Summary
Beskrevet her er bruken av flere hjemmelagde verktøy for å overføre, chill, og drepe voksne Drosophila, samt å rengjøre glass kultur hetteglass og samle egg. Disse verktøyene er enkle å lage og er ganske effektive i å håndtere Drosophila.
Abstract
Frukten fly, Drosophila melanogaster, er mye brukt både i biologisk forskning og biologi utdanning. Håndtering voksen fluer er vanlig, men vanskelig i praksis, som voksne fluer fly. Demonstrert her er hvordan å gjøre noen enkle og kostnadseffektive verktøy for å ta vanskelige problemer i håndteringen av Drosophila. Hull i skum propper er laget og pipette tips eller trakter er satt inn i hullene. Fluer flytter deretter bare i én retning inn i pipette spissen/trakt samling, noe som gir effektiv kontroll av overføring av voksen Drosophila inn i eller ut av et hetteglass. Eksisterende protokoller har blitt modifisert for kjølig-anesthetizing fluer ved Chilling i knust is og overføre dem på en kald, hard ismasken overflate. Ismasken er dekket med et stykke medisinsk gasbind som holder immobilisert fluer fra kondensert vann når undersøkt under en stereomikroskopet. Fluene er endelig euthanized for telling og sortering eller forkastet av mikrobølgeovnen. En flaske-formet buret har også blitt utviklet for å samle egg, samt en arbeidsbesparende enhet og tilhørende protokoll for rengjøring glass kultur hetteglass.
Introduction
Frukten fly, Drosophila melanogaster, er en modell organisme mye brukt i biologisk forskning og biologi utdanning for å studere et bredt spekter av emner1,2. De grunnleggende problemene med håndtering Drosophila er overføring av voksne fra hetteglass til hetteglass og immobilisering av fluene slik at de er lettere å håndtere, som alle voksne (med unntak av noen mutanter3,4) kan fly.
Konvensjonelt, en forsker overfører fluer fra ett hetteglass til et annet ved å holde to hetteglass munn til munn, trykke på fluene ned eller la fluer å fly opp i et annet hetteglass, deretter skille og replugging begge hetteglass4. Selvfølgelig krever dette at åpningen av to ampuller med samme diameter, og det er vanskelig å kontrollere mengden av fluer overført. I mellomtiden, dette krever raske hender for å få jobben gjort, og rømmer Stray fluer kan føre til problemer for laboratoriet eller klasserommet. Legge ekstra jomfru fluer eller mannlige fluer til en allerede forberedt kors er en annen rutine oppgave i Drosophila eksperimenter. Konvensjonelt, må fluer være immobilisert i korset hetteglasset før tilsetning av ekstra fluer.
Voksen Drosophila er rutinemessig anesteserte av ETER, co2, eller Chilling5. Sammenlignet med Eter og co2 eksponering, kjøling er den mest kostnadseffektive agent for immobilizing voksen Drosophila og minst skadelig for både fluer og forskere (spesielt unge studenter)6,7. Men vann som kondenserer kontinuerlig på den kalde overflaten eller kammer tisser fluene. Det er vanskelig å bestemme fenotyper av våte fluer, og de kan lett bli skadet under manipulasjon8,9. Dette har beholdt den skremmende metoden fra å bli mer allment akseptert.
Verktøy for flue overføring og en metode for fly kjøling har tidligere blitt beskrevet10. Heri er en modifisert kjøling anestesi teknikk rapporteres som er trygt, pålitelig, og gjennomførbart for Drosophila eksperimenter. Også beskrevet i dette papiret er 1) metoder for å drepe voksne for telling, sortering, eller forkaste, 2) arbeidsbesparende enheter og protokoller for rengjøring glass kultur hetteglass, og 3) et enkelt bur for å samle egg. De lett utformede og kostnadseffektive verktøyene som er beskrevet her, kan brukes til å håndtere de vanskelige spørsmålene om fly håndtering, og disse metodene har blitt testet og er bevist å være robuste, pålitelige og enkle å håndtere for erfarne og uerfarne forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjøre verktøy og tilbehør
- Tips/trakt propper
- Skaff to svamp plugger (diameteren av pluggene må være litt større enn den interne diameteren av hetteglassene som brukes til å overføre fluer). Lag et hull i sentrene av svamp plugger med en oppvarmet elektrisk loddebolt.
