Einfache hausgemachte Werkzeuge, um Fruchtfliegen zu behandeln —Drosophila melanogaster

Summary

Beschrieben hier ist die Verwendung von mehreren hausgemachten Werkzeugen zu übertragen, kühlen, und töten erwachsene Drosophila, sowie Glaskultur Fläschchen zu reinigen und Eier zu sammeln. Diese Werkzeuge sind einfach zu machen und sind ziemlich effizient im Umgang mit Drosophila.

Abstract

Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist sowohl in der biologischen Forschung als auch in der Biologieausbildung weit verbreitet. Der Umgang mit erwachsenen Fliegen ist häufig, aber schwierig in der Praxis, da erwachsene Fliegen fliegen. Hier wird gezeigt, wie Sie einige einfache und kostengünstige Werkzeuge herstellen, um schwierige Probleme im Umgang mit Drosophilaanzugehen. Löcher in Schaumstopfen werden gemacht und Pipettenspitzen oder Trichter werden in die Löcher eingesetzt. Fliegen bewegen sich dann nur in eine Richtung in die Pipette-Spitze/Trichter-Assemblage, was eine effiziente Kontrolle der Übertragung von erwachsenen Drosophila in oder aus einer Durchstechflasche ermöglicht. Bestehende Protokolle wurden für die Kühlung von Fliegen modifiziert, indem sie in zerkleinertem Eis gekühlt und auf eine kalte, harte Eispackung übertragen werden. Die Eispackung ist mit einem Stück medizinischer Gaze bedeckt, das immobilisierte Fliegen aus dem kondensierten Wasser hält, wenn sie unter einem Stereomikroskop untersucht werden. Die Fliegen werden schließlich zum Zählen und Sortieren eingeschläfert oder durch Mikrowaden entsorgt. Ein flaschenförmiger Käfig wurde auch zum Sammeln von Eiern entwickelt, sowie ein arbeitssparendes Gerät und ein Begleitprotokoll zur Reinigung von Glaskulturfläschchen.

Introduction

Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein Modellorganismus weit verbreitet in der biologischen Forschung und Biologie-Bildung verwendet, um eine breite Palette von Themen^1,2zu studieren. Die grundlegenden Probleme des Umgangs mit Drosophila sind die Übertragung von Erwachsenen von der Durchstechflasche in die Durchstechflasche und die Immobilisierung der Fliegen, so dass sie leichter zu handhaben sind, da alle Erwachsenen (mit Ausnahme einiger Mutanten^3,4) fliegen können.

Konventionell überträgt ein Forscher Fliegen von einer Durchstechflasche zur anderen, indem er zwei Fläschchen mund-zu-Mund-Propaganda hält, die Fliegen heruntertippt oder Fliegen in eine andere Durchstechflasche fliegen lässt, dann beide Fläschchen trennt und wieder einsteckt⁴. Offensichtlich erfordert dies, dass das Öffnen von zwei Fläschchen mit dem gleichen Durchmesser, und es ist schwer, die Menge der übertragenen Fliegen zu kontrollieren. In der Zwischenzeit erfordert dies schnelle Hände, um die Arbeit zu erledigen, und die Flucht aus streunenden Fliegen kann zu Problemen für das Labor oder Klassenzimmer führen. Das Hinzufügen von extra jungfräulichen Fliegen oder männlichen Fliegen zu einem bereits vorbereiteten Kreuz ist eine weitere Routineaufgabe in Drosophila-Experimenten. Konventionell müssen Fliegen in der Kreuzdurchstecher immobilisiert werden, bevor zusätzliche Fliegen hinzukommen.

Erwachsene Drosophila werden routinemäßig durch Äther, CO2oder kühlend⁵anbeäscht. Im Vergleich zur Ether- und CO2-Exposition ist das Kühlen das kostengünstigste Mittel zur Immobilisierung von Erwachsenen Drosophila und der am wenigsten schädliche für die Fliegen und Forscher (vor allem junge Studenten)^6,7. Wasser, das sich kontinuierlich auf der kalten Oberfläche kondensiert oder Kammer benetzt die Fliegen. Es ist schwierig, die Phänotypen von Nassfliegen zu bestimmen, und sie können leicht während der Manipulation beschädigt werden^8,9. Dies hat verhindert, dass die Kühlmethode immer mehr akzeptiert wird.

Werkzeuge für den Fliegentransfer und ein Verfahren zur Fliegenkühlung wurden zuvor beschrieben¹⁰. Hierbei wird eine modifizierte Kühlanästhesietechnik berichtet, die für Drosophila-Experimente sicher, zuverlässig und machbar ist. Ebenfalls in diesem Papier beschrieben sind 1) Methoden zum Töten von Erwachsenen zum Zählen, Sortieren oder Entsorgen, 2) arbeitssparende Geräte und Protokolle zur Reinigung von Glaskulturfläschchen und 3) ein einfacher Käfig zum Sammeln von Eiern. Die leicht zu gestaltenden und kostengünstigen Tools, die hier beschrieben werden, können verwendet werden, um die schwierigen Probleme der Fliegenhandhabung anzugehen, und diese Methoden wurden getestet und haben sich als robust, zuverlässig und für erfahrene Forscher bewährt.

