Summary
Heri beskriver vi to tilnærminger for å karakterisere celle polarisering hendelser i B-lymfocytter under dannelsen av en IS. Den første, innebærer kvantifisering av organelle rekruttering og cytoskeleton rearrangements på Synaptic membranen. Den andre er en biokjemiske tilnærming, for å karakterisere endringer i sammensetningen av centrosome, som gjennomgår polarisering til immun synapse.
Abstract
Anerkjennelse av overflate-bundet antigener av B-cellen reseptor (BCR) utløser dannelsen av en immun synapse (IS), der både signalering og antigen opptak koordineres. IS formasjon innebærer dynamisk utgangen remodeling ledsaget av polarisert rekruttering til Synaptic membranen av centrosome og tilhørende intracellulære organeller som lysosomer og Golgi apparatet. Innledende stadier av utgangen remodeling tillate B-celler for å øke sin celle overflate og maksimere mengden av antigen-BCR komplekser samlet på synapse. Under visse forhold, når B-celler gjenkjenne antigener knyttet til stive overflater, er denne prosessen koblet til den lokale rekruttering og sekresjon av lysosomer, som kan forenkle antigen utvinning. Uptaken antigener er internalisert i spesialiserte Endo-lysosome rom for prosessering til peptider, som er lastet inn i store histocompatibility komplekse II (MHC-II) molekyler for videre presentasjon til T hjelper celler. Derfor studerer organelle dynamikk knyttet til dannelsen av en IS er avgjørende for å forstå hvordan B-celler er aktivert. I denne artikkelen vil vi diskutere både tenkelig og en biokjemiske teknikk som brukes til å studere endringer i intracellulære organelle posisjonering og cytoskeleton rearrangements som er forbundet med dannelsen av en IS i B-celler.
Introduction
B-lymfocytter er en viktig del av det adaptive immunsystemet som er ansvarlig for å produsere antistoffer mot ulike trusler og invaderende patogener. Effektiviteten av antistoff produksjon bestemmes av evnen til B-celler til å tilegne seg, behandle og presentere antigener oppstått enten i en løselig eller overflate-bundet form1,2. Anerkjennelse av antigener knyttet til overflaten av en presentasjon celle, av BCR, fører til dannelsen av en nær intercellulære kontakt betegnes er3,4. Innenfor denne dynamiske plattformen både BCR-avhengige nedstrøms signalering og internalisering av antigener i Endo-lysosome rom finner sted. Uptaken antigener er behandlet og montert på MHC-II molekyler og deretter presentert for T-lymfocytter. Produktive B-T interaksjoner, kalt B-T celle samarbeid, tillater B-lymfocytter å motta de riktige signalene, som fremmer deres differensiering i antistoff-produserende plasma celler eller minne celler8.
To mekanismer har vært involvert i antigen ekstraksjon av B-celler. Den første er avhengig av utskillelsen av proteaser stammer fra lysosomer som gjennomgår rekruttering og fusjon i Synaptic kløft5,6. Den andre, avhenger av myosin IIA-mediert trekke krefter som utløser invagination av antigen som inneholder membraner som er internalisert i clathrin-belagte groper7. Modus av antigen utvinning er avhengig av de fysiske egenskapene til membranen der antigener er funnet. Likevel, i begge tilfeller, B-celler gjennomgår to store remodeling hendelser: utgangen cytoskeleton omorganisering og polarisering av organeller til IS. Utgangen cytoskeleton remodeling innebærer en innledende spredning Stadium, der utgangen-avhengige utstikkende på Synaptic membranen øke overflaten i kontakt med antigen. Dette etterfølges av en sammentrekning fase, der bindende regler kombinert med antigener er konsentrert i sentrum av den er av samordnet handling av molekylær Motors og utgangen cytoskeleton remodeling8,9,10, 11. polarisering av organeller også avhengig av ombygging av utgangen cytoskeleton. For eksempel blir centrosome lokomotivet fra kjernen, av lokale depolymerisering av tilknyttede utgangen, som tillater omplassering av denne organelle til er5,12. I B-celler, omplassering av centrosome til en celle Pol (IS) guider lysosome rekruttering til Synaptic membranen, som ved sekresjon kan lette utvinning og/eller behandling av overflate-bundet antigener6. Lysosomer rekruttert på IS er beriket med MHC-II, som favoriserer dannelsen av peptid-MHC-II komplekser i endosomal rom for å bli presentert for T-cellene13. I tillegg har Golgi apparatet også blitt observert å være tett rekruttert til IS14, noe som tyder på at Golgi-avledet blemmer fra sekretoriske vei kan være involvert i antigen utvinning og/eller prosessering.
