Summary
כאן אנו מתארים שתי גישות כדי לאפיין את האירועים הקיטוב התא ב לימפוציטים B במהלך היווצרות של IS. הראשון, כולל כימות של גיוס והשלד של ארגון מחדש על הקרום סינפטית. השני הוא גישה ביוכימית, כדי לאפיין שינויים בקומפוזיציה של הסנטרוחלק, אשר עובר קיטוב לסינפסה החיסונית.
Abstract
הכרה של משטח קשור אנטיגנים על ידי קולטן התא B (BCR) מפעיל את היווצרות סינפסה החיסונית (IS), שבו הן ספיגת איתות ו אנטיגן מתואמים. היא היווצרות כולל שיפוץ דינאמי אקטין מלווה גיוס מקוטב לקרום סינפטית של הסנטרוחלק והקשורים לאורגולאים תאיים כגון ליסוזומים ומערכת golgi. בשלבים הראשוניים של שיפוץ אקטין לאפשר לתאי B להגדיל את משטח התא שלהם ולמקסם את כמות אנטיגן-bcr מכלולי התאספו בסינפסה. בתנאים מסוימים, כאשר B תאים מזהים אנטיגנים הקשורים משטחים נוקשים, תהליך זה משולב לגיוס המקומי הפרשה של lysosomes, אשר יכול להקל על החילוץ אנטיגן. אנטיגנים uptaken הם הפנימו לתוך המקצועית ליסוכמה תאים לעיבוד לתוך פפטידים, אשר נטענים על הגדול ביותר היסטוליםקומפלקס מורכבים II (MHC-II) מולקולות עבור מצגת נוספת תאים מסייע T. לכן, לימוד דינמיקה של ארגון הקשור להיווצרות IS הוא חיוני כדי להבין כיצד התאים B מופעלים. במאמר הנוכחי נדון הן בהדמיה והן בטכניקה ביוכימית המשמשת לחקר שינויים במיקום של מיצוב מאורגני ובשלד ציטותאי המשויכים להיווצרות הנמצא בתאי B.
Introduction
לימפוציטים B הם חלק חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית אחראי להפקת נוגדנים נגד איומים שונים והפולשים פתוגנים. היעילות של ייצור נוגדנים נקבעת על ידי היכולת של B תאים כדי לרכוש, התהליך והנוכחי אנטיגנים נתקל או בטופס מסיסים או קשור למשטח1,2. הכרה של אנטיגנים המחוברים אל פני השטח של תא מציג, על ידי bcr, מוביל היווצרות של מגע התרבות קרוב שנקרא הוא3,4. בתוך פלטפורמת דינמי זה הן BCR תלוי במורד הזרם איתות הפנמה של אנטיגנים לתוך אנדו-lysosome תאים מתרחש. אנטיגנים uptaken מעובדים והתאספו על מולקולות MHC-II ולאחר מכן הציגו לימפוציטים T. אינטראקציות ה-B-T פרודוקטיבי, כינה את שיתוף הפעולה של תא B-T, לאפשר B לימפוציטים לקבל את האותות המתאימים, אשר לקדם את הבידול שלהם לתוך מייצרת נוגדנים תאי פלזמה או תאים זיכרון8.
שני מנגנונים היו מעורבים בהפקת אנטיגן על ידי תאי B. הראשון מסתמך על הפרשת הפרוטסים שמקורם ליסוזומים העוברים גיוס והיתוך ב סינפטית שסועה5,6. השני, תלוי ברירן IIA-תיווך מושך כוחות שמפעיל את הפולשים של אנטיגן המכיל ממברנות אשר הפנימו לתוך בורות מצופה clathrin7. המצב של הפקת אנטיגן מסתמך על המאפיינים הפיזיים של קרום שבו אנטיגנים מצויים. אף על פי כן, בשני המקרים, תאי B עוברים שני אירועי שיפוץ עיקריים: התארגנות מארגון השלד הציטומה ופולריזציה של אורגלים ל-IS. השלד הפנימי של actin שיפוצים כרוך שלב התפשטות ראשונית, שם actin תלוי בליטות בקרום סינפטית להגדיל את פני השטח במגע עם האנטיגן. הדבר מלווה בשלב התכווצות, שבו BCRs בשילוב עם אנטיגנים מרוכזים במרכז של זה על ידי פעולה מתואמת של מנועים מולקולריים אקטין שלד מעצב שיפוץ8,9,10, 11. פולריזציה של אורגלים מסתמך גם על שיפוץ של שלד ציטוטין. למשל, הסנטרוחלק הופך להיות בלתי משולב מן הגרעין, על ידי הדפלוניזציה המקומית של actin הקשורים, אשר מאפשר את מיקום מחדש של האורגאל הזה הוא5,12. ב-B תאים, מיקום מחדש של הסנטרוחלק לקוטב תא אחד (IS) מדריכים לגיוס לקרום סינפטית, אשר על הפרשה יכול להקל על החילוץ ו/או עיבוד של אנטיגנים הקשור למשטח6. ליסוזומים שגויס ב IS מועשר עם MHC-II, אשר מעדיף היווצרות של פפטיד-MHC-II מכלולי בתאי אנדוזומבית להיות מוצגים T תאים13. בנוסף, מערכת Golgi נצפתה גם להיות מגויס היטב ל-IS14, הרומז כי golgi נגזר שלפוחיות מן השביל הסוד יכול להיות מעורב בהפקת אנטיגן ו/או עיבוד.
בסך הכל, מארגני התאיים והשלד הציטותאים בתאי B במהלך היווצרות סינפסה הם הצעדים העיקריים המאפשרים רכישת אנטיגן יעיל עיבוד נדרש עבור הפעלה נוספת שלהם. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים על איך לבצע הדמיה וניתוח ביוכימיים בתאי B ללמוד שיפוץ תאיים של אורגלים הקשורים היווצרות של IS. טכניקות אלה כוללות: (i) Immunofluorescence ניתוח תמונה של תאי B המופעל עם מחרוזת אנטיגן מצופה, על הכיסויים אנטיגן מצופה, אשר מאפשר הדמיה וכימות של רכיבים תאיים המגייסו ל IS ו (ii ) בידוד של מספר שברים מועשר ב-B בתאי על ידי הסתבכות על מעברי הצבע של סוכרוז, המאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים ל-centrosome העלולים להיות מעורבים בוויסות קוטביות התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות IIA 1.6 B תאים.
1. B הפעלת תא עם חרוזים מצופי אנטיגן
- הכנת חרוזים מצופי אנטיגן
- כדי להפעיל תאים B, השתמש ב-NH2חרוזים מצופה בשמן עם אנטיגן (מצופה Ag), אשר מוכנים באמצעות 50 μl (~ 20 x 106 חרוזים) של 3 יקרומטר NH2חרוזים עם הפעלת (bcr-ligand +) או לא הפעלה (bcr-ligand-) אנטיגנים.