Protocol

1. Vorbereiten von Werkzeugen und Zubehör

1. Tip/Trichter-Stopper
   1. Erhalten Sie zwei Schwammstecker (der Durchmesser der Stecker muss etwas größer sein als der Innendurchmesser der Fläschchen, die zum Übertragen von Fliegen verwendet werden). Machen Sie ein Loch in den Zentren der Schwammstopfen mit einem beheizten elektrischen Lötkolben.
   2. Besorgen Sie sich zwei 1 ml Pipettenspitzen, schneiden Sie eine mit einem scharfen Messer quer zur Hälfte und entsorgen Sie das spitze Ende. Dann 1,5 cm des spitzen Endes von der zweiten Pipettenspitze schneiden. Kleben Sie die Reste der beiden Pipettenspitzen zusammen mit einem Allzweckkleber, um eine längliche Pipettenspitze zu machen (Abbildung 1A).
   3. Legen Sie einen Trichter und die längliche Pipettenspitze in die Schwammstecker ein, um einen Tip- und Trichterstopfen (nachfolgend T- und F-Stopper genannt) herzustellen und die Pipettenspitze mit einem 100-L-Mikrozentrifugenrohr zu verschließen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die Länge des Trichterstiels muss größer als die Höhe des Steckers sein. Wenn es kürzer als oder gleich der Höhe des Steckers ist, dann entweichen Fliegen aus der Stammöffnung. Das Ende des Trichterstiels sollte mindestens 2 cm über der Oberfläche des Kulturmediums oder dem Boden einer leeren Durchstechflasche liegen. Kleine Trichter (z.B. Scheibendurchmesser <60 mm) mit kleinen innenstieligen Öffnungsdurchmessern (<5 mm) sind vorzuziehen. Zur Herstellung eines F-Stoppers kann entweder ein Glas oder ein Kunststofftrichter verwendet werden. Für Biologieklassen sind Kunststofftrichter jedoch vorzuziehen, da sie weniger leicht brechen als Glastrichter.
2. Mikrosezierende Nadeln
   1. Erhalten Sie mechanische Bleistifte, die sich in der Hand wohlfühlen, und Insektenstifte, die den Durchmessern (z. B. 0,5 mm, 0,7 mm) ihrer Bleiminen entsprechen.
   2. Schneiden Sie die breiten Enden der Insektenstifte mit einer Zange und legen Sie den Schnitt flach. Ersetzen Sie die Leitung durch die Stifte (Abbildung 1B). Drücken Sie die Klicktaste und füttern Sie 0,5–1 cm eines Stifts, um eine Sezierung durchzuführen. Reinigen Sie den Stift und schieben Sie ihn nach einer Sezieraktivität vollständig wieder in die Bleistiftwelle, um ihn für jede Person sicher zu handhaben.
      HINWEIS: Mikrosezierende Nadeln sind nicht nur bei Dersektionen von Organen wie Larvenspeicheldrüsen nützlich, sondern auch beim Zählen und Sortieren von toten erwachsenen Fliegen.
3. Harte Eispackungen
   1. Erhalten Sie mehrere wiederfreibare harte Eispackungen (große Eispackungen sind vorzuziehen). Abbildung 1C zeigt ein gut funktionierendes Eispaket, das 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm misst und die Ober- und Unterseite hat, die vollständig flach sind.
   2. Schneiden Sie medizinische Gaze (nichtsteril) in Stücke, die etwas kleiner als die kalten Oberflächen der Eispackungen sind, die sie bedecken. Beispielsweise ist ein Stück medizinischer Gaze, das etwas kleiner als 26,5 cm x 14,5 cm ist, vorzuziehen, um eine eispackung zu bedecken, die in Abbildung 1Cdargestellt ist.
      HINWEIS: Das notwendige Zubehör für diese Kühlwerkzeuge sind: eine Eisbox (wir verwendeten eine 25 cm x 15 cm x 15 cm Schaumstoffbox für eine Person und 37 cm x 28 cm x 20 cm Box für mehr als eine Person), die verwendet wird, um zerkleinertes Eis zu speichern; eine Feinpunkt-Pinzette, die verwendet wird, um gekühlte Fliegen an ihren Flügeln zu greifen und sie in eine Durchstechflasche zu übertragen; ein Paar schützende Arbeitshandschuhe, mit denen gekühlte Eispackungen aus einem Gefrierschrank von -20 °C entnehmen werden; und Kunststofffolie, die zur Abdeckung der Bühne eines Stereomikroskops verwendet wird.
4. Drosophila Ei Sammlung Käfig
   HINWEIS: Fertige Drosophila Eiersammelkäfige sind bei vielen Biotechnologie-Unternehmen^{erhältlich 11}. Beschrieben wird hier ein kleiner Acryl-Flaschen-Ei-Sammlungskäfig für 60 mm Petrischalen (Abbildung1D links; das Käfigdesign ist in der Mitte dargestellt). Es kann für andere Petrischalengrößen (z.B. 100 mm, 35 mm) angepasst werden. Dies ermöglicht die Übertragung von Fliegen in den oder aus dem Käfig mit Leichtigkeit. Ein einfacher Käfig kann wie folgt zubereitet werden.
   1. Verwenden Sie einen Druckmesser, um eine Soft-Kunststoff-Getränkeflasche (500 ml, Innendurchmesser ca. 65 mm) in ein ungefähres Verhältnis von 2:1 (spitzes Ende: stumpfes Ende) zu schneiden und das stumpfe Ende zu verwerfen.
   2. Wickeln Sie einen Streifen Kartenpapier um eine Apfelsaftplatte (Innendurchmesser 60 mm) mit Klebeband [die Apfelsaftplatte wird verwendet, um Eier zu sammeln (Abbildung 1E, rechts)].
5. Schnurloser Schlauchbürstentreiber
   1. Erhalten Sie einen Akku-Bohrer (max. Geschwindigkeit = 500 Rpm).
   2. Erhalten Sie eine Rohrbürste, die Borsten an den Seiten sowie an der Vorderseite hat. Idealerweise sollte der Durchmesser der Bürste etwas größer sein als der Durchmesser der zu reinigenden Kulturfläschchen. Schneiden Sie das Ende des Griffs, damit er in das Bohrfutter eingesetzt werden kann (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Das notwendige Zubehör für diese Reinigungswerkzeuge sind Edelstahlschwämme und lange Manschettengummihandschuhe.