Alt i alt, intracellulære organelle og cytoskeleton rearrangements i B-celler under synapse formasjon er de viktigste trinnene som tillater effektiv antigen oppkjøp og behandling som kreves for deres videre aktivering. I dette arbeidet introduserer vi detaljerte protokoller om hvordan du utfører bildebehandling og biokjemiske analyser i B-celler for å studere intracellulære remodeling av organeller knyttet til dannelsen av en IS. Disse teknikkene inkluderer: (i) Immunofluorescence og bildeanalyse av B-celler aktivert med antigen-belagte perler og på antigen-belagt coverslips, som tillater visualisering og kvantifisering av intracellulære komponenter som er mobilisert til IS og (II ) isolering av centrosome-beriket fraksjoner i B-celler ved ultracentrifugation på sukrose graderinger, som gjør identifisering av proteiner knyttet til centrosome, potensielt involvert i regulering celle polaritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: følgende trinn ble utført med IIA 1,6 B-celler.
1. B celle aktivering med antigen-belagte perler
- Utarbeidelse av antigen-belagte perler
- For å aktivere B-celler, bruk NH2-perler covalently belagt med antigen (AG-belagt perler), som er utarbeidet ved hjelp 50 μL (~ 20 x 106 perler) av 3 μm NH2-perler med aktivering (BCR-ligand +) eller ikke-aktivering (BCR-ligand-) antigener.
- For IIA 1.6 B-celler bruker anti-IgG-F (AB ')2 fragment som BCR-ligand + og anti-IgM-F (AB ')2 eller STORFE serum albumin (BSA) som BCR-ligand-. For å aktivere primær B-celler eller IgM+ B Cell line bruke anti-IgM-F (AB ')2 som BCR-ligand + og BSA som BCR-ligand-.
Merk: for å unngå binding av ligander til FC-reseptoren, bruk F (AB ') eller F (AB ')2 antistoffer fragmenter i stedet for full-lengde antistoffer. - For å fortsette med utarbeidelse av AG-belagte perler, plassere perlene i lav proteinbinding mikrosentrifugen rør for å maksimere perlene utvinning under prøven manipulasjon. Tilsett 1 mL 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) for å vaske perler og sentrifuge ved 16 000 x g i 5 min. aspirer supernatanten.
- Resuspend perlene med 500 μL av 8% glutaraldehyde for å aktivere NH2 grupper og roter til 4 timer ved romtemperatur (RT).
FORSIKTIG: den glutaraldehyde lager løsningen bør bare brukes i en kjemisk avtrekks hette. Følg instruksjonene på databladet for materialsikkerhet (muskel-og skjelettlidelser). - Sentrifuger perler på 16 000 x g i 5 min, Fjern glutaraldehyde og vask perlene tre ganger med 1 ml 1x PBS.
FORSIKTIG: den glutaraldehyde oppløsningen skal kastes som farlig kjemisk avfall. - Resuspend av aktiverte perler i 100 μL av 1x PBS. Prøven kan deles inn i to lav proteinbinding mikrosentrifugen Tubes: 50 μL for BCR-ligand + og 50 μL for BCR-ligand-.
- For å forberede antigen løsningen bruke to 2 mL lav proteinbinding mikrosentrifugen rør som inneholder 100 mikrogram/mL av antigen oppløsning i 150 μL av PBS: ett rør med BCR-ligand + og andre med BCR-ligand-.