- עבור IIA 1.6 B תאים להשתמש anti-IgG-F (ab ')2 קטע כמו bcr-ligand + ו Anti-igg-F (ab ')2 או סרום שור אלבומין (BCR) כמו bcr-ligand-. כדי להפעיל את התאים B הראשי או IgM+ B קו התא להשתמש אנטי-igm-F (ab ')2 כמו bcr-ligand + ו-BCR כמו bcr-ligand-.
הערה: כדי למנוע את הכריכה של ליגשים לקולטן Fc, השתמש ב-F (ab) או F (ab)2 שברי נוגדנים במקום נוגדנים באורך מלא. - כדי להמשיך עם הכנת חרוזים מצופה Ag, מניחים את החרוזים בצינורות חלבון נמוך כריכת מיקרוצנטריפוגה כדי למקסם את הטיפול חרוזים במהלך מניפולציה לדוגמה. הוסף 1 מ ל של מתמיסת מלח 1x פוספט באגירה (PBS) כדי לשטוף חרוזים וצנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות.. ולאכול את הסופרנטאנט
- השהה מחדש את החרוזים עם 500 μL של 8% גלוטארלדהיד כדי להפעיל את NH2 קבוצות ולסובב עבור 4 h בטמפרטורת החדר (RT).
התראה: יש להשתמש בתמיסה הגלוטרלדהיד רק בתוך מכסה כימי. בצע את ההוראות שבגליון הנתונים של בטיחות החומרים (MSDS). - חרוזי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות, להסיר את glutarאלדהיד ולשטוף את החרוזים שלוש פעמים יותר עם 1 מ ל של 1X PBS.
התראה: פתרון הגלוטרלדהיד צריך להיות מושלך כפסולת כימית מסוכנת. - השהה מחדש את החרוזים שהופעלו ב-100 μL של 1x PBS. המדגם יכול להיות מחולק לשני צינורות חלבון מיקרוצנטריפוגה נמוך כריכה: 50 μL עבור BCR-ligand + ו 50 μL עבור BCR-ligand-.
- כדי להכין את הפתרון אנטיגן להשתמש two 2 מ"ל חלבון נמוך כריכה מיקרוצנטריפוגה צינורות המכילים 100 μg/mL של פתרון אנטיגן ב 150 μL של PBS: צינור אחד עם BCR-ligand + אחרים עם BCR-ligand-.
- הוסף 50 μL של הפתרון חרוזים שהופעלו כל צינור המכיל 150 μL של פתרון אנטיגן, מערבולת ולסובב לילה ב 4 ° c.
- הוסף 500 μL של 10 מ"ג/mL BSA כדי לחסום את הנותרים התגובתית NH2 קבוצות על החרוזים ולסובב עבור 1 h ב 4 ° c.
- צנטריפוגה את החרוזים ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ולהסיר את supernatant. שטוף את החרוזים עם הקור הקר 1x עוד 3 פעמים.
- השהה מחדש את החרוזים שהופעלו ב-70 μL של 1x PBS.
- כדי לקבוע את הריכוז הסופי של חרוזי Ag מצופים, יש לדלל נפח קטן של חרוזים ב-PBS (1:200) ולספור באמצעות המעי. לאחר מכן החנות ב-4 ° צ' עד השימוש.
הערה: אין לאחסן חרוזים מצופי Ag במשך יותר מחודש אחד.
- הכנת שמיכות פולי-אל-ליזין
- לפני הפעלת התא B באמצעות חרוזים מצופה Ag, להכין את פולי-L-ליזין מצופה כיסוי (PLL-coverslips). השתמש בצינור 50 mL המכיל 40 mL של 0.01% w/v של פתרון PLL ולטבול את 12 מילימטר בקוטר שמיכות לתוך הפתרון. סובב את הלילה בשעה RT.
- לשטוף את שמיכות עם 1x PBS ולעזוב להתייבש על מכסה צלחת 24 מכוסה בסרט פרפין. המשך בהפעלת תא B.
- B הפעלת תא
- כדי להתחיל ב-B הפעלת תא עם חרוזים, תחילה לדלל את IIA 1.6 B התא כדי 1.5 x 106 תאים/mL במדיום לחץ (RPMI-1640 בתוספת 2 מ"מ L-Alanine-l-גלוטמין + 55 μm ביתא-mercaptoethanol + 1 מ"מ פירובט + 100 U/מ"ל פניצילין + 100 μg/ml סטרפטומיצין) + 5% סרום בלתי מופעל לפני החום של העובר [FBS]).
- לשלב 100 μL (150,000 תאים) של IIA 1.6 B תאים עם חרוזים Ag מצופה ביחס 1:1 בצינורות 0.6 mL. מערבבים בעדינות באמצעות מערבולת וזרע על כיסוי PLL. דגירה של נקודות זמן שונות בחממה תרבות התא (37 ° צ'/5% CO2). נקודות זמן ההפעלה אופייני הן 0, 30, 60 ו 120 דקות. במשך הזמן 0, מניחים את המכסה. לתוך מכסה הצלחת 24 שעות בקרח הוסף את התערובת של תאים Ag מצופה ומודטה עבור 5 דקות על הקרח.
הערה: חשוב לערבב על ידי מערבולת במקום ללטף למעלה ולמטה, כי זה יכול להפחית את מספר החרוזים במדגם, בשל הצטברות שלהם בקצה פלסטיק של הפיפטה. השתמש בחרוזים מצופים ב-BCR-ligand-כפקד שלילי עבור כל שיטת התשובה. מומלץ להפעיל תחילה את זמן הדגירה הארוך ביותר ולאחר מכן את נקודות הזמן הבאות. חשב מרווחי הפעלה עבור דגימות כגון שהן מוכנות לקיבוע בו. - הוסף 100 μL של הקרה 1x PBS לכל שמיכות כדי לעצור את ההפעלה ולהמשיך עם פרוטוקול מimmunofluorescence. ראה נוהל מדור 3.
2. B תא הפעלה על שמיכות אנטיגן מצופה
-
הכנת שמיכות מצופי אנטיגן
- לפני ההפעלה, להכין את הפתרון אנטיגן (1x PBS המכיל 10 μg/mL BCR-ligand + ו 0.5 μg/mL עכבר נגד CD45R/B220).