2. Transfer von Erwachsenenfliegen von Vial A nach Vial B

HINWEIS: Die Übertragung von erwachsenen Fliegen von einer Durchstechflasche in eine andere ist die häufigste Praxis, die in Drosophila-Experimenten durchgeführt wird [z.B. die Übertragung von Fliegen von der alten Kultur (A) auf die frische Kultur (B) oder von einer Kreuzdurchstechflasche (A) auf leere Durchstechflasche (B)] zur Anästhesisierung. Das hier beschriebene Protokoll kann für alle Aktivitäten zur Übertragung von Erwachsenenfliegen verwendet werden. Sofern nicht anders angegeben, wird dieses Protokoll verwendet, um Fliegen von Durchstechflasche A auf Durchstechflasche B in diesem Papier zu übertragen.

1. Überprüfen Sie den Stiel des Trichters eines F-Stoppers und die Pipettenspitze eines T-Stoppers sorgfältig, und löschen Sie dann alle Fliegen, die in den Stopfen verbleiben, mit einem Gummiluftgebläse. Dieser Schritt ist von größter Bedeutung, insbesondere wenn ein Satz von T- und F-Stoppern für die kontinuierliche Übertragung verschiedener Drosophila-Linien verwendet wird.
2. Tippen Sie auf die Fliegen in der Durchstechflasche A und ersetzen Sie den Stecker durch einen T-Stopper, dann stecken Sie die Durchstechflasche B mit einem F-Stopper.
3. Durchstechflasche A über Durchstechflasche B umkehren, das Pipettenspitzenende des T-Stoppers in die Trichteröffnung des F-Stoppers einsetzen, die Kante der invertierten Durchstechflasche A klopfen, damit Fliegen aus der Pipettespitze und durch den Stiel des Trichters rutschen können, und in die Durchstechflasche B fallen. Wenn ein altes Essen in der Durchstechflasche A weniger kompakt wird, kann es fallen, wenn die Durchstechflasche A invertiert und geklopft wird. In einer solchen Situation, invertieren Durchstechflasche B über Durchstechflasche A und lassen Sie die Fliegen in Durchstechflasche B kriechen.
4. Trennen Sie den T-Stopper vom F-Stopper. Kappen Sie das Pipettenspitzenende des T-Stoppers mit einem 200-L-Mikrozentrifugenrohr, wenn die verbleibenden Fliegen in durchstecherungsmittel A kurzzeitig auf andere Fläschchen übertragen werden müssen; Andernfalls entfernen Sie den T-Stopper und stecken Sie die Durchstechflasche A wieder ein. Entfernen Sie den F-Stopper und stecken Sie die Durchstechflasche B wieder ein.