- Skaff to 1 mL pipette spisser, skjær en i halv tvers med en skarp kniv, og kast den spisse enden. Deretter klippes 1,5 cm av den spisse enden av den andre pipette spissen. Lim restene av de to pipette tipsene sammen med et Universal lim for å lage en langstrakt pipette spissen (figur 1a).
- Sett inn en trakt og den forlengede pipette spissen i svamp pluggene for å lage en spiss og trakt stopper (heretter referert til som T-og F-propper) og cap pipette spissen med en 100 μL mikrosentrifugen Tube (figur 1a).
Merk: Lengden på trakt stammen må være større enn høyden på pluggen. Hvis det er kortere enn eller lik høyden på pluggen, så flyr vil flykte fra stammen åpningen. Enden av trakt stammen bør være plassert minst 2 cm over overflaten av kultur mediet eller bunnen av et tomt hetteglass. Små trakter (for eksempel disk diameter < 60 mm) med små innvendige stilk åpning diametere (< 5 mm) er å foretrekke. Enten et glass eller en plast trakt kan brukes til å lage en F-propp. Men plast trakter er å foretrekke for biologi klasser, som de bryter mindre lett enn glass trakter.
- Microdissecting nåler
- Skaff mekaniske blyanter som føles behagelige i hånden og insekt pinner som matcher diameteren (f.eks. 0,5 mm, 0,7 mm) av deres bly påfylling.
- Skjær de brede endene av insekt pinner med en tang og fil kuttet flatt. Skift ut ledningen med pinnene (figur 1B). Trykk på Klikk-knappen og mate ut 0,5-1 cm av en nål for å gjennomføre en disseksjon. Rengjør pinnen og skyv den helt tilbake i blyant akselen etter en disseksjon aktivitet for å gjøre det trygt for enhver person å håndtere.
Merk: Microdissecting nåler er nyttige ikke bare i dissections av organer som larvestadiet spyttkjertler, men også i telling og sortering døde voksne fluer.
- Hard icepacks
- Skaffe adskillige refreezable hard icepacks (stor-tok mål icepacks er å foretrekke). Figur 1C viser en icepacks som fungerte bra, som måler 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm og har topp-og bunn sider som er helt flatt.
- Skjær medisinsk gasbind (usteril) i stykker som er litt mindre enn de kalde overflater av icepacks de dekker. For eksempel, et stykke medisinsk gasbind litt mindre enn 26,5 cm x 14,5 cm er å foretrekke å dekke en ismasken vist i figur 1C.
Merk: Det nødvendige tilbehøret for disse kjøling verktøy inkluderer: en is boks (vi brukte en 25 cm x 15 cm x 15 cm skum boks for en person og 37 cm x 28 cm x 20 cm boks for mer enn én person), som brukes til å lagre knust is; et par fine-punkts pinsett, som brukes til å fange kjølt fluer av sine vinger og overføre dem til et hetteglass; et par beskyttende arbeid hansker, som brukes til å ta kjølt icepacks ut av en-20 ° c fryser; og plastfilm, som brukes til å dekke scenen i en stereomikroskopet.
- Drosophila egg samling bur
Merk: Klar-laget Drosophila egg samling bur er tilgjengelig fra mange bioteknologi selskaper11. Beskrevet her er en liten akryl flaske-formet egg samling bur for 60 mm Petri retter (figur 1d venstre; buret design er vist i midten). Den kan tilpasses andre Petri parabol størrelser (f. eks, 100 mm, 35 mm). Dette gjør at overføringen av fluer inn i eller ut av buret med letthet. En enkel bur kan forberedt som følger.- Bruk en smekk kutter for å kutte en myk plast drikk flaske (500 mL, innvendig diameter ca. 65 mm) til en omtrentlig 2:1 (spiss ende: Butt end) forhold og kast den butte enden.
- Pakk en stripe av kortpapir rundt en eple juice plate (innvendig diameter 60 mm) med teip [eple juice platen brukes til å samle egg (figur 1e, høyre)].
- Trådløs rør børste driver
- Skaff en trådløs Drill driver (maks hastighet = 500 RPM).