הערה: שקול להכין את הכיסויים ביום שלפני השיטת הדעת. B220 משפר את B הדבקה בתא, עם זאת, BCR-Ligand + מספיק כדי ליצור את תגובת ההתפשטות. - מקום שמיכות 12 מ"מ על מכסה צלחת 24 היטב מכוסה בסרט פרפין, להוסיף 40 μL של פתרון אנטיגן על כל coverslip ו-מודטה ב 4 ° c לילה. חותם את הצלחת כדי למנוע אידוי של פתרון אנטיגן.
- שטפו את הכיסויים בערוץ 1 x PBS והאוויר יבש.
- לפני ההפעלה, להכין את הפתרון אנטיגן (1x PBS המכיל 10 μg/mL BCR-ligand + ו 0.5 μg/mL עכבר נגד CD45R/B220).
-
B הפעלת תא
- כדי להתחיל את ההפעלה, לדלל IIA 1.6 B תאים כדי 1.5 x 106 תאים/mL באמצעי לחץ + 5% fbs.
- הוסף 100 μL של תאים אל כיסוי מצופה אנטיגן (Ag-coverslip) ולהפעיל עבור נקודות זמן שונות בחממה תא ב 37 ° צ'/5% CO2. נקודות זמן ההפעלה האופייניות הן 0, 30 ו-60 דקות.
הערה: כמו בסעיף 1, מומלץ להתחיל בנקודת זמן ההפעלה הארוכה ביותר כדי לתקן את כל הדגימות בו. - במשך הזמן 0, המקום מכסה את הצלחת 24-היטב המכיל את שמיכות Ag על הקרח ולהוסיף את התאים. מודקון למשך 5 דקות על הקרח.
- בזהירות לחלק את התקשורת על כל Ag-כיסוי ולאחר מכן להוסיף 100 μL של קר 1x PBS להפסיק את ההפעלה. . המשיכי בפרוטוקול האימונולואוורנציה ראה סעיף 3.
3. אימונולואורנציה
הערה: כדי למנוע הצלבה של הנוגדן המשני עם BCR של IIA 1.6 B תאים, לא להשתמש בנוגדנים הראשי הנגזר העכבר.
- הסר את ה-PBS 1x והמשך עם הקיבעון של כל הכיסויים.
הערה: כדי להחליט באיזה קיבוע בינונית להשתמש, בדוק את הנוגדן/דף נתוני הצבע. לדוגמה, עבור תיוג אקטין על ידי phalloidin להשתמש במדיום הקיבעון (מדיום) קיבוע בינוני, ועל מערך התיוג של הסנטרוכמה על ידי קרום הלב בשימוש מתנול קיבוע.- הוסף 50 μL של PBS 1x שיושלם עם 4% בתחתית ו דגירה של 10 דקות ב RT.
זהירות: פורמלדהיד רעיל. אנא קרא את MSDS לפני העבודה עם הכימיקל הזה. הפתרונות ההכבושים צריכים להתבצע רק תחת כיסוי כימי שלובש כפפות ומשקפי בטיחות. יש לסלק את הפתרון ההכדורגלן כפסולת כימית מסוכנת. - לחילופין, להוסיף 50 μL של מתנול קר ו דגירה עבור 20 דקות.
- הוסף 50 μL של PBS 1x שיושלם עם 4% בתחתית ו דגירה של 10 דקות ב RT.
- לרחוץ שלוש פעמים עם 1x PBS.
הערה: כיסוי יכול להיות מאוחסן ב 4 ° c בשלב זה למקסימום שלושה ימים ב-1x PBS. - הסר 1x PBS ולהוסיף 50 μL של חסימת מאגר (2% BSA + 0.3 M גליצין ב 1x PBS) על כל שמיכות. דגירה ב RT עבור 10 דקות.
- מנושף בעדינות ומוסיף 50 μl של מאגר החדירות (PB) (0.2% bsa + 0.05% סאפונין 1x PBS). דגירה ב RT עבור 20 דקות.
- הכן את הנוגדנים או הצבעים ב-PB (שימוש 30 μL לכל coverslip) ו-דגירה ב RT עבור 1 h או לילה ב 4 ° c. לפרטים נוספים , עיין ברשימת החומרים.
- כדי לתייג את מרכז ההתארגנות המיקרוכדורית (MTOC) או סנטרוכמה להשתמש בנוגדנים הבאים: anti-γ-טובולין (1:500), אנטי-Cep55 (1:500), anti-α-טובולין (1:500), נגד כניסות (1:1000).
הערה: עבור centrosome תיוג תאים B ניתן לעגל עם ביטוי מרכזי-GFP ביטויים פלביניים. - עבור תיוג מנגנון Golgi להשתמש anti-Rab6a (1:500).
הערה: ניתן להשתמש גם בנוגדנים או בצבעים אחרים. - עבור תיוג lysosomes, השתמש anti-Lamp1 (1:200).
הערה: anti-H2-DM ו anti-mhc-II גם ניתן להשתמש בתווית תאים לעיבוד אנטיגן15,16. - לתיוג באמצעות השימוש ב-anti-Sec61a (1:500).
- עבור השלד ציטוטין לשקול את הפעולות הבאות: הפלטין אקטין יכול להיות מדמיין על ידי phalloidin מצובעם צבעי פלורסנט.
הערה: התאים הנמצאים בשימוש בעזרת מפעל החיים-GFP/RFP ביטוי פלמיד יכול לשמש גם לתווית actin.
- כדי לתייג את מרכז ההתארגנות המיקרוכדורית (MTOC) או סנטרוכמה להשתמש בנוגדנים הבאים: anti-γ-טובולין (1:500), אנטי-Cep55 (1:500), anti-α-טובולין (1:500), נגד כניסות (1:1000).
- תשטוף את הכיסויים. שלוש פעמים בערוץ ההתרמה
- לדלל את הנוגדן או הצבעים המשני ב-PBS (להשתמש 30 μL לכל coverslip) ו-מודטה 1 h ב RT.
הערה: הימנע מחשיפת הדגימות לאור ישיר כדי לשמר את איכות האות הפלואורסצנטית. - תשטוף את הכיסויים. שלוש פעמים בערוץ ההתרמה
- הסר את פתרון ה-PBS מתוך שוברי כיסוי.
- הוסף 4 μL של הרכבה מגיב לשקופית מיקרוסקופ. הר את הכיסויים לתוך השקופית כאשר הצד התא פונה כלפי מטה. הניחו לשקופיות להתייבש במשך 30 דקות ב-37 ° c או ב-RT בלילה.
הערה: שקול להשתמש בחומרי הרכבה "אנטי-לדעוך" (עיין בטבלת החומרים). - לרכוש תמונות פלואורסצנטית על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד או אפידלנטית עם מטרת טבילה 60x או 100x שמן. עבור כל רכישה לשקול את האור המשודר או שדה בהיר כדי לזהות בקלות תאים B אינטראקציה עם חרוזים.