3. Immobilisieren von Fliegen durch Chillen

1. Halten Sie harte wiederfreibare Eispackungen in einem -20 °C Gefrierschrank für mindestens 24 h vor Gebrauch auf.
2. Legen Sie eine gekühlte, harte Eispackung bei Raumtemperatur (RT) für 20 min. Etwas befeuchten Sie ein Stück nicht-aseptische medizinische Gaze mit etwas fließendem Wasser und lassen Sie es eng an der Oberfläche der Eispackung zu haften. Die medizinische Gaze kann beim nächsten Fliegenkühlen wiederverwendet werden. Gleichzeitig eine leere Durchstechflasche in zerkleinertem Eis abkühlen lassen.
3. Transfer erwachsene Fliegen, die immobilisiert werden müssen, in die gekühlte leere Durchstechflasche (CEV). Wenn die beiden Transferfläschchen getrennt sind, bedecken Sie den CEV mit einer Petrischale oder einem Stecker und klopfen Sie den CEV gegen das zerkleinerte Eis, um alle Fliegen im CEV nach unten zu tippen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis alle Fliegen immobilisiert sind. Die Fliegen werden innerhalb von 30 s immobilisiert. Als nächstes legen Sie den CEV für 1 min ins Eis. Es ist nicht ratsam, zu viele Fliegen auf einmal zur Anästhesisierung zu übertragen.
4. Gießen Sie die gekühlten Fliegen auf die medizinische Gaze, die die Eispackung bedeckt. Verteilen Sie die überlappenden Fliegen mit einem Pinsel und stellen Sie sicher, dass jede Fliege durch die kalte Oberfläche des Eispakets gekühlt werden kann. Wenn ein gekühlter harter Eispackung leicht anschwillt, legen Sie ihn auf ein Handtuch und arbeiten Sie auf seiner flachen Seite.
5. Entfernen Sie die Bühnenclips aus dem Stereomikroskop, bedecken Sie die Bühne mit einem Stück Plastikfolie und legen Sie den Eissack auf die Bühne. Schalten Sie das obere Licht ein (eine kaltlichte Quelle ist wünschenswert), fokussieren Sie das Stereomikroskop und bewegen Sie den Eissack, bis die gekühlten Fliegen deutlich zu sehen sind.

4. Töten von erwachsenen Fliegen zum Zählen, Sortieren oder Entsorgen

1. Transfer Erwachsene fliegt in eine leere Durchstechflasche und bedecken Sie sie mit einer Petrischale.
2. Invertieren Sie die Durchstechflasche, erhitzen Sie sie für 1 min + 20 s in einer Mikrowelle, und lassen Sie die toten Fliegen in die Petrischale fallen.
3. Tragen Sie Schutzhandschuhe an und nehmen Sie die Durchstechflasche aus der Mikrowelle. Gießen Sie die toten Fliegen auf eine weiße Papierkarte, zählen oder untersuchen Sie die Fliegen mit einer Mikrosezierender Nadel unter einem Stereomikroskop und entsorgen Sie die Fliegenkörper nach Beobachtung in einer Mülltonne.
4. Um unerwünschte Fliegen zu töten, erhitzen Sie die Fliegen für 2-3 min in einer Mikrowelle, dann tippen Sie die Kadaver in eine Mülltonne.
   HINWEIS: Es ist nicht ratsam, einige flügelmutende Stämme (z.B. Flügellängenmutanten) zur Untersuchung zu töten, da es schwierig ist, von den Kadavern zu beurteilen, wenn die Flügel über die Spitze des Bauches hinausreichen, was bei Wildfliegen zu beobachten ist.

5. Übertragen von Fliegen in/ aus flaschenförmigen Eier-Sammlung Käfig

HINWEIS: Wie bereits erwähnt, werden T- und F-Stopper verwendet, um Fliegen in den und aus dem Eiersammelkäfig zu übertragen. Fliegen müssen während dieses Prozesses nicht beästhetisiert werden. Weitere Details, wie die Zubereitung des Apfelsaftmediums, die Eiersammlung und die Dechorionisierung, finden Sie in der Literatur¹².

1. Legen Sie den Eiersammelkäfig in den Apfelsaftteller oder montieren Sie den Apfelsaftteller in den Käfig aus einer Softdrinkflasche. Versiegeln Sie das Gelenk um die beiden Komponenten mit einem Streifen Paraffinfolie.
2. Legen Sie so viele Fliegen wie möglich in den Käfig und stecken Sie den Käfig nach dem Übertragen der Fliegen mit einem Schaumstoffstopfen wieder ein.
3. Um die Nahrung für Fliegen im Käfig zu ändern, übertragen Sie die Fliegen im Käfig in eine leere Durchstechflasche.
4. Ersetzen Sie die Apfelsaftplatte und versiegeln Sie sie erneut, und übertragen Sie die Fliegen dann von der Durchstechflasche zurück in den Käfig.
5. Wenn die Eiersammlung endet, übertragen Sie die Fliegen in eine leere Durchstechflasche und übertragen Sie sie in Kulturfläschchen.

6. Reinigung Glas Kultur Fläschchen

HINWEIS: Im Allgemeinen enthält eine alte Kulturdurchstecher lebende Fliegen. In dem hier beschriebenen Protokoll müssen diese Fliegen NICHT vor der Reinigung getötet werden, es sei denn, es handelt sich um transgene Fliegen.