- Tilsett 50 μL av aktiverte perler løsning på hvert rør som inneholder 150 μL av antigen løsning, Vortex og roter over natten ved 4 ° c.
- Tilsett 500 μL av 10 mg/mL BSA for å blokkere de gjenværende reaktive NH2 gruppene på perlene og roter i 1 time ved 4 ° c.
- Sentrifuger perlene ved 16 000 x g i 5 min ved 4 ° c og fjern supernatanten. Vask perlene med kald 1x PBS tre ganger til.
- Resuspend av aktiverte perler i 70 μL av 1x PBS.
- For å bestemme den endelige konsentrasjonen av AG-belagte perler, fortynne et lite volum av perler i PBS (1:200) og telle ved hjelp av en hemocytometer. Deretter oppbevares ved 4 ° c til bruk.
Merk: AG-belagte perler bør ikke oppbevares i mer enn 1 måned.
- Utarbeidelse av Poly-L-lysin coverslips
- Før B Cell aktivisering analysen med AG-belagte perler, forberede Poly-L-lysin-belagt coverslips (PLL-coverslips). Bruk et 50 mL rør som inneholder 40 mL 0,01% w/v av PLL-oppløsning og senk coverslips i 12 mm diameter inn i oppløsningen. Roter over natten på RT.
- Vask coverslips med 1x PBS og la det tørke på et 24-brønn plate lokk som er dekket med para fin film. Fortsett med aktivering av B-celle.
- B celle aktivering
- For å starte B celle aktivering med perler, fortynne du først IIA 1,6 B cellelinje til 1,5 x 106 celler/ml i Klikk medium (RPMI-1640 supplert med 2 mm L-alanin-L-glutamin + 55 μM beta-mercaptoethanol + 1 mm pyruvat + 100 U/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin) + 5% varme-deaktivert fosterets storfe serum [FBS]).
- Kombiner 100 μL (150 000 celler) av IIA 1,6 B-celler med AG-belagte perler ved 1:1-forhold i 0,6 mL rør. Bland forsiktig ved hjelp av en Vortex og frø på PLL-coverslips. Ruge for ulike tids punkter i en cellekultur inkubator (37 ° c/5% CO2). Den typiske aktiveringstiden poeng er 0, 30, 60 og 120 min. For tid 0, plasserer du PLL-coverslips i 24-brønn plate lokket på isen. Tilsett Cells-AG-belagt perle blanding og ruge i 5 minutter på isen.
Merk: det er viktig å blande med Vortex i stedet for pipettering opp og ned, fordi dette kan redusere antall perler i prøven, på grunn av akkumulering i plast spissen av pipette. Bruk perler belagt med BCR-ligand-som en negativ kontroll for hver analyse. Vi anbefaler at du aktiverer den lengste inkubasjonstiden først, og deretter følgende tidspunkter. Beregn intervaller for aktivering for prøver slik at de er klare for fiksering på samme tid. - Legg 100 μL av kald 1x PBS til hver dekkglass for å stoppe aktiveringen og fortsette med immunofluorescence-protokollen. Se protokoll seksjon 3.
2. B celle aktivering på antigen-belagt coverslips
-
Fremstilling av antigen-belagt coverslips
- Før aktivering klargjør du antigen-løsningen (1x PBS som inneholder 10 μg/mL BCR-ligand + og 0,5 μg/mL rotte anti-mus CD45R/B220).
Merk: Vurder å forberede coverslips dagen før analysen. B220 forbedrer B celle vedheft, men BCR-ligand + er tilstrekkelig til å generere spre respons. - Plasser 12 mm-dekkglass på et 24-brønn plate lokk som er dekket med para fin film, tilsett 40 μL av antigen-oppløsning på hver dekkglass og ruge ved 4 ° c over natten. Forsegle platen for å unngå fordamping av antigen løsning.
- Vask coverslips med 1x PBS og lufttørke.
- Før aktivering klargjør du antigen-løsningen (1x PBS som inneholder 10 μg/mL BCR-ligand + og 0,5 μg/mL rotte anti-mus CD45R/B220).