הערה: לקחת תמונות תלת ממדיות (3D), כיסוי התא כולו באמצעות מחסניות z. אנו ממליצים לקחת 0.5 יקרומטר ערימות עבות, אולם זה תלוי במיקרוסקופ.
4. ניתוח תמונה
הערה: האלגוריתמים הבאים מתוארים עבור תוכנת ImageJ. עם זאת, ניתן לבצע זאת באמצעות תוכנה מקבילה. כמו כן, לשקול כי עבור כל מדידות אינטנסיביות הקרינה אנו משתמשים בצפיפות הפלואורסצנטית משולבת ("RawIntDen" ב-ImageJ), משום שפרמטר זה רואה את הכמות הכוללת של הזריחה בכל פיקסל של התמונה, לוקח את השטח לחשבון.
- ניתוח הפצת האורגלים בתאי B המופעל בחרוזים מצופי Ag
הערה: כדי לכמת את הקיטוב של רכיבי התא ל-IS, אנו מגדירים ערך שרירותי כאמצעי קירבה ל-IS. האינדקס נע בין -1 (אנטי מקוטב) ו-1 (מקוטב מלא, אובייקט על חרוז), כפי שהוצג בעבר על ידי התהודה ואח '.12.- העריכו את אינדקס הקוטביות של מערכת הסנטרוחלק ומערכת גולג'י (איור 1B).
הערה: ניתן להשתמש באלגוריתם זה עבור אורגלים המוגבלת לנקודה אחת.- ראשית להגדיר את אזורי חרוז ותאים כדי לנתח באמצעות בחירת הכלי מעגל כדי להפריד את גבולות של שניהם, ולאחר מכן לשמור אותם כאזורי עניין (ROI). ראו איור 1, איור 2, איור 3ואיור 4.
- קבע את מרכז התא (CC) ואת מרכז החרוזים (BC) על-ידי הפעלת לנתח | מדידה באזורי תא וחרוזים בהתאמה. ערכי X ו-Y שהתקבלו מחלון התוצאות קובעים את קואורדינטות המרכז.
- באופן ידני לקבוע את מרכז הסנטרוחלק או מכשיר Golgi (אורגאל) באמצעות בחירת הכלי נקודה ב imagej ולהפעיל לנתח | . מידה מדידה ערכי X ו-Y שהתקבלו מחלון התוצאות קובעים את נקודות הציון.
- לאחר מכן, צייר זווית מ-CC לארגונית (a) ו-CC to BC (ב) באמצעות בחירת הכלי זווית והפעל את הניתוח | . מידה מדידה ערך הזווית בחלון התוצאות מציג את הזווית (α) בין שני הווקטורים (a ו- b).
- חשב את אינדקס הקוטביות באמצעות הנוסחה הבאה:
- הערכת אינדקס הקוטביות עבור ליסוזומים (איור 1F).
הערה: אנו משתמשים באלגוריתם זה כדי לנתח את קוטביות האורגלים המציגות הפצה מפוזרת יותר, כגון ליזוזומים.- הגדירו את שטחי החרוז והתאים כדי לנתח, באמצעות בחירת הכלי עיגול כדי להפריד את גבולות השניהם, ולשמור אותם כ-ROI. ברגע שאזורי החרוז והתאים מוגדרים, הגדר את ערוץ הזריחה והעבר את התמונה לערימה אחת של z (תמונה | ערימות | Z-Project [סיכום פרוסות]) ולאחר מכן הפעל את הניתוח | מדוד וחלץ את קואורדינטות מרכז המסה (ה-MX ו-MY) מהחלונות בתוצאות.
- החל את אותו אלגוריתם שהוזכר לפני שינוי ארגונית עבור MC. לפיכך, הזווית (α) מוגדרת על ידי CC-MC (a) ו-cc-BC (ב).
- חשב את הקוטביות באמצעות הנוסחה הבאה:
- הערכת ליזוזום גיוס לאזור סינפטית (איור 2b).
הערה: אלגוריתם זה משמש לכמת ארגונית הסמוכה ל-IS.- לאחר קביעת אזורי החרוז והתאים, קבעו את זווית הווקטור בין CC ו-BC ולאחר מכן סובבו את התמונה כדי להשיג זווית של 0 °.
- הגדר את ערוץ הפלורסנט והכה את התמונה לערימת z אחת (תמונה | ערימות | Z-Project [Sum slices]), לחסל את כל הזריחה הנופל מחוץ לאזור התא וחרוזים יחד (להפעיל לערוך | נקה בחוץ ב-imagej).
- בעזרת הכלי מלבן , ציירו מלבן הסמוך לחרוז ומדדו את האזור הסינפנטית (מוסף). מלבן זה הוא רבע מרוחב התא.
- בחר את כל התמונה והפעל את הניתוח | מדידה כדי להשיג את הזריחה השלמה של התא (WCF).
- חשב את אחוז הזריחה הארגונית הסמוכה ל-IS באמצעות הנוסחה הבאה:
- מכמת הגיוס של רכיבים סלולריים לסנטרוחלק.
הערה: אלגוריתם זה, המותאם מ-Obino et al.5, משמש לכמת את העשרת האורגלים באזור הסנטרואין. בקצרה, אנו מחשיבים את אזור הסנטרוכמה כתחום שבו הקרינה הפלואורסצנטית משויכת של הסנטרוחלק נותרת קבועה או מעל 70% בחלקה של הזריחה/רדיוס. הכרחי להגדיר פרמטר זה בתנאי מנוחה מאחר שרדיוס זה עלול להשתנות בעת ההפעלה.- לאחר קביעת שטחי החרוז והתאים, הגדר את הלוקליזציה של הסנטרוחלק באמצעות הבחירה בכלי הנקודה (איור 3b).
- ראשית, לקבוע את האזור המקסימלי סביב הסנטרוכמה כי ניתן לכמת, על ידי ציור 3 μm-רדיוס מעגל סביב הסנטרוכמה.
- השתמש בפרופיל ה -imagej plugin של התוסף, המודד את הקרינה הפלואורסצנטית בעיגולים קונצנטריים ומציג מזימה של זריחה/רדיוס.
- זיהוי הרדיוס המקסימלי שבתוכו נשמר לפחות 70% מעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית.
- חשב את יחס צפיפות הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות הנוסחה הבאה:
=
הערה: יחס הצפיפות הפלואורסצנטית מציין את הריכוז של ארגון מסוים ב-centrosome בהשוואה לתפוצתה בתא כולו.
- העריכו את אינדקס הקוטביות של מערכת הסנטרוחלק ומערכת גולג'י (איור 1B).