1. Entfernen Sie alle permanenten Markertinten aus den Glaskulturfläschchen mit nassen, rostfreien Stahlschwämmen.
2. Die Kulturfläschchen im fließenden Wasser einweichen.
   1. Füllen Sie ein Laborspülbecken mit Wasser, fügen Sie flüssige Geschirrspülseife in das Wasser, und mischen.
   2. Tauchen Sie die Kulturfläschchen in das Wasser ein, dann entfernen Sie den Stecker, so dass das Wasser in die Durchstechflasche laufen kann. Das Geschirrwaschmittel im Wasser lässt alle verbleibenden erwachsenen Fliegen auf den Boden sinken und im Wasser ertrinken.
   3. Die alten Kulturfläschchen mindestens 30 min im Wasser einweichen.
3. Lösen Sie das Futter des Bohrers, legen Sie die Reagenzbürste ein und ziehen Sie das Futter wieder fest. Überprüfen Sie die Richtung des Rotationsselektors, und stellen Sie sicher, dass sich der Bohrer im Uhrzeigersinn dreht. Stellen Sie den Geschwindigkeitsauslöser ein und stellen Sie sicher, dass die maximale Geschwindigkeit weniger als 500 U/min beträgt.
4. Reinigen Sie die Kulturfläschchen.
   1. Reinigen Sie die Kulturfläschchen grob.
      1. Legen Sie einen langen Manschettengummihandschuh auf die nicht-dominante Hand und halten Sie die Durchstechflasche im Wasser.
      2. Halten Sie den Akku-Rohrbürstentreiber mit der bloßen dominanten Hand, drücken Sie den Pinsel in die Kultur-Fläschchen und drücken Sie den Auslöser.
         HINWEIS: Tauchen Sie die Batterie nicht ins Wasser. Die rotierende Bürste zerbricht alte Lebensmittel, Pupa usw. und entfernt mehr als 95% des Abfalls.
      3. Den Abfall in eine separate Mülltonne kippen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Abfalls in jeder Durchstechflasche gereinigt wurde.
   2. Reinigen Sie die Kulturfläschchen gründlich.
      1. Reinigen Sie die Rohrbürste, entleeren sie und reinigen Sie das Waschbecken, und füllen Sie es mit sauberem Wasser auf.
      2. Entfernen Sie die Restabfälle aus jeder Kulturdurchstechflasche, wie in Abschnitt 6.4.1 beschrieben.

Representative Results

Die T- und F-Stopper wurden als eine Reihe einfacher Werkzeuge entwickelt, die angepasst und in jeder Fliegenübertragung eingesetzt werden können. Das Übertragen von Fliegen aus einer alten Kultur in mehrere frische Kulturen beinhaltet das Entfernen der Stecker der frischen Fläschchen, deren Austausch durch F-Stopper, das Abklopfen der Fliegen in der alten Durchstechflasche, das schnelle Entfernen des Steckers und das Ersetzen durch einen T-Stopper. Wenn das alte Essen kompakt ist, dann ist es wichtig, die alte Durchstechflasche umzudrehen und die Spitze des T-Stoppers in die Öffnung eines F-Stoppers einzufügen, dann tippen Sie die Fliegen in die frische Durchstechflasche. Anschließend werden die T- und F-Stopper ausgetauscht und die Durchstechflaschen wieder eingesteckt. Wenn das alte Essen weniger kompakt wird, wird empfohlen, die frische Durchstechflasche umzudrehen, den F-Stopper am T-Stopper zu montieren und die Fliegen in die frische Durchstechflasche kriechen zu lassen.

Um einem bereits vorbereiteten Kreuz zusätzliche Fliegen hinzuzufügen, ist es wichtig, die Fliegen in der Kreuzdurchstecher nach unten zu tippen und den Stecker durch einen F-Stopper zu ersetzen. Dann muss der Experimentator die gekühlten Fliegen unter einem Stereomikroskop untersuchen, eine gewünschte Fliege mit einer spitzen Pinzette am Flügel aufnehmen und durch den Stiel des Trichters in die Kreuzflässerrutschen rutschen lassen. Wenn eine Fliege im Stiel eines Trichters gefangen ist, wird empfohlen, sie vorsichtig mit einem Luftgebläse aufzublasen und sie in die Durchstechflasche rutschen zu lassen. Es ist dann erforderlich, den F-Stopper zu ersetzen und die Durchstechflasche wieder einzustecken, wenn genügend Fliegen für ein Kreuz gesammelt wurden. T- und F-Stopper wurden 2010 eingeführt^13,14; Bisher haben mehr als 1.200 Studierende von diesen Fliegenübertragungsgeräten profitiert. T- und F-Stopper wurden auch Instruktoren und Forschern durch einen Laborleitfaden¹⁵vorgestellt, der für den Einsatz in Lehr- und Forschungslabors übernommen wurde.