-
B celle aktivering
- For å starte aktiveringen, fortynne IIA 1.6 B celler til 1,5 x 106 celler/ml i Click medium + 5% FBS.
- Tilsett 100 μL av celler på en antigen-belagt dekkglass (AG-dekkglass) og aktivere for ulike tidspunkt i en celle inkubator ved 37 ° c/5% CO2. Den typiske aktiveringstiden poeng er 0, 30 og 60 min.
Merk: som i del 1 anbefaler vi at du starter med det lengste aktiveringstidspunktet for å fikse alle prøvene samtidig. - For tid 0, plasserer 24-brønn plate lokket inneholder AG-dekkglass på is og tilsett cellene. Ruge i 5 minutter på isen.
- Nøye aspirer mediene på hver AG-dekkglass og deretter legge til 100 μL av kald 1x PBS å stoppe aktiveringen. Fortsett med immunofluorescence-protokollen. Se avsnitt 3.
3. Immunofluorescence
Merk: for å unngå kryss-reaktivitet av sekundær antistoff med BCR i IIA 1,6 B-celler, ikke bruk mus-avledet primære antistoffer.
- Fjern 1x PBS og fortsett med fiksering av hver dekkglass.
Merk: for å bestemme hvilket feste medium som skal brukes, må du kontrollere databladet for antistoff/fargestoff. For eksempel, for utgangen merking av phalloidin bruke paraformaldehyde (PFA) fiksering medium, og for centrosome merking av pericentrin bruke metanol fiksering.- Tilsett 50 μL av 1x PBS supplert med 4% PFA og ruge i 10 min ved RT.
FORSIKTIG: formaldehyd er giftig. Vennligst les muskel-og skjelettlidelser før du arbeider med dette kjemikalie. PFA løsninger skal kun gjøres under en kjemisk avtrekks hette iført hansker og vernebriller. PFA skal kasseres som farlig kjemisk avfall. - Alternativt kan du legge til 50 μL av kald metanol og ruge i 20 minutter.
- Tilsett 50 μL av 1x PBS supplert med 4% PFA og ruge i 10 min ved RT.
- Vask tre ganger med 1x PBS.
Merk: Coverslips kan oppbevares ved 4 ° c på dette punktet i maksimalt tre dager i 1x PBS. - Fjern 1x PBS og tilsett 50 μL av blokkerings buffer (2% BSA + 0,3 M Glycine i 1x PBS) på hver dekkglass. Ruge for RT for 10 min.
- Aspirer forsiktig og tilsett 50 μL av permeabilization buffer (PB) (0,2% BSA + 0,05% saponin i 1x PBS). Ruge for RT for 20 min.
- Klargjør antistoffer eller fargestoffer i PB (bruk 30 μL per dekkglass) og ruge ved RT for 1 time eller over natten ved 4 ° c. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon.
- Hvis du vil merke mikrotubulinettverket Organiserings Senter (MTOC) eller centrosome bruke følgende antistoffer: anti-γ-Tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-Tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
Merk: for centrosome merking B-celler kan være transfekterte med en centrin-GFP uttrykk plasmider. - For merking Golgi apparatet bruke anti-Rab6a (1:500).
Merk: andre antistoffer eller fargestoffer kan også brukes. - For merking lysosomer, bruk anti-Lamp1 (1:200).
Merk: anti-H2-DM og anti-MHC-II også kan brukes til å merke antigen prosessering rom15,16. - For merking endoplasmatiske retikulum bruke anti-Sec61a (1:500).
- For utgangen cytoskeleton vurdere følgende: polymerisert utgangen kan bli visualisere av Phalloidin bøyd til fluorescerende fargestoffer.
Merk: B-celler transfekterte med et LifeAct-GFP/RFP-uttrykk plasmider kan også brukes til å merke utgangen.
- Hvis du vil merke mikrotubulinettverket Organiserings Senter (MTOC) eller centrosome bruke følgende antistoffer: anti-γ-Tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-Tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
- Vask coverslips tre ganger med PBS.