- ניתוח הפצת תאים והפצה של אורגלים בתאי B המופעל באמצעות כיסוי Ag
- הערכת התפלגות ארגונית ב-IS (איור 4B).
הערה: אלגוריתם זה מאפשר את הכמת של התפלגות XY של אורגלים והריכוז שלהם במרכז IS. אנו מגדירים יחס של צפיפות הזריחה בין המרכז לבין האזור הסינפטית הכולל. הערכים שהושגו יכולים להשתנות מנגטיב לחיובי, המציינים התפלגות היקפית או הפצה מרכזית של הארגון, בהתאמה.- קבע את הפרוסה שבה התא נמצא בקשר עם המכסה.
הערה: כדי להפריד את גבולות התא ניתן לתייג את קרום הפלזמה או אקטין אשר מועשר בפריפריה של is. - שינוי סוג הפרוסה ל-8 סיביות, לאחר מכן binarize (תהליך | בינארי | הפוך לבינארי) וחבר את הנקודות האחרות הקרובות ביותר תהליך | בינארי | חלוקה לרמות. מפריד את גבולות אזור התא (CA) באמצעות בחירת הכלי מצולע .
הערה: שלב זה שימושי כדי להגביר את הניגודיות של גבולות התא ולהקל על זיהויך. בנוסף, בשלב זה, ניתן להחיל את התוסף לניתוח חלקיקים של imagej כדי לקבוע את ה-CA באופן אוטומטי. עם זאת, תאים אחרים באותו שדה עלולים להפריע לתוצאות. - קח פרמטרים של CA (גובה ורוחב) ומפריד אזור מרכזי מעוגל, המופרד מגבולות הגבול ברבע מערכי הגובה והרוחב, שקול לאזור זה כאזור מרכז התאים (אמנות עכשווית).
- חשב את התפלגות צפיפות הזריחה במרכז ה-IS באמצעות הנוסחה הבאה:
- קבע את הפרוסה שבה התא נמצא בקשר עם המכסה.
- מדידת התפלגות ארגונית במטוסי Z (איור 4C).
הערה: ניתוח זה קובע את ההתפלגות הכללית של הזריחה הארגונית על פני מישורי Z של תאי B המופעל על Ag-כיסוי, מראה את אחוז הזריחה לכל Z שבר.- כדי לכמת את התפלגות הזריחה Z, תחילה לקבוע את המישור של זה שבו התא נמצא במגע עם Ag-כיסוי ולאחר מכן המטוס המתאים לגבול העליון של התא.
- צייר קו על-פני מרכז התא.
- פורסים מחדש את התמונה Z (תמונה | ערימות | Reslice), כדי לקבל תמונת XZ.
- מדוד את הגובה וחלק את תמונת XZ לתוך 10 מלבנים רצופים באותו גובה (שבר Z) מלמטה (ממשק IS) לחלק העליון (בצד העליון של התא) ולכמת את האות הפלואורסצנטית בכל אחד.
- לנרמל את העוצמה הפלואורסצנטית של כל שבר Z על ידי סכום של הזריחה הכוללת של 10 שברים.
- התווה את אחוז העוצמה הפלואורסצנטית לכל חלק Z של התא.
- הערכת התפלגות ארגונית ב-IS (איור 4B).
=
5. בידוד שבריר מועשר מתאי B במנוחה והפעלה
הערה: יש לשמור על כל הפתרונות ב -4 ° c במהלך הניסוי כדי למנוע השפלה בחלבון. פרוטוקול זה הותאם מהעבודה הקודמת17,18.
- הפעל 2 x 107 B תאים עם חרוזי Ag מצופה ב 2 מ ל של מדיום לחץ + 2% חום מופעל fbs (יחס 1:1). שקול תאים B שאינם מופעלים כתאי מנוחה B.
- הוסף ציטוצ'סין D (2 μM) ו nocodazole (0.2 μM) ו-דגירה עבור 1 h ב 37 ° c.
הערה: תרופות אלה משמשות כדי לנתק בעדינות את הסנטורים מתוך הגרעין, על ידי משתמשים בשלד ציטוטין ומיקרוטובוקלס, בהתאמה, כדי למנוע זיהום גרעיני. - לשטוף כל מדגם עם 5 מ ל קר 1x TBS (50 mM טריס-HCl, pH 7.6, 150 mM הנאל) ולאחר מכן עם 1 מ ל של 0.1 x TBS שיושלם עם 8% סוכרוז.
- השהה מחדש את התאים עם 150 μL של מאגר פירוק המאלף (1 מ"מ HEPES, pH 7.2, 0.5% NP-40, 0.5 mM MgCl2, 0.1% ביתא-Mercaptoethanol, 1 מ"מ פנילימתיט פלוולוניל (PMSF) או קוקטייל פרוטאז מעכבי) ו פיפטה עד צמיגות פוחתת, המציינת שליזה התאים מזוהה במדגם. . שים את הדגימה בשפופרת 1.5 מ ל
- צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, כדי להפריד את האורגלים מן הגרעין.
- בזהירות לשחזר את supernatant ומניחים אותו על גבי שפופרת 1.5 mL עם 300 μL של מאגר הדרגתי (GB) (10 מ"מ צינורות pH 7.2, 0.1% טריטון X-100, 0.1% בטא-mercaptoethanol) המכיל 60% סוכרוז.
- צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צ' כדי לרכז את הסנטרוזומים ב 60% שבריר השבר.
- בינתיים, להכין מעבר מתמשך בלתי רציף 2 mL ultracentrifuge צינורות ידי כיסה 450 μl של gb + 70% סוכרוז עם 270 μl של gb + 50% סוכרוז ולאחר מכן 270 μl של gb + 40% סוכרוז.
- לאחר הצנטריפוגה הראשונה (החלק המרוכז מרוכז), מחק את השבר העליון (חלק צפוף פחות) עד שתגיע לממשק ומערבולת את הדגימה הנותרת בשפופרת. לאחר מכן, שכבת-על מעל מעבר הצבע הרצוף שהוכן קודם לכן עם הדגם העשיר של הסנטרוכמה.
הערה: היזהר שלא לשבש את מעבר הצבע, יש לבצע בזהירות את כל נוהלי הליטוף. - צנטריפוגה ב 40,000 x g עבור 1 h ב 4 ° c עם האצה מינימלית עם בלם הצנטריפוגה מוגדר לבטל, כדי למנוע שיבוש הדרגתי.
- לאסוף 12 שברים של 100 μL לתוך צינורות נפרדים החל מלמעלה.
- לזהות את הסנטרוכמה שברים מועשר על ידי כתמי חיסוני באמצעות γ-טובולין כסמן centrosome סוימים.