- Få en tube pensel som har bust langs sidene så vel som foran. Ideelt sett bør diameteren på børsten være litt større enn diameteren på kulturen hetteglassene som må rengjøres. Skjær enden av håndtaket slik at den kan settes inn i bore Chuck (figur 1d).
Merk: Nødvendig tilbehør for disse rengjøring verktøy inkluderer rustfritt stål svamper og lang mansjett gummi hansker.
2. overføring av voksen fluer fra hetteglass A til hetteglass B
Merk: Overføring av voksne fluer fra ett hetteglass til et annet er den vanligste praksisen utført i Drosophila eksperimenter [f.eks. overføring av fluer fra gammel kultur (a) til fersk kultur (b) eller fra et kryss hetteglass (a) til tomt hetteglass (b)] for anesthetizing. Protokollen som beskrives her, kan brukes til alle voksne fly overføringsaktiviteter. Med mindre annet er oppgitt, brukes denne protokollen til å overføre fluer fra hetteglass A til hetteglass B i hele dette papiret.
- Kontroller stammen i trakten til en F-propp og pipette spissen av en T-propp nøye, og deretter fjerne eventuelle fluer som forblir i propper med en gummi luft blåser. Dette trinnet er av overordnet betydning, spesielt når ett sett av T-og F-propper brukes for kontinuerlig overføring av ulike Drosophila linjer.
- Trykk ned fluene i hetteglass A og Bytt ut pluggen med en T-propp, og plugg deretter hetteglass B med en F-propp.
- Snu hetteglass A over hetteglass B, sett dråpe spissen på T-proppen inn i trakt åpningen til F-proppen, slå kanten av invertert hetteglass A for å la fluer gli ut av pipette spissen og gjennom stammen i trakten, og slipp inn hetteglass B. Hvis noen gammel mat i hetteglass A blir mindre kompakt, kan den falle når hetteglasset A er invertert og banket. I en slik situasjon, inverter hetteglass B over hetteglass A og la fluene krype opp i hetteglass B.
- Skill T-proppen fra F-proppen. Cap dråpe spissen på T-proppen med en 200 μL mikrosentrifugen slange hvis de resterende fluene i hetteglass A må overføres til andre hetteglass et øyeblikk; ellers, Fjern T-proppen og modemets hetteglass A. Fjern F-proppen og modemets hetteglass B.
3. immobilizing fluer av Chilling
- Hold hardt refreezable icepacks i en-20 ° c fryser i minst 24 timer før bruk.
- Plasser en kjølt, hard ismasken ved romtemperatur (RT) i 20 min. litt fukte et stykke av ikke-aseptisk medisinsk gasbind med litt rennende vann og la den tett klamre seg til overflaten av ismasken. Den medisinske gasbind kan gjenbrukes i neste flue Chilling. På samme tid, chill et tomt hetteglass i knust is.
- Overfør voksne fluer som må immobilisert inn i kjølt tomme hetteglasset (CEV). Når de to overføre ampuller er separert, dekke CEV med en Petri parabol eller en plugg og banke CEV mot knust is til å tappe alle fluene i CEV ned til bunnen. Gjenta denne prosessen flere ganger til alle fluene er immobilisert. Fluene vil bli immobilisert innen 30 s. Deretter plasserer CEV i isen i 1 min. Det er ikke tilrådelig å overføre for mange fluer på en gang for anesthetizing.
- Hell den kjølte fluer ut på medisinsk gasbind som dekker isen Pack. Spre ut de overlappende fluer med en pensel og sørg for at hver flue kan bli kjølt av den kalde overflaten av ismasken. Hvis en kjølt hard ismasken sveller litt, Legg den på et håndkle og arbeid på sin flate side.
- Fjern scene klippene fra stereomikroskopet, dekk scenen med et stykke plastfilm, og sett ismasken på scenen. Slå på det øverste lyset (en kald lyskilde er ønskelig), fokusere stereomikroskopet og flytte ismasken til kjølt fluer kan sees klart.
4. Killing voksen fluer for telling, sortering, eller forkaste
- Overfør voksen fluer inn i et tomt hetteglass og dekk den med en Petri parabolen.
- Inverter hetteglasset, varme det i 1 min + 20 s i en mikrobølgeovn, og la de døde fluene slippe inn i Petri parabolen.