- Fortynne sekundær antistoff eller fargestoffer i PBS (bruk 30 μL per dekkglass) og ruge 1 h ved RT.
Merk: unngå å utsette prøvene for direkte lys for å bevare kvaliteten på det fluorescens signalet. - Vask coverslips tre ganger med PBS.
- Fjern PBS-løsningen fra coverslips.
- Tilsett 4 μL monterings reagens på et objektglass. Monter dekkglass på lysbildet med celle siden vendt ned. La lysbildene tørke i 30 minutter ved 37 ° c eller ved RT over natten.
Merk: Vurder å bruke en "anti-fade" monterings reagens (se tabell over materialer). - Skaff deg fluorescens bilder på et konfokalmikroskopi eller epifluorescence mikroskop med en 60x eller 100, olje nedsenking mål. For hver oppkjøpet vurdere overført lys eller lyse felt for enkelt å identifisere B-celler i samspill med perler.
Merk: ta tredimensjonale (3D) bilder, som dekker hele cellen ved hjelp av z-stabler. Vi anbefaler at du tar 0,5 μm tykke stabler, men dette avhenger av mikroskopet.
4. bildeanalyse
Merk: følgende algoritmer er beskrevet for ImageJ programvare. Dette kan imidlertid utføres ved hjelp av en tilsvarende programvare. Tenk også på at for alle fluorescens intensitet målinger bruker vi den integrerte fluorescens tetthet ("RawIntDen" i ImageJ), fordi denne parameteren vurderer den totale mengden av fluorescens i hver piksel i bildet, tar området i betraktning.
- Analyse av fordelingen av organeller i B-celler aktivert med AG-belagte perler
Merk: for å kvantifisere polarisering av celle komponenter til IS, definerer vi en vilkårlig verdi som et mål på nærhet til IS. Indeksen varierer mellom-1 (anti-polarisert) og 1 (fullt polarisert, objekt på perlen), som tidligere ble presentert av Reversat et al.12.- Beregn polariteten til centrosome og Golgi-apparatet (figur 1B).
Merk: denne algoritmen kan brukes for organeller som er begrenset til ett punkt.- Definer først perle-og celleområdene som skal analyseres ved hjelp av sirkel verktøy valget for å avgrense grensene for begge, og lagre dem deretter som områder av interesse (ROI). Se figur 1, figur 2, Figur 3og Figur 4.
- Bestem celle senteret (CC) og perle senteret (BC) ved å kjøre analysere | Mål på henholdsvis celle-og perle områder. X-og Y-verdiene som hentes fra resultat vinduet, bestemmer senter koordinatene.
- Bestem manuelt midten av centrosome eller Golgi apparater (organelle) ved hjelp av punkt verktøyet utvalg i ImageJ og kjøre analysere | Mål. X-og Y-verdiene som hentes fra resultat vinduet, bestemmer koordinatene.
- Deretter tegner du en vinkel fra CC til organelle (a) og CC til BC (b) ved hjelp av vinkel verktøyet utvalg og kjøre analysere | Mål. Vinkel verdien i resultat vinduet viser vinkelen (α) mellom begge vektorer (a og b).
- Beregn polariteten indeksen ved hjelp av følgende formel:
- Beregn polaritet indeksen for lysosomer (figur 1F).
Merk: vi bruker denne algoritmen til å analysere polariteten til organeller som viser en mer spredt distribusjon, for eksempel lysosomer.- Definer perle-og celleområdene som skal analyseres, ved hjelp av valg av sirkel verktøy for å avgrense grensene for begge, og lagre dem som ROI. Når perle og celleområder har blitt determind, angi fluorescens kanal og prosjektet bildet til en z-stack (bilde | Stabler | Z-Project [Summer sektorer]), og kjør deretter analyser | Mål og ekstra det masse Senter (MC) koordinater (MX og meg) fra det resultater Vinduer.