Bestehende Kühlanästhestheisierungsmethoden wurden für den Einsatz in dieser Studie modifiziert. Zerkleinertes Eis oder Eis-Wasser-Mischungen werden verwendet, um die erwachsenen Fliegen zu kühlen und dann die immobilisierten Fliegen auf die kalte Oberfläche eines Eispakets zu übertragen, das mit einem Stück nicht steriler medizinischer Gaze bedeckt ist. Die Gazefasern saugen das kondensierte Wasser auf und halten die Fliegen bei der Untersuchung trocken. Gleichzeitig ermöglichen die winzigen Löcher zwischen den Kett-/Schussfäden, dass Fliegen die kalte Oberfläche des Eispakets berühren und unbeweglich halten (Abbildung 2). Bei einer Raumtemperatur von 25 °C steigt die Temperatur der Oberfläche eines gekühlten, harten Eisbeutels dramatisch von -19 °C auf -2 °C innerhalb von 20 min und erreicht ein Plateau, das sowohl für alte als auch für frisch geschlüpfte Fliegen sicher ist (Abbildung 3). Ein Eispaket funktioniert recht gut innerhalb des Plateaus, und die gekühlten Fliegen gewinnen bei Raumtemperatur innerhalb von 30 s das Bewusstsein zurück. Da ein harter Eispack dünn ist, kann er dann unter ein Stereomikroskop gestellt werden, um die Fliegen zu untersuchen. Die hier beschriebene harte Eispackung kostet weniger als 2 Dollar; Darüber hinaus wurden 60 Hartissäcke für eine Klasse von 100-150 Studenten pro Semester verwendet, die seit vielen Jahren wiederverwendbar sind. Diese modifizierte Version der kühlenden Anästhesie-Technik wurde vor drei Jahren in eine bestimmte Genetikklasse eingeführt, und ihre Robustheit wurde von mehr als 300 Studenten und denen an anderen Universitäten getestet.

Es wurde festgestellt, dass Mikrowellen-Dielektrikumeineinseinschlag ein schnelleres, bequemeres Mittel ist, um erwachsene Fliegen zu töten (wenn sie nach beobachtung nicht mehr benötigt werden) im Vergleich zu Mitteln wie Überetherisieren oder Tiefkühlen (Tabelle 1). Mikrowellen-Dielektrikumsheizung erfordert eine viel kürzere Zeit, um Fliegen zu töten als Überetherisieren oder Tiefkühlen. Alle Fliegen sterben innerhalb von 80 s, so dass das Zählen und Sortieren einer großen Charge von Fliegen innerhalb eines kurzen Zeitrahmens machbar ist¹⁶. Unter der Annahme, dass der Experimentator Fliegen 20x töten muss, um Chargen für ein Experiment zu zählen und zu sortieren, dauert es 3 h + 20 min und 5 h, um die Fliegen durch Übertauen bzw. Tiefkühlen zu töten; jedoch werden nur 27 min mit einer Mikrowelle benötigt.

Ähnlich wie bei überetherisierten Fliegen dehnen Mikrowellenfliegen die Flügel im rechten Winkel von den Körpern aus. Im Allgemeinen waren die durch Mikrowaving getöteten Flugkörper deutlich leichter als die durch Äther oder Schüttelfrost getöteten, aber die Hitze verzerrt nicht die Körperform, und die Kadaver werden nicht knackig oder turgid. Merkmale (z. B. Körperfarbe, Augenfarbe und Flügelform) von Mikrowellenfliegen ähneln denen, die durch Äther oder Gefrieren getötet werden (Abbildung 4), und es gibt keine signifikanten Unterschiede in der Flügelgröße (Fläche, Länge, Breite) von Fliegen, die von den drei Agenten getötet wurden ( Tabelle 1). Daher können Schlachtkörper von Fliegen, die durch Mikrowaving getötet werden, zum Zählen, Sortieren und Messen einiger Merkmale, wie z. B. Flügelgröße, verwendet werden. Mikrowellenheizung ist auch eine gute Methode, um unerwünschte Fliegen zu töten und sie rechtzeitig zu entsorgen. Darüber hinaus werden Fliegenleichen (Flaschen mit brennbarem Ethanol, Methanol oder Seifenlösungen), die zur Lagerung von toten oder ausrangierten Fliegen verwendet werden, in Fliegenlaboren oder Biologieklassen³nicht mehr benötigt.

Für dieses Protokoll wurde ein kleiner, flaschenförmiger Eiersammelkäfig entworfen. Mit T- und F-Stoppern kann eine große Anzahl von Fliegen in den oder aus dem Käfig übertragen werden, und die Apfelsaft-Mediumplatten können mit größerer Leichtigkeit gewechselt werden. Schließlich müssen die Fliegen vor und nach der Eiabfuhr nicht anästhesiert werden.

Für das Protokoll wurde auch ein Schnurlosrohrbürstentreiber und ein Protokoll für die Verwendung dieses Geräts zur Reinigung von Kulturfläschchen entwickelt. Diese batteriebetriebene Röhrenbürste kann leicht alte Lebensmittel und Pupas, die an einer Glaskultur-Durchstechflasche befestigt sind, aufbrechen, eine Durchstechflasche kann innerhalb von 30 s gereinigt werden, und die Effizienz der Reinigung wird stark erhöht; Daher ist die Reinigung großer Mengen von Glaskulturfläschchen keine mühsame Aufgabe mehr.