- Sett på vernehansker av beskyttende arbeid og ta hetteglasset ut av mikrobølgeovnen. Hell de døde fluer på et hvitt papir kort, telle eller undersøke fluer med en microdissecting nål under en stereomikroskopet, og kast av flykropper i en søppelbøtte etter observasjon.
- Å drepe uønskede fluer, varme fluene for 2-3 min i en mikrobølgeovn, og deretter trykke på skrotter i en søppelbøtte.
Merk: Det er ikke tilrådelig å drepe noen vinge mutant stammer (f. eks vinge lengde mutanter) for undersøkelse, som det er vanskelig å bedømme fra skrotter hvis vingene strekker seg utover spissen av magen, som er sett i vill-type fluer.
5. overføring av fluer i/ut av flaske-formet egg Collection Cage
Merk: Som nevnt ovenfor, T-og F-propper brukes til å overføre fluer inn og ut av egget samlingen buret. Fluer trenger ikke å være anesthetized gjennom hele denne prosessen. Andre detaljer, for eksempel forberede eple juice medium, egg samling, og dechorionization, finnes i litteraturen12.
- Sett egget samlingen buret inn i eple juice plate eller montere eple juice plate til buret laget av en brus flaske. Forsegle skjøten rundt de to komponentene med en stripe av para fin film.
- Plasser så mange fluer som mulig inn i buret og modemets buret med en skum propp etter overføring av fluer.
- For å endre mat for fluer i buret, overføre fluene i buret til en tom hetteglass.
- Bytt ut Eple saft platen og forsegle den, og Overfør deretter fluene fra hetteglasset tilbake til buret.
- Når egg samlingen slutter, overføre fluer i et tomt hetteglass og overføre dem til kultur ampuller.
6. rengjøring glass kultur hetteglass
Merk: Vanligvis inneholder en gammel kultur hetteglass Live fluer. I protokollen som er beskrevet her, trenger ikke disse fluene å bli drept før rengjøring med mindre de er transgene fluer.
- Fjern eventuelle permanent markør blekk fra glass kulturen hetteglass med våte, rustfritt stål svamper.
-
Sug kulturen hetteglassene i rennende vann.
- Fyll en laboratorie vask med vann, tilsett flytende oppvasksåpe i vannet, og bland.
- Dypp kultur hetteglassene i vannet, og fjern deretter støpselet, slik at vannet kan renne inn i hetteglasset. Oppvaskmiddel i vannet vil gjøre eventuelle gjenværende voksne fluer synke til bunns og drukne i vannet.
- Sug den gamle kulturen hetteglass i vann i minst 30 min.
- Løsne Chuck av boret, sett reagensglasset pensel og trekk Chuck. Kontroller retningen på rotasjons velgeren, og påse at boret roterer med klokken. Juster hastigheten utløser og sikre at den maksimale hastigheten er mindre enn 500 RPM.
-
Rengjør kultur hetteglassene.
- Rengjør kulturen hetteglassene grovt.
- Sett en lang mansjett gummi hanske på den ikke-dominerende hånden og hold hetteglasset i vannet.
- Hold den trådløse røret pensel driver med bare dominerende hånd, klem børsten inn i kulturen hetteglasset, og klem avtrekkeren.
Merk: Ikke dypp batteriet i vannet. Den roterende børsten vil bryte opp gammel mat, puppe, etc., og fjerne mer enn 95% av avfallet. - Dumpe avfallet i et eget søppel kan. Gjenta denne prosessen til det meste av avfallet i hvert hetteglass er rengjort.
- Rengjør kultur hetteglassene grundig.
- Rengjør røret pensel, avløp og rengjør vasken, og fyll den med rent vann.
- Fjern gjenværende avfall fra hvert hetteglass som beskrevet i avsnitt 6.4.1.