- Bruk den samme algoritmen som er nevnt før du endrer organelle for MC. Således er vinkelen (α) definert av cc-MC (a) og CC-BC (b).
- Beregn polariteten ved hjelp av følgende formel:
- Beregn lysosome rekruttering til Synaptic området (figur 2b).
Merk: denne algoritmen brukes til å kvantifisere en organelle ved siden av IS.- Når perle og celleområder har blitt bestemt, bestemme vinkelen på vektoren mellom CC og BC, og deretter rotere bildet for å oppnå en 0 ° vinkel.
- Still inn fluorescerende kanal og projisere bildet i en z-stabel (bilde | Stabler | Z-Project [sum sektorer]), eliminere alle fluorescens som faller utenfor cellen og perle området sammen (Kjør Edit | klar utenfor i ImageJ).
- Bruke rektangel verktøyet utvalg, tegne et rektangel ved siden av perlen og måle Synaptic området fluorescens (SAF). Dette rektangelet er en fjerdedel av cellebredden.
- Velg hele bildet og Kjør analyser | Mål for å hente hele celle fluorescens (WCF).
- Beregn den organelle fluorescens prosenten ved siden av IS ved å bruke følgende formel:
- Kvantifisere rekruttering av cellulære komponenter til centrosome.
Merk: denne algoritmen, tilpasset fra Obino et al.5, brukes til å kvantifisere den berikelse av organeller på centrosome området. Kort, anser vi det centrosome området som domenet der centrosome-assosiert organelle fluorescens forblir konstant eller over 70% i fluorescens/radius tomten. Det er viktig å angi denne parameteren under hvile forhold fordi denne radiusen kan endres ved aktivering.- Når perle-og celleområder er fastslått, definerer du lokaliseringen av centrosome ved hjelp av markerings verktøyet (figur 3b).
- Først bestemme det maksimale området rundt centrosome som er mulig å kvantifisere, ved å tegne en 3 μm-radius sirkel rundt centrosome.
- Bruk ImageJ plugin radial profil, som måler fluorescens i konsentriske sirkler og viser en fluorescens/radius tomten.
- Identifiser maksimal RADIUS innenfor hvor minst 70% av fluorescens intensitet opprettholdes.
- Beregn fluorescens Tetthetsgrad ved hjelp av følgende formel:
=
Merk: fluorescens Tetthetsgrad indikerer konsentrasjonen av en organelle ved centrosome sammenlignet med dens fordeling i hele cellen.
- Beregn polariteten til centrosome og Golgi-apparatet (figur 1B).
- Analyse av celle spredning og distribusjon av organeller i B-celler aktivert på AG-coverslips
- Beregn organelle fordeling på IS (figur 4b).
Merk: denne algoritmen tillater kvantifisering av XY-fordelingen av organeller og deres konsentrasjon i midten av IS. Vi definerer et forhold på fluorescens tetthet mellom den sentrale og den totale Synaptic området. Verdiene innhentet kan variere fra negativ til positiv, noe som indikerer en perifer eller en sentral fordeling av organelle, henholdsvis.- Bestem sektoren der cellen er i kontakt med dekslet.
Merk: for å avgrense cellegrensene kan man merke plasma membranen eller utgangen som er beriket i periferien av IS. - Endre typen av stykket til 8-bit, deretter binarize (Process | Binære | Lag Binary) og koble den nærmeste outsider poeng Process | Binære | Disposisjon. Avgrens grensene for celleområdet (ca) ved hjelp av polygonverktøyet utvalg.
Merk: dette trinnet er nyttig for å øke kontrasten i cellegrensene og gjøre det enklere å identifisere. Også på dette punktet, er det mulig å bruke analysere partikkel plugg av ImageJ å bestemme ca automatisk. Andre celler i samme felt kan imidlertid forstyrre resultatene. - Ta ca parametere (høyde og bredde) og avgrense et sentralt avrundet område, som er atskilt fra grensene med en fjerdedel av høyde og bredde verdier, vurdere dette området som Cell Center området (CCA).