Abbildung 1: Werkzeuge für den Umgang mit Drosophila. (A) Gezeigt werden fliegende Werkzeuge und das notwendige Zubehör. Sie sind (von links nach rechts) ein Luftgebläse (verwendet, um erwachsene Fliegen zu sprengen, die im Trichterstiel verbleiben); T- und F-Stopper (in Fläschchen eingeführt); und eine leere Durchstechflasche mit einer Petrischale (36 mm, die untere Hälfte einer 40 mm Petrischale). Die Schaumstopfen sind größer als die Öffnungen der Fläschchen, so dass sie mit Fläschchen mit variablen Öffnungsgrößen verwendet werden können. Die hier beschriebene Größe kann bei Bedarf geändert werden. (B) Gezeigt werden Materialien, die für die Mikrosezierenden Nadeln benötigt werden. (C) Gezeigt wird die harte Eispackung, mit der Fliegen gekühlt werden. (D) Gezeigt werden der flaschenförmige Eiersammelkäfig (links), sein Gestaltungsplan (Mitte) und ein einfacher Eiersammelkäfig aus einer Softdrinkflasche (rechts) (E) Gezeigt werden die Materialien, die für den Schnurlosrohrbürstentreiber benötigt werden. Die weiße rundum bürstende Bürste, die am Bohrer montiert werden kann, wird verwendet, um Petri-Gerichte zu reinigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gekühlte Fliegen auf der kalten Oberfläche eines Eispakets. Das Kondenswasser wird von der medizinischen Gaze absorbiert und die gekühlten Fliegen trocken gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Variation der Temperatur der Eispackung mit der Zeit. Die Daten wurden aus fünf harten Eispackungen gesammelt, und die Temperaturen wurden an zwei Stellen in der Mitte eines Eisbeutels mit einem Infrarotthermometer bei einem RT von 25 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 29 % gemessen. Die Gefriertemperatur betrug -24,5 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich von Durch Mikrowaden getöteten Flugkadavern mit den durch Ethylether und Tiefgefrieren getöteten Schlachtkörpern. Wenn die durch Mikrowaving getöteten Fliegenkadaver unter einem Stereomikroskop untersucht wurden, wurden keine Vernäpfssaugen oder Verzerrungen an den Körpern gefunden, und es wurden keine spürbaren Unterschiede in Körperfarbe, Augenfarbe und Flügelform festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tötungsmittelb	Zeit, die verwendet wird, um Fliegen zu töten	Gewicht (mg/30 Fliegen)		Flügel (mm oder mm2)d
		Weiblich	Männlich	Weiblich			Männlich
				Flächens	Längens	Breitens	Flächens	Längens	Breitens
hitze	1 min 20 s	36,60 bis 0,00 a Ac	22,65 bis 0,95 a A	1,51 bis 0,16	2,30 bis 0,12	0,92 bis 0,05	1,20 bis 0,09	2,06 bis 0,08	0,83 bis 0,03
Chill doch	15 Min.	41,20 bis 0,10 b B	25,70 bis 1,00 ab A	1,57 bis 0,15	2,37 bis 0,12	0,94 bis 0,05	1,23 bis 0,12	2,07 bis 0,10	0,84 bis 0,05
äther	10 Min.	43,35 bis 0,85 b B	26,9 bis 0,70 b A	1,57 bis 0,16	2,36 bis 0,11	0,94 bis 0,05	1,18 bis 0,10	2,05 bis 0,10	0,83 bis 0,04
a Die erwachsenen Drosophila sind wilde Typ Drosophila melanogaster. Sie werden in Peking, China, gefangen und mehr als 5 Jahre in meinem Labor aufbewahrt und bei 25 °C in Maismehlmedium gehalten.
b Die verwendeten Geräte sind Wärme: 1.300 W Mikrowellenherd; Kühlkühlung: Kühlschrank (-30 °C); Ether: 2 ml Äther, und die innere Größe des Äthers beträgt 170 ml.
c Innerhalb jeder Spalte unterscheiden sich die Mittelwerte desselben Buchstabens durch den Duncan-Mehrfachbereichstest nicht wesentlich, Klein-/Großbuchstaben zeigen p = 0,05/0,01 an.
d Fliegen werden zufällig aus der gleichen Kulturdurchstechflasche ausgewählt. Zwanzig rechte Flügel des gleichen Geschlechts wurden von den Fliegen gesammelt, die von demselben Agenten getötet wurden, und zwei Replikationen wurden beibehalten. Digitale Fotos von jedem Flügel wurden aufgenommen und flügelgröße wurde mit ImagePro Plus Software gemessen
ns: Nicht signifikant bei p = 0,05

Tabelle 1: Die Auswirkungen der drei Tötungsmittel auf die Schlachtkörpergewichte und Flügelgrößen der erwachsenen Drosophila.

Discussion

Einige hausgemachte Werkzeuge für den Umgang mit grundlegenden Aktivitäten in Drosophila Aufzucht und Experimente beteiligt sind in diesem Papier beschrieben. Diese Werkzeuge sind einfach, aber ziemlich effektiv. Praktisch kann jedes Labor diese Werkzeuge mit Leichtigkeit herstellen, und ein Forschungs- oder Lehrlabor muss keine vorgefertigte Alternative finden, die vielleicht nicht lokal verfügbar ist.