הערה: אנו מוצאים בדרך כלל תמצית מועשרת בין שברים 6 ו-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המאמר הנוכחי מראה כיצד התאים B יכול להיות מופעל באמצעות אנטיגן קיבוע על חרוזים או coverslips כדי לגרום להיווצרות של IS. אנו מספקים מידע על כיצד לזהות ולכמת את הקיטוב של מארגני שונים על ידי מערכת חיסונית וכיצד לאפיין חלבונים העוברים שינויים דינמיים בהתאגדות שלהם לסנטרוחלק, אשר מקטזים ל-IS, באמצעות גישה ביוכימית.
הדמיה של תאי B על ידי immunofluorescence מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של אורגלים כגון centrosome מכשיר Golgi ו lysosomes, אשר גויסו על הפעלת התא B. אדם יכול להשיג פרמטרים כמותיים כדי למדוד את הקיטוב של האורגלים האלה כדי להשוות אותם בתנאים שונים. כפי שאנו מראים באיור 1A, מכשיר centrosome ו golgi מגוייסו ל-IS על B הפעלת התא. הגיוס לא נצפתה בתאי B מגורה עם BCR-ligand-המציין כי התחייבות BCR נדרש כדי לגייס את מערכת centrosome ו Golgi אל IS (איור 1A). כדי להשיג אינדקס קוטביות עבור כל ארגון, כמדידה של קרבתו ל-IS, שקלנו שלוש תכונות: המרחק בין האורגל למרכז התא, המרחק בין מרכז החרוזים למרכז התא, והזווית בין ה שני וקטורים (איור 1B). אינדקס זה נע בין -1 (אנטי מקוטב) ו-1 (מקוטב לגמרי, אובייקט על החרוז). איור 1C ו -1c הצג גרפים שבהם אינדקסי קוטביות של כל ארגון מותווים לעומת זמן ההפעלה. בהסכמה עם מכשירים אימונוofor, הן מערכת centrosome סוימים, Golgi, להציג יותר מפתחות קוטביות חיובית על נקודות זמן ארוכות יותר של הפעלה, המשקף כיצד הם בהדרגה מגויס ל-IS. אלגוריתם זה חל על ארגון מוגבל לנקודה אחת.
בנוסף, אנו לכמת את הקיטוב של אורגלים המציגים הפצה מפוזרת, כגון lysosomes (איור 1E), על ידי יישום אותו אלגוריתם שהוזכר לפני, אבל שינוי הנקודה על ידי קואורדינטות מרכז מסה של ליסוזומים (איור 1F). אנו יכולים לצפות כי מדדי הקוטביות של ליסובכמה בריכות להגיע לערכים חיוביים יותר על הפעלה, אשר מעיד על כך שהליזומים מתגייסות לעבר הסינפסה על הפעלת תא B (איור 1G).
כמו כן, הגדרתי שני אלגוריתמים לקביעת אורגלים הנמצאים במגע עם ממשק הסינפטיות (חרוז) וכמות האורגלים בסמיכות לסינפסה, אך לא בהכרח במגע. כפי שאנו מראים באיור 2, אנו לכמת ליסוזומים היוצרים קשר עם ממשק סינפטית (איור 2a), על ידי חלוקת אות מנורה 1 באזור חרוז על ידי הזריחה הכוללת בתא בתוספת חרוז (איור 2a). חשוב לשקול שקוטרו של אזור החרוזים קובע את טווחי האחוזים שהושגו. לדוגמה, בקוונפיקציה המוצגת (איור 2b), אנו לצייר עיגול עם קוטר 3 יקרומטר כדי למדוד את הזריחה על חרוז, שהוא פרמטר מגביל בהתחשב גודל חרוז (3 יקרומטר). באמצעות פרמטר זה, התוצאות מראות כי lysosomes בהדרגה מגויס לממשק סינפטית על הפעלת התא B, להגיע 10-15% המסה הכוללת (איור 2C). גישה נוספת המוצגת היא כימות הליזוזומים לאזור הסינפטיות. איור 2D מראה כי lysosomes בהדרגה להצטבר עד 25% הליזוזומים שלהם ב IS. באופן כללי, על-ידי ביצוע שני סוגי האנליזה ניתן להעריך את הקיטוב והעגינה של האורגלים ב-IS.
במהלך הפעלת תא B, שינויים במאגר החלבונים המשויכים ל-centrosome סוימים תועדו5. למשל, אחד החלבונים הללו המשנה את ההתאגדות שלהם ב Centrosome במהלך הפעלת התא B הוא actin. במקרה זה מתרוקן בתוך אזור זה, אשר מאפשר לסנטרוכמה להתנתק מן הגרעין, קידום הקיטוב שלה ל-IS5. כאן אנו מציגים את הקוונפיקציה של אקטין ב centrosome ואיך זה מתרוקן על הפעלת התא B (איור 3). כדי להגדיר את אזור centrosome המשמש לכמת משויך actin, אנו מדדו את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של תווית זו בעיגולים קונצנטריים סביב centrosome. הרדיוס הוגדר בהתבסס על הנקודה שבה לפחות 70% מעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של התווית נשמרת (איור 3B). באמצעות גישה זו ניתן לכמת את הירידה בצפיפות אקטין ב centrosome על הפעלת התא B, כפי שמוצג באיור 3c.
כדי להשיג רזולוציה רבה יותר בהתפלגות של אורגלים בממשק IS, הפעלנו תאים B על אנטיגן מצופה שמיכות, התיוג actin, מנגנון Golgi ו הרשתית העין (איור 4A). ניתן לבצע את חלוקת האורגלים ב-IS באמצעות צלילה באזור הסינפטיות באזור מרכזי והיקפי, החלת קריטריונים המוצגים באיור 4B. זה היה מבוסס על עבודה קודמת מראה כי BCRs לאסוף בתוך האזור המרכזי הזה, אשר ככל הנראה מתאים למכלול ההפעלה המרכזית סופרא מולקולרית ולקולרית (csmac)10,19. איור 4A מראה כי אורגלים שגויסו ל-IS, כגון מערכת golgi והרשתית האנדופלזמית מציגים מול הפצות. ואכן, מדדי ההפצה שלהם מאופדדים בצביעת האימונולואוור, המוצגת באיור 4C. מכשיר Golgi מראה ערך חיובי, כלומר, הוא מרוכז במרכז IS בעוד הרשתית האנדופלזמית מראה ערכים שליליים, כלומר הוא מותאם בעיקר באזור ההיקפי של IS. בנוסף, ניתן לקחת את הערכים של האזור הסינפטית שנקבע קודם לכן, כדי למדוד את שטח התפשטות במהלך הפעלת התא B, כפי שהוא מוצג באיורים 4D ו- 4d. תוצאות אלה מציגות גידול בשטח המריחה על הפעלת תא B, כפי שמתואר בעבר10,20.