- Rengjør kulturen hetteglassene grovt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T-og F-propper ble utviklet som et sett med enkle verktøy som kan tilpasses og brukes i enhver flue overføring aktiviteter. Overføring av fluer fra en gammel kultur til flere friske kulturer innebærer å fjerne pluggene på de friske hetteglassene, erstatte dem med F-propper, deretter trykke ned fluene i det gamle hetteglasset, raskt fjerne pluggen, og erstatte den med en T-propp. Hvis den gamle maten er kompakt, er det viktig å snu det gamle hetteglasset og sette tuppen av T-proppen inn i åpningen til en F-propp, og deretter trykke på fluene ned i det friske hetteglasset. Deretter utføres det å erstatte T-og F-propper og replugging hetteglassene. Hvis den gamle maten blir mindre kompakt, anbefales det å snu den friske hetteglasset over, montere F-proppen til T-proppen, og la fluene krype opp i det friske hetteglasset.
For å legge til ekstra fluer til en allerede forberedt kors, er det viktig å tappe fluene i korset hetteglasset ned og erstatte pluggen med en F-propp. Deretter må eksperimentator undersøke kjølt fluer under en stereomikroskopet, plukke opp en ønsket fly av vingen ved hjelp av et par spisse pinsett, og la den gli inn i korset hetteglasset gjennom stammen i trakten. Hvis en flue er fanget i stammen i en trakt, anbefales det å forsiktig blåse på den med en luft blåser og la den gli inn i hetteglasset. Skifte F-propp og replugging hetteglasset når nok fluer for et kryss har blitt samlet er da nødvendig. T-og F-propper ble innført i 201013,14; så langt har mer enn 1 200 studenter dratt nytte av disse fly overføring enheter. T-og F-propper har også blitt introdusert for instruktører og forskere gjennom en laboratorie guide15, som har blitt vedtatt for bruk i undervisnings-og forskningslaboratorier.
Eksisterende chill anesthetizing metoder har blitt modifisert for bruk i denne studien. Knust is eller isvann blandinger brukes til å chill de voksne fluene deretter overføre immobilisert fluer på den kalde overflaten av en ismasken dekket med et stykke usteril medisinsk gasbind. Gasbind fibrene suge opp kondensert vann og holde fluene tørre når de blir undersøkt. Samtidig, de små hullene mellom Warp/WEFT trådene tillater fluer å berøre den kalde overflaten av ismasken og holde dem immobile (figur 2). Ved en romtemperatur på 25 ° c, øker temperaturen på overflaten av en kjølt, hard ismasken dramatisk fra-19 ° c til-2 ° c innen 20 min og når et platå som er trygt for både gamle og nylig klekket fluer (Figur 3). En ismasken fungerer ganske bra innenfor platået, og kjølt fluer gjenvinne bevisstheten ved romtemperatur innen 30 s. Fordi en hard ismasken er tynn, kan den deretter plasseres under en stereomikroskopet for å undersøke fluene. Den harde ismasken som beskrives her koster mindre enn $2; Videre har 60 hard icepacks for en klasse av 100-150 studenter hvert semester blitt brukt, og de er gjenbrukbare i mange år. Denne modifiserte versjonen av kjøling anestesi teknikken ble introdusert til en bestemt genetikk klasse for tre år siden, og dens robusthet har blitt testet av mer enn 300 studenter og de i andre universiteter.
Det har blitt funnet at mikrobølgeovn dielektrisk oppvarming er en raskere, mer praktisk agent å drepe voksne fluer (hvis de ikke lenger er nødvendig etter observasjon) sammenlignet med agenter som overetherizing eller dyp frysing (tabell 1). Mikrobølgeovn dielektrisk oppvarming krever en langt kortere tid å drepe fluer enn overetherizing eller dyp frysing. Alle fluer dø innen 80 s, så telling og sortering av en stor gruppe fluer innen kort tidsramme er gjennomførbart16. Forutsatt at eksperimentator må drepe fluer 20x å telle og sortere batcher for et eksperiment, vil det ta 3 h + 20 min og 5 h å drepe fluene ved overetherizing og dyp frysing, henholdsvis; men bare 27 min er nødvendig med en mikrobølgeovn.