Fliegentransfer ist die häufigste Praxis und eine schwierige Aufgabe in Drosophila-Experimenten. Leider wurden bisher keine beschriebenen Übertragungswerkzeuge^3,4,12,17 Hier, T- und F-Stopper beschrieben. Diese einfachen Werkzeuge machen die Übertragung der Fliegen viel einfacher und kontrollierbarer, und weniger Fliegen entkommen während der Übertragung, wie die Tatsache zeigt, dass in den letzten Jahren nur wenige Streufliegen in den Genetikklassen gefunden wurden. Da der Schwammstecker elastisch ist, ist es nicht erforderlich, dass die Öffnung der Fläschchen den gleichen Innendurchmesser hat. Zusätzlich darf jeweils nur eine Fliege die Öffnung der Pipettenspitze passieren; Daher verhindern T-Stopper, dass Fliegen in eine Durchstechflasche stürzen, und der Experimentator kann den Prozess leicht stoppen und die Anzahl der übertragenen Fliegen kontrollieren. T-Stopper können auch verhindern, dass alte Lebensmittel in eine frische Durchstechflasche fallen. T- und F-Stopper sind einfach zu machen und zu verwenden, und selbst ein unerfahrener Handler kann Fliegentransfers schnell und einfach abschließen.

F-Stopper werden verwendet, um Fliegen in eine neue Durchstechflasche zu führen. Die erwachsenen Fliegen neigen dazu, sich unter dem Stopfen zu assoziieren und entkommen nicht aus dem Stamm des Trichters. Dies macht einige Arbeit einfacher und kontrollierbarer (z.B. das Übertragen von Fliegen von einer Durchstechflasche in eine andere oder das Hinzufügen von extra jungfräulichen Fliegen oder männlichen Fliegen zu einem vorbereiteten Kreuz). Es wurde festgestellt, dass nur sehr wenige Fliegen aus dem Stamm des Trichters entweichen werden, wenn eine Durchstechflasche für eine ziemlich lange Zeit (z.B. 1 h) im Labor platziert wird.

In diesem Beitrag wird eine praktikable Kühlmethode zur Immobilisierung von Fliegen beschrieben. Diese Methode ist eine großartige Alternative zu Äther und CO₂ und kann sowohl in Forschungs- als auch in Lehrlabors eingesetzt werden. Diese Methode ist besonders freundlich zu einem Lehrlabor, da ein Lehrer nicht so besorgt über potenzielle Gesundheitsrisiken für Studenten sein oder große Anstrengungen unternehmen muss, um einen teuren Staging-Bereich in einem überfüllten Lehrlabor zu bauen. Diese Methode ist kostengünstig, da die Icepacks kostengünstig und wiederverwendbar sind. Ein Forscher oder Student kann fliegen überall kühlen und inspizieren, da dieses "kalte Pad" nicht mit einem Rohr verbunden ist. Diese Methode ist nicht nur für Menschen, sondern auch für Fliegen sicher, da das System bei Temperaturen über -2 °C arbeitet. Fliegen werden leicht ausgeknockt und bleiben unbeweglich, solange sie auf der kalten Oberfläche bleiben und nicht getötet werden. Die Fliegen gewinnen schnell wieder das Bewusstsein, sobald sie auf Raumtemperatur zurückkehren. Diejenigen, die diese Methode anwenden, benötigen keine Ausbildung, und es gibt keine Bedenken wegen übermäßiger oder unzureichender Anästhesiekonzentrationen. Die Experimentatoren sollten jedoch genau auf die Größe der Eispackung achten, da kleine Eispackungen (z. B. 400-500 ml, ca. 19 cm x 11 cm x 2,5 cm) beim Fliegenkühlung nicht wünschenswert sind, da sie beim Einfrieren anschwellen und es unangenehm wird, auf den Oberflächen zu arbeiten.

Für das Protokoll wurde auch ein flaschenförmiger Eiersammelkäfig entwickelt. Unter Ausnutzung der T- und F-Stopper können große Mengen von Fliegen in den Käfig hinzugefügt oder übertragen werden, ohne dass die Fliegen vorher immobilisiert werden müssen. Es wurde festgestellt, dass Mikrowellenheizung eine effiziente Möglichkeit ist, Fliegen für Inspektionen oder Rückwürfe abzutöten. Eine mechanische Bleistift-basierte Mikrodissektionsnadel und ein Bohrwerkzeug wurden ebenfalls eingesetzt. Alle diese Werkzeuge sind einfach und funktionieren gut.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A pair of pliers
Cordless drill driver			max speed: 500 rpm
Electric soldering iron
File
Funnel			diameter of disk<60mm
Ice box
Insect pins
Infrared thermometer			HCIYET HT-830
Long cuff rubber gloves
Mechanical pencils
Medical gauze
Microcentrifuge tube			100 ul
Microwave oven
Parafilm
Peri dish			internal diameter 60 mm
Pipette tips			1 ml
Plastic film
Plastic Peri dish			Φ36 mm used to cover the empty vial
Point tweezers
Protective work gloves
Re-freezable hard icepacks			26.5×14.5×2.5 cm or larger
Rubber air blower
Snap cutter
Soft drink bottle			500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
Sponge stopper
Stainless steel sponges
Tube brush
Vial			Φ34 mm × 90 mm