כמו בקביעת החרוז, אנחנו יכולים לקבוע את התפלגות של אורגלים לקראת הסינפסה על ידי לקיחת תמונות XZ של תאים B המופעל על הכיסויים אנטיגן מצופה ומדידת הזריחה ארגונית על פני מימד Z (איור 4F). עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של אקטין במישור Z נמדד, כפי שהוא מיוצג במישור xz באיור 4f, שם העשרה פרוגרסיבי של אקטין בממשק סינפטיות (שברים 1 ו 2) ניתן לצפות (איור 4f).
בנוסף לניתוח הדמיה של תא B, בנינו את הבידוד של שברים מועשרים במספר מבני המאה הקשורים לחלבונים (איור 5A). גישה זו יכולה להיות חשובה כדי להשלים את המחקר של היווצרות היא בתאי B, בהינתן כי centrosome סוימים מקטזים לקרום סינפטית והוכח לתאם את הסחר ליזוזום המעורבים בחילוץ אנטיגן ומצגת21. שיטה זו תוארה בעבר באמצעות כמויות גדולות של תאים (1 x 109 תאים)17,18 אבל יש לנו סטנדרטית גירסה פשוטה, אשר משתמשת כמות מופחתת של תאים ניתן לבצע באמצעות נפח נמוך ultracentrifuge-צינורות (2-3 mL). כפי שאנו מראים באיור 5B, ניתחנו שברים סלולריים שונים על ידי החיסונית וקבע אילו אלה מתאימים centrosome שברים עשירים, על ידי גמא טובולין צביעת. כאן אנו מציגים דוגמה לחלבונים העוברים שינויים בהצטברות שלהם בסנטרוחלק, כגון Actin ו Arp2, אשר דווחו בעבר5.
איור 1 : קיטוב של אורגלים לקראת IS. (א) immunofluorescence כתמים של מנגנון Golgi (Rab6a) ו microtubules (α-טובולין) ב iia 1.6 B תאים מודבטים עם bcr-ligand + (0, 30, 60 ו 120 דקות) או bcr-ligand-חרוזים (120 דקות). ראשי חץ מצביעים. על הסנטרוראים BF = שדה בהיר. סרגל בקנה מידה = 3 μm. (ב) הערכה המתארת כיצד לחשב את מדד הקוטביות של האורגלים (מערכת הסנטרופחלק או הגולגי) לכיוון IS. a = מרחק בין מרכז התא (CC) לאורגונל. b = מרחק מ-CC ולמרכז החרוזים (BC). (ג, ד) מגרשים מייצגים מציג אינדקסים קוטביות של אורגלים בנקודות זמן שונות של הפעלה. כל נקודה מייצגת תא אחד. (ה) immunofluorescence כתמים של ליסזומים (Lamp1) ב תאים B מודבטים עם bcr-ligand + (0, 30, 60 ו 120 דקות) או bcr-ligand-חרוזים (120 דקות). BF = שדה בהיר. סרגל קנה מידה = 3 μm. (F) המייצג את האופן שבו ניתן לחשב את אינדקס הקוטביות של ליסוזומים. a = מרחק בין CC למרכז המסה (MC). b = מרחק מ-CC ל-BC. G מגרשים מייצגים מציג אינדקסים קוטביות של ליסוזומים בנקודות זמן שונות של הפעלה. כל נקודה מייצגת תא אחד. 2-way ANOVA עם שלאחר הבדיקה של Sidak בוצעה. האמצעים עם SEM מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : צבירה של ליזוזומים ב-IS. (א) אימונוLamp1 כתמים של ליסזומים () ב B תאים מודבטים עם bcr-ligand + (0, 30, 60 ו 120 דקות) או bcr-ligand-חרוזים (120 דקות). BF = שדה בהיר. סרגל בקנה מידה = 3 μm. (ב) הערכה המתארת כיצד לחשב את הצטברות של אורגלים כגון ליסוזומים על החרוז והאזור הסינפטית. הקרינה הפלואורסצנטית של התא כולו (WCF), (BF) ובאזור הסינפטיות (מוסף) מצוינים. (ג, ד) תרשימי עמודות מייצגים להצטברות ליזוזומים באזור החרוז ובאיזור הסינפטית. N = 1. 20 > תאים. 2-way ANOVA עם שלאחר הבדיקה של Sidak בוצעה. האמצעים עם SEM מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : בדיקת קוונפיקציה של אקטין בסנטרוכמה במהלך היווצרות. (א) immunofluorescence כתמים של אקטין (phalloidin) ו microtubules (α-טובולין) ב תאים B מודבטים עם bcr-ligand + (0 ו 60 דקות) או bcr-ligand-חרוזים (0 ו 60 דקות). ראשי חץ מציינים את הסנטרוחלק. סרגל קנה מידה = 3 μm. (ב) ערכה המתאר כיצד לחשב את הגיוס או דלדול של רכיבים משויכים של Centrosome. אזור centrosome מחושב באמצעות רדיוס (X μm) השומרים על לפחות 70% מהזריחה המקסימלית. (ג) מגרשים מסוג מייצגים המציגים את אקטין ב-centrosome תחת הפעלת (bcr-ligand +) ובתנאי אי-הפעלה (bcr-ligand-). N = 1. 15 > תאים. 2-way ANOVA עם שלאחר הבדיקה של Sidak בוצעה. האמצעים עם SEM מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : הפצת רכיבים סלולאריים בממשק הסינפטית. (א) אימונוofor, כתמים של אקטין (Phalloidin), רשתית העין (Sec61a), מערכת Golgi (העברה עם KDELR-DN-Gfp שלילי דומיננטי של קולטן kdel, אשר לוקליזציה ב-golgi). B תאים הופרה על כיסוי מצופה עם BCR-ligand + עבור 60 min. BF = שדה בהיר. סרגל בקנה מידה = 5 μm. (ב) הערכה המתארת כיצד לקבוע את שטח המריחה של התא ואת הגיוס של האורגלים במרכז IS. בערכה, רשות האישורים מציינת את אזור התא המופרד באמצעות הקליפת הבטן אקטין ו-אמנות עכשווית מציין את אזור התא של המרכז. (ג) מערכת גולג'י והתפלגות הרשתית ברשת is, המיוצגת על-ידי גרף עמודות, כאשר ערך > 0 מציין העשרה במרכז is ו-< 0 מציין התפלגות היקפית. N = 1. 20 > תאים. האמצעים עם SEM מוצגים. (ד) דמויות מייצגות של תאים B מתויג אקטין (phalloidin) מופעל על Ag-מצופה שמיכות בנקודות זמן שונות (0, 30 ו 60 דקות), מציג את xz ו-XY. (E) גרף המציג את אזור המריחה של תאי B בערכת E. (F) המתאר כיצד לקבוע את התפלגות האות של עניין במישור z, ואת החלקה לחלק z. המלבן מציין את הממשק IS. (G) התפלגות אקטין על פני מישור Z מיוצג על ידי מגרש קו של אחוז התפלגות פלואורסצנטית לעומת כל שבר Z. המלבן מייצג את הממשק IS. N = 1. 25 > תאים. האמצעים עם SEM מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : Centrosome שברים מועשר של תאים B. (א) זרימת עבודה של כיצד להשיג שברים מועשרים באמצעות מעבר-הצבע של סוכרוז. (ב) החיסוני של שברים שהתקבלו מתוך מנוחה והופעל תאים B (60 דקות). שברים מסוג centrosome-עשירים מזוהים על-ידי תיוג עם γ-טובולין ומצוינים בתוך המלבן המקווקו (שבר 6 עד 8). מסנטרוכמה חלבונים משויכים (Actin ו-Arp2) מוצגים בחלקים עשירים של centrosome בתנאי הפעלה ומנוחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים שיטה מקיפה ללמוד כיצד B לימפוציטים לארגן מחדש את הארכיטקטורה תאיים שלהם כדי לקדם את היווצרות של IS. מחקר זה כולל את השימוש בטכניקות הדמיה כדי לכמת את התפלגות תאיים של אורגלים, כגון centrosome מכשירים Golgi ו-lysosomes במהלך הפעלת התא B, וכיצד הם הקיטוב כדי IS. בנוסף, אנו מתארים גישה ביוכימית ללימוד שינויים בקומפוזיציה המרכזית על גבי הפעלת תא B.