I likhet med overetherized fluer, microwaved fluer forlenge vingene i rett vinkel fra kroppene. Vanligvis fly skrotter drept av mikrobølgeovnen var betydelig lettere enn de som ble drept av Eter eller Chilling, men varmen ikke forvrenge ikke kroppen form, og skrotter ikke blir skarp eller turgid. Egenskaper (f. eks, kroppsfarge, øyenfarge, og vinge form) av microwaved fluer er lik de drept av Eter eller frysing (Figur 4), og det er ingen vesentlige forskjeller i vinge størrelser (areal, lengde, bredde) av fluer drept av de tre agentene ( Tabell 1). Derfor kan skrotter av fluer drept av mikrobølgeovnen brukes til telling, sortering, og måling av noen egenskaper, for eksempel vinge størrelse. Mikrobølgeovn oppvarming er også en god metode for å drepe uønskede fluer og kast dem på en riktig måte. I tillegg fly morgues (flasker som inneholder brennbare etanol, metanol, eller såpe løsninger), som brukes til å lagre døde eller kasserte fluer, er ikke lenger nødvendig i fly laboratorier eller biologi klasser3.
En liten, flaske-formet egg samling buret ble designet for denne protokollen. Ved hjelp av T-og F-propper, kan et stort antall fluer overføres inn i eller ut av buret, og eple juice medium platene kan endres med større letthet. Til slutt, gjør fluene ikke trenger anesthetizing før og etter egg samling.
En trådløs tube pensel driver og protokoll for bruk av dette utstyret til ren kultur ampuller ble også utviklet for protokollen. Denne batteridrevne rør børsten kan enkelt bryte ned gammel mat og puppe festet til et glass kultur hetteglass, et hetteglass kan rengjøres innen 30 s, og effektiviteten av renhold økes sterkt; Derfor er rengjøring store mengder glass kultur hetteglass ikke lenger en kjedelig oppgave.
Figur 1: verktøy som brukes i håndtering av Drosophila. (A) vist er fly-overføre verktøy og nødvendig tilbehør. De er (fra venstre til høyre) en luft blåser (brukes til å blåse ut voksne fluer igjen i trakten stammen); T-og F-propper (settes inn i hetteglass); og et tomt hetteglass dekket med en Petri parabol (36 mm, den nederste halvdelen av en 40 mm Petri parabolen). Skum proppene er større enn åpningene på hetteglassene slik at de kan brukes med hetteglass med varierende åpnings størrelser. Størrelsen som er beskrevet her, kan endres om nødvendig. (B) vist er materialer som trengs for mikro-dissekere nåler. (C) vist er den harde ismasken som brukes til å chill fluer. (D) vist er den flaske-formet egg samling bur (venstre), sin design plan (midten), og en enkel egg samling bur laget av en brus flaske (høyre) (E) vist er materialene som trengs for den trådløse rør pensel driver. Den hvit-farget rund pensel som kan monteres til bore sjåføren brukes til å rengjøre Petri retter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kjølt fluer på den kalde overflaten av en ismasken. Den kondenserende vann absorberes av medisinsk gasbind, og kjølt fluer holdes tørt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: variasjon av temperaturen på ismasken overflate med tiden. Dataene ble samlet inn fra fem harde icepacks, og temperaturene ble målt på to steder i midten av en ismasken med et infrarødt termometer ved en RT på 25 ° c og relativ luftfuktighet på 29%. Fryse temperaturen var-24,5 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenligning av fly skrotter drept av mikrobølgeovnen til de drept av etanol Eter og dyp frysing. Når fly skrotter drept av mikrobølgeovnen ble undersøkt under en stereomikroskopet, ingen scorches eller skjevheter ble funnet på likene, og ingen merkbare forskjeller ble funnet i kroppen farge, øyenfarge og vinge form. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Killing agentb | Tid brukt til å drepe fluer | Vekt (mg/30 fluer) | Vinge (mm eller mm2)d | ||||||