- Beregn fordelingen av fluorescens tetthet i midten av IS ved hjelp av følgende formel:
- Bestem sektoren der cellen er i kontakt med dekslet.
- Mål organelle fordeling i Z-plan (figur 4c).
Merk: denne analysen bestemmer den generelle fordelingen av organelle fluorescens over Z fly av B-celler aktivert på AG-coverslips, som viser prosentandelen av fluorescens per Z brøk.- Å kvantifisere fluorescens fordelingen i Z, først bestemme flyet av IS der cellen er i kontakt med AG-dekkglass og deretter flyet som tilsvarer den øvre grensen av cellen.
- Tegner en linje over celle senteret.
- Reslice bildet i Z (bilde | Stabler | Reslice), for å få en XZ bilde.
- Mål høyden, og del XZ-bildet i 10 påfølgende rektangler med samme høyde (Z-brøk) fra bunnen (IS-grensesnittet) til toppen (øvre side av cellen), og Kvantifisere det fluorescens signalet i hver av dem.
- Normalisere den fluorescens intensiteten til hver Z-brøk med summen av den totale fluorescens til de 10 fraksjonene.
- Plot prosenten av fluorescens intensitet per Z brøkdel av cellen.
- Beregn organelle fordeling på IS (figur 4b).
=
5. isolering av centrosome fraksjon fra hvile og aktivert B-celler
Merk: Behold alle løsninger ved 4 ° c under eksperimentet for å unngå protein forringelse. Denne protokollen er tilpasset fra tidligere arbeid17,18.
- Aktiver 2 x 107 B-celler med AG-belagte perler i 2 ml Click medium + 2% varme-deaktivert FBS (ratio 1:1). Vurder ikke-aktiverte B-celler som hvile B-celler.
- Legg til cytochalasin D (2 μM) og nocodazole (0,2 μM) og ruge for 1 time ved 37 ° c.
Merk: disse stoffene brukes til å forsiktig løsne centrosome fra kjernen, ved depolymerizing utgangen cytoskeleton og mikrotubuli, henholdsvis for å unngå kjernefysisk forurensning. - Vask hver prøve med 5 mL kald 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) og deretter med 1 mL 0,1 x TBS supplert med 8% sukrose.
- Resuspend cellene med 150 μL av centrosome lyseringsbuffer (1 mM HEPES, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mM MgCl2, 0,1% Beta-Mercaptoethanol, 1 mm phenylmethylsulfonyl FLUOR (PMSF) eller protease inhibitor cocktail) og pipette opp og ned til viskositet reduseres, noe som indikerer at cellelyse er identifisert i prøven. Sett prøven i et 1,5 mL rør.
- Sentrifuger ved 10 000 x g for 10 min ved 4 ° c, for å skille organeller fra kjernen.
- Supernatanten forsiktig tilbake og sett den på toppen av en 1,5 mL rør med 300 μL av gradient buffer (GB) (10 mM rør pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-mercaptoethanol) som inneholder 60% sukrose.
- Sentrifuger på 10 000 x g i 30 min ved 4 ° c for å konsentrere centrosomes i 60% sukrose brøkdel.
- I mellomtiden forbereder en usammenhengende stigning i 2 mL ultracentrifuge rør ved å overliggende 450 μL av GB + 70% sukrose med 270 μL av GB + 50% sukrose og deretter 270 μL av GB + 40% sukrose.
- Etter den første sentrifugering (centrosome brøkdel), kast den øvre fraksjonen (mindre tett del) til du kommer til grensesnittet og Vortex den gjenværende prøven i røret. Deretter overlegg på toppen av usammenhengende gradient tidligere utarbeidet med centrosome beriket prøven.
Merk: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer graderingen, alle pipettering prosedyrer må utføres nøye. - Sentrifuger på 40 000 x g for 1 t ved 4 ° c med minimal akselerasjon og med sentrifuge bremsen satt til av, for å unngå å forstyrre graderingen.
- Samle 12 fraksjoner av 100 μL i separate rør som begynner fra toppen.