כדי לקדם את היווצרות הוא ב-B תאים, השתמשנו אנטיגנים בלתי מקובלים (מצופה אנטיגן חרוזים) במקום מסיסים החיסונית-תסביכים כי לשעבר מפעילה את הקמתה של אתר קשר בנפרד שבו הסדרים בשלד התאים ואורגנל ניתן ללמוד בקלות בקיטוב. היבט קריטי של הפעלת הדמיה ב-cell הוא הכנת הדגימות. כל רכישות התמונה צריך לקבל באופן אידיאלי תא 1:1: יחס חרוז, כדי לכמת את הקיטוב של אורגלים לאתר ייחודי של מגע אנטיגן. עם זאת, במקרים מסוימים B תאים יכולים ללכוד שני חרוזים או יותר, ובכך קשה לבחור אתר אחד של מפגש אנטיגן. כדי למנוע היווצרות של אגרגטים חרוז, חשוב מערבולת אנטיגן מעלה חרוזים ביסודיות לפני הוספתם לתאים. בנוסף, עבור ניסויים אימונולואואורוסנס, אנו ממליצים להוציא מתאי כימות ללכוד יותר חרוז אחד, כדי למנוע פרשנויות במהלך ניתוח תמונה. צעד קריטי נוסף בהכנת דגימות הוא מצב הקיבעון/החדירות. למשל, אנו ממליצים לתקן את התאים עם מתנול כדי לייעל מיקרוכדורית ו-4% בכיוון הכפר עבור phalloidin כתמים. כאשר בו במקביל לתיוג אקטין שלד ומmicrotubules, חלופה יכולה להיות תווית הבריכה אקטין על ידי העברה של תאים עם מפעל החיים-gfp/rfp ביטוי פלבאמצע בשילוב עם כתמים מיקרוטובית. רכישת תמונה בשימוש כדי לכמת את הקיטוב של Centrosome ומאורגונים תאיים אחרים ניתן לבצע עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית. עם זאת, כדי לקבל כימות מדויקות במטוסי z שונים, למשל באופן התפשטות המריחה, נדרש מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
לגבי פרוטוקול הבידוד המתואר כאן, צעד קריטי הוא קבלת כמות מתאימה של דגימות כדי להיות מסוגל לכמת חלבונים על ידי כתמי חיסוני. בהינתן כי בתאי B יש גרעין גדול הציטופלסמה שלהם הוא פחות מ 30% של נפח התאים הכולל שלהם, קבלת תשואות גבוהות יותר של חלבונים cytoplasmic יכול להיות מאתגר. מסיבה זו, אנו ממליצים להשתמש כ 20 x 106 B תאים עבור כל נקודת זמן ההפעלה עבור בידוד centrosome.
מגבלה משמעותית של שיטות אלה היא כי הפעלה עם חרוזים אנטיגן מצומת אינו כולל את המורכבות של הסביבה שבה אנטיגנים משטח קשור מוצגים לתאי B ב vivo. ניתן לטפל במגבלה זו על-ידי הגדלת התרבות או החרוזים עם גורמים אחרים לגירוי משני, כגון ציטוקינים ורכיבים של מטריצת החילוץ. עם זאת, חיוני להשתמש בפקדים המתאימים במקרים אלה כדי לפרש נכון את התוצאות.
משמעות השיטות המוצגות בעבודה זו מתבססת על הגישה המשולבת המשמשת ללימוד התא B סינפסה: (1) הקיטוב של האורגלים והפצתו (2) השינויים בקומפוזיציה החלבון בסנטרוחלק. בשל המספר הגדול של תאים הנדרשים לבצע ניתוח מיותר וכמות גדולה של נתונים שנוצרו בתהליך זה, האלגוריתמים השונים המוצגים בעבודה זו מקלים על ניתוח הדמיה של תאים. יתר על כן, האלגוריתמים המשמשים לקיטוב התא קלים לאוטומציה על-ידי פונקציות של פקודות מאקרו ב-ImageJ, שהוא כלי שימושי להפחתת משימות חוזרות ולחיסכון בזמן.
אלה הליכים ניסיוניים ניתן לפרט סוגים אחרים של תאים היוצרים פנוטיפים מקוטב על מנת להשיג פונקציה תאית מסוימת. בנוסף, ניתן למטב את הפרוטוקולים על-ידי כלילת היתר, למשל, את הפעילות של החלבונים המשויכים כגון הקיסים או הפרוטסים בחלקים מועשרים בסנטרוחלק. בסך הכל, מחקרים אלה יכולים לספק תובנה מכניסטית לתוך איתות תא ומסלולים מולקולריים המסדירים את הקמת קוטביות התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
M.-I.Y. נתמך על ידי מענק מחקר מ FONDECYT1180900. J.I., D.F ו J.L. היו נתמכים על ידי מלגות מתוך האינטרנציונל הלאומי. אנו מודים לדוד אוסוריו מאוניברסיצ קאנוקיה דה צ'ילה להקלטת וידאו ולעריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