| Kvinnelige | Mannlige | Kvinnelige | Mannlige | ||||||
| OmrådeNS | LengdeNS | BreddeNS | OmrådeNS | LengdeNS | BreddeNS | ||||
| Varme | 1 min 20 s | 36.60 ± 0,00 a Ac | 22.65 ± 0.95 a | 1.51 ± 0.16 | 2.30 ± 0.12 | 0.92 ± 0,05 | 1.20 ± 0.09 | 2.06 ± 0.08 | 0.83 ± 0.03 |
| Chill | 15 min | 41.20 ± 0.10 b B | 25.70 ± 1.00 AB A | 1.57 ± 0,15 | 2.37 ± 0.12 | 0.94 ± 0,05 | 1.23 ± 0.12 | 2.07 ± 0.10 | 0.84 ± 0,05 |
| Eter | 10 min | 43.35 ± 0.85 b B | 26.9 ± 0.70 b A | 1.57 ± 0.16 | 2.36 ± 0.11 | 0.94 ± 0,05 | 1.18 ± 0.10 | 2.05 ± 0.10 | 0.83 ± 0.04 |
| a den voksne Drosophila er Wild type Drosophila melanogaster. De er fanget i Beijing, Kina og holdt i laboratoriet mitt i mer enn 5 år, og opprettholdt ved 25 ° c i cornmeal medium. | |||||||||
| b utstyret som brukes er varme: 1 300 W mikrobølgeovn; Chill: kjøleskap (-30 ° c); Eter: 2 mL Eter, og etherizer indre størrelse er 170 mL. | |||||||||
| c i hver kolonne, betyr etterfulgt av samme bokstav er ikke signifikant forskjellig av Duncan ' s Multiple Range test, lavere/store bokstaver indikerer p = 0,05/0.01 | |||||||||
| d fluer velges tilfeldig fra samme kultur hetteglass. Tjue høyre vinger av samme kjønn ble samlet inn fra fluene drept av samme agent og to replikeringer ble opprettholdt. Digitale fotografier av hver vingene ble tatt og vinge størrelse ble målt ved hjelp av ImagePro Plus-programvare | |||||||||
| NS: ikke-signifikant ved p = 0,05 | |||||||||
Tabell 1: virkningene av de tre draps agentene på stamme vektene og vinge størrelsene til voksen Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noen hjemmelagde verktøy for håndtering av grunnleggende aktiviteter involvert i Drosophila oppdrett og eksperimentering er beskrevet i denne utredningen. Disse verktøyene er enkle, men ganske effektive. Nesten, enhver Lab kan gjøre disse verktøyene med letthet, og en forskning eller en pedagogisk laboratorium trenger ikke å finne et ferdig alternativ som er kanskje ikke tilgjengelig lokalt.
Fly overføring er den vanligste praksisen og en vanskelig oppgave i Drosophila eksperimenter. Dessverre, til nå har det ikke vært noen beskrevet overføre verktøy3,4,12,17 her, T-og F-propper er beskrevet. Disse enkle verktøyene gjør overføring av fluene mye enklere og mer kontrollerbar, og færre fluer flykte under overføring, noe som gjenspeiles av det faktum at få spredt fluer har blitt funnet i genetikk klassene de siste årene. Som svamp pluggen er elastisk, det krever ikke at åpningen av hetteglassene har samme innvendig diameter. I tillegg kan bare én flue passere gjennom åpningen av pipette spissen om gangen; Derfor, T-propper hindre fluer fra fosser inn i et hetteglass, og eksperimentator kan lett stoppe prosessen og kontrollere antall fluer overført. T-propper kan også forhindre gammel mat fra å slippe inn i et friskt hetteglass. T-og F-propper er enkle å lage og bruke, og selv en uerfaren handler kan fullføre fly overføringer raskt og enkelt.
F-propper brukes til å veilede fluer i et nytt hetteglass. Den voksne fluer tendens til å assosiere under proppen og ikke flykte fra stammen i trakten. Dette gjør noe arbeid enklere og mer kontrollerbar (f. eks, overføre fluer fra ett hetteglass til et annet eller legge ekstra jomfru fluer eller mannlige fluer til et forberedt kors). Det har blitt funnet at når et hetteglass er plassert i laboratoriet for en ganske lang tid (f. eks 1 t), bare svært få fluer vil flykte fra stammen i trakten.