- Identifiser centrosome beriket fraksjoner ved immunoblot ved hjelp av γ-tubulin som centrosome markør.
Merk: vi finner vanligvis centrosome ekstrakter mellom brøker 6 og 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikkelen viser hvordan B-celler kan aktiveres ved hjelp immobilisert antigen på perler eller coverslips å indusere dannelsen av en IS. Vi gir informasjon om hvordan å identifisere og kvantifisere polarisering av ulike organeller ved immunofluorescence og hvordan å karakterisere proteiner som gjennomgår dynamiske endringer i deres tilknytning til centrosome, som polarizes til IS, ved hjelp av en biokjemiske tilnærming.
Imaging av B-celler ved immunofluorescence tillater oss å følge dynamikken i organeller som centrosome, Golgi apparater og lysosomer, som er rekruttert til IS upon B celle aktivering. Man kan få kvantitative parametre for å måle polarisering av disse organeller til IS og sammenligne dem under ulike forhold. Som vi viser i figur 1a, er Centrosome og Golgi apparatet rekruttert til is upon B celle aktivering. Rekruttering ble ikke observert i B-celler stimulert med BCR-ligand-som indikerer at BCR engasjement er nødvendig for å mobilisere centrosome og Golgi apparatet til IS (figur 1a). For å få en polaritet indeks for hver organelle, som et mål på sin nærhet til IS, vurderte vi tre funksjoner: avstanden mellom organelle og midten av cellen, avstanden mellom perle sentrum og cellen sentrum, og vinkelen mellom disse to vektorer (figur 1B). Denne indeksen varierer mellom-1 (anti-polarisert) og 1 (fullt polarisert, objekt på perlen). Figur 1C og 1d Vis grafer der polaritet indekser av hver organelle er plottet versus tidspunktet for aktivering. I samråd med immunofluorescence farging, både centrosome og Golgi apparater, vise mer positive polaritet indekser ved lengre tid punkter aktivering, som reflekterer hvordan de er progressivt rekruttert til IS. Denne algoritmen gjelder for organeller begrenset til ett punkt.
I tillegg kvantifisert vi polarisering av organeller som viser en spredt distribusjon, for eksempel lysosomer (figur 1e), ved å bruke den samme algoritmen nevnt før, men å endre punktet koordinere med massen sentrum koordinatene til lysosomer (figur 1F). Vi kan observere at polariteten indeksene av lysosome bassengene nå mer positive verdier ved aktivering, som indikerer at lysosomer blir mobilisert mot synapse upon B celle aktivering (figur 1g).
Vi har også definert to algoritmer for å bestemme organeller som er i kontakt med Synaptic grensesnittet (perle) og mengden av organeller ved nærhet av synapse, men ikke nødvendigvis i kontakt. Som vi viser i figur 2, vi kvantifisert lysosomer kontakte Synaptic grensesnittet (figur 2a), ved å dele LAMP-1 signal på perle området av den totale fluorescens i cellen pluss perle (figur 2b). Det er viktig å tenke på at diameteren av perle området bestemmer områdene av prosenter innhentet. I kvantifisering som vises (figur 2b) tegner vi for eksempel en sirkel med en diameter på 3 μm for å måle fluorescens ved perlen, som er en restriktiv parameter med tanke på perle størrelsen (3 μm). Ved hjelp av denne parameteren, resultatene viser at lysosomer er progressivt rekruttert til Synaptic grensesnittet på B celle aktivering, og nådde 10-15% av den totale massen (figur 2C). En annen tilnærming som vises er kvantifisering av lysosomer til Synaptic området. Figur 2D viser at lysosomer gradvis akkumuleres opptil 25% av deres LYSOSOMER på is. Samlet, ved å utføre begge typer analyser man kan evaluere polarisering og docking av organeller på IS.
Ved aktivering av B-celle er endringer i utvalget av centrosome-tilknyttede proteiner blitt dokumentert5. For eksempel, ettall av disse protein det endre deres forening for det Centrosome i løpet av B cellen aktivisering er utgangen. I dette tilfellet utgangen blir utarmