater, som til en viss grad skalerer med kontaktområdet. Derfor, jo større sett-punkt-verdi, jo større er bidraget av ikke-spesifikke interaksjoner. Sistnevnte er hva som bør minimeres i noen kraft målinger. I tillegg, for å lære om ikke-spesifikke interaksjoner, kontroll Force målinger som brukerspesifikke antistoff eller knockout (eller knockdown) celler for å blokkere bestemte interaksjoner av interesse må vurderes å få basal avlesning ved gitte sett-punkt verdier . Dette vil bidra til å identifisere de spesifikke interaksjoner i test målingene. Når det kommer til kontakt tid, avhenger det av tidsskalaen hvor analysert molekylære eller cellulære hendelser finner sted. Derfor er tidligere kunnskap om hendelser av interesse viktig. I tilfelle av T celle/deaktivert DC interaksjoner, vedheft molekyl LFA-1 på T celle og ICAM-1 på DC danne et bindende par. Dette Intermoleylære binding skjer ganske raskt når de to kolleger er i posisjon, men det tar tid for molekylene å diffusjon til de riktige stedene på cellemembranen der motstykket molekylene er klare for liming, en diffusjon-begrenset prosess. Derfor setter vi 10 s av kontakt tid for å tillate flere LFA-1/ICAM-1 bonding parene å danne i henhold til skjær flyt eksperimenter av Bongrand gruppe27,28. Til tross for en lengere tid kan sette, for bestemt punkt, lengere tid ikke ' hjelpe når det bonding formasjon er mettet for grenseflaten. Videre kan lange kontakt tider resultere i nedstrøms cellulære responser som kan være ikke av interesse. På den annen side, hvis visse cellulære hendelser er av interesse, slik som phagocytic hendelse beskrevet i det andre programmet der perlen ble delvis omsluttet av macrophage, lang kontakt tid er absolutt nødvendig.
For å akkumulere nok statistikk ble 20 repetisjoner av styrke kurvene samlet inn for hver T Cell/DC par og minst 14 krefter kurver ble brukt for maksimal vedheft kraft analyse. Minst 5 par ble testet i hver testgrupper. For å fjerne prøve logger ble bare nye T Cell/DC-par analysert, noe som betyr at de valgte T-cellene og DCs for undersøkelser ikke hadde noen kontakt historier med andre celler. Selv om prosedyren ovenfor gjør den generelle eksperimenter tid-og kostnadskrevende, er det kanskje den riktige måten å utføre slike kraft målinger på T Cell/DC par.
Feste enkelt perler til cantilever er relativt lett sammenlignet med celle-funksjonalisering på cantilever. Siden epoxy lim med ulike herding ganger er tilgjengelig i markedet, er det mulig å velge en epoxy lim med en lang herding tid, vanligvis på rekkefølgen av timer. Dette gjør at flere perle-modifisert utkragning å være forberedt i en perler prøve. Alternativt kan en UV-kureres lim brukes, noe som kan forkorte herding tiden betydelig, ca 10 min under UV lys28. Uansett hva lim blir brukt, det eneste kritiske trinnet gjennom hele protokollen er å feste et minimum av lim til spissen av cantilever. Det overskytende limet vil ikke bare begrave perlen lett, slik at cellen engasjere med limet i stedet for perlen under målingen, men også endre den mekaniske egenskapen til cantilever, noe som gjør Force-kalibrering unøyaktig. Derfor er det viktig å kontrollere kontaktområdet mellom cantilever og limet slik at bare en liten mengde av limet er begrenset helt på slutten av cantilever. Metoden som er beskrevet her er også tilgjengelig for andre mikron-sized solide partikler, for eksempel monosodium urat krystall15, Alun14, og kolesterol krystall29.
Bortsett fra styrke-undersøkelser, kan AFM også levere en fysisk eller kjemisk stimulans til cellene og påfølgende cellulære hendelser kan overvåkes fluorescensmerkete i sanntid, som demonstrert i det andre programmet. Dette åpner en flott mulighet til å henvende spatiotemporally mer kompliserte biologiske hendelser, slik som dannelsen av immunologiske synapse30, som ikke kan karakteriseres i sanntid av konvensjonelle tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina General program (31370878), State Key program (31630023) og innovative Research Group program (81621002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD? Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J.
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