I denne utredningen er en mulig kjøling metode for immobilizing fluer beskrevet. Denne metoden er et flott alternativ til Eter og CO2 og kan brukes i både forskning og undervisning laboratorier. Denne metoden er spesielt vennlig til en pedagogisk laboratorium, som instruktør ikke trenger å være så opptatt av potensielle helserisiko for studenter eller gjøre store anstrengelser for å konstruere en kostbar staging-området i en overfylt pedagogisk laboratorium. Denne metoden er kostnadseffektiv, da icepacks er billig og gjenbrukbare. En forsker eller student kan chill og inspisere fluer hvor som helst, da dette "kald Pad" ikke koble til noen pipe. Denne metoden er ikke bare trygt for folk, men også for å fluer, som systemet fungerer ved temperaturer høyere enn-2 ° c. Fluer er lett slått ut og forbli Immobile så lenge de forblir på den kalde overflaten og blir ikke drept. Fluene gjenvinne bevisstheten raskt når de kommer tilbake til romtemperatur. De som bruker denne metoden krever ikke en trening periode, og det er ingen bekymringer med overdreven eller utilstrekkelig anestesi konsentrasjoner. Imidlertid bør forskere være oppmerksom på størrelsen på ismasken, som små-sized icepacks (f. eks 400-500 mL, ca. 19 cm x 11 cm x 2,5 cm) er ikke ønskelig for flue kjøling siden de hovne opp når de er frosset og det blir vanskelig å arbeide på overflater.
En flaske-formet egg samling buret ble også utviklet for protokollen. Dra nytte av T-og F-propper, store mengder fluer til buret kan legges til eller overføres uten å kreve immobilisering av fluene på forhånd. Det har blitt funnet at oppvarming av mikrobølgeovn er en effektiv måte å drepe fluer for inspeksjon eller forkaste. En mekanisk blyant-basert microdissection nål og bore-basert en rensning verktøyet var likeledes anvende. Alle disse verktøyene er enkle og fungerer bra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A pair of pliers | |||
| Cordless drill driver | max speed: 500 rpm | ||
| Electric soldering iron | |||
| File | |||
| Funnel | diameter of disk<60mm | ||
| Ice box | |||
| Insect pins | |||
| Infrared thermometer | HCIYET HT-830 | ||
| Long cuff rubber gloves | |||
| Mechanical pencils | |||
| Medical gauze | |||
| Microcentrifuge tube | 100 ul | ||
| Microwave oven | |||
| Parafilm | |||
| Peri dish | internal diameter 60 mm | ||
| Pipette tips | 1 ml | ||
| Plastic film | |||
| Plastic Peri dish | Φ36 mm used to cover the empty vial | ||
| Point tweezers | |||
| Protective work gloves | |||
| Re-freezable hard icepacks | 26.5×14.5×2.5 cm or larger | ||
| Rubber air blower | |||
| Snap cutter | |||
| Soft drink bottle | 500 ml, internal diameter c.a. 65 mm | ||
| Sponge stopper | |||
| Stainless steel sponges | |||
| Tube brush | |||
| Vial | Φ34 mm × 90 mm |
References
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Ashburner, M., Roote, J. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 585-599 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2004).
- Ashburner, M., Thompson, J. The laboratory culture of Drosophila. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. 1-109 (1978).
- Ratterman, D. M. Eliminating ether by using ice for Drosophila labs. Tested Studies For Laboratory Teaching. O'Donnell, M. A. , 259-265 (2003).
- Culturing techniques for Drosophila . , Available from: https://www.ptbeach.com/cms/lib/NJ01000839/Centricity/Domain/113/ap%20biology%20Labs/Culturing%20techniques%20for%20Drosophila.pdf (2019).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. (2006).
- Artiss, T., Hughes, B. Taking the Headaches Out of Anesthetizing Drosophila: A Cheap & Easy Method of Constructing Carbon Dioxide Staging. The American Biology Teacher. 69 (8), e77-e80 (2007).
- Qu, W. -H., Zhu, T. -B., Yang, D. -X. A Modified Cooling Method and its Application in Drosophila Experiments. Journal Of Biological Education. 49 (3), 302-308 (2015).
- Egg-laying cages for drosophila. , Available from: https://www.kisker-biotech.com/frontoffice/product?produitId=0H-19-17 (2018).
- Roberts, D. B. Drosophila: a practical approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (1998).
- Tang, M., Peng, Q. -F., Yang, D. Two devices for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 45 (11), 49-50 (2010).
- Zhou, T. -y, Gan, J., Yang, D. Preparation of sponge plug and sponge plug based fly transferring device for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 46 (6), 49-50 (2011).
- Yang, D. Genetics laboratory investigation. , 3rd edn, Science Press. (2016).
- Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, (2018).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting Started: An Overview on Raising and Handling Drosophila. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Humana Press. (2008).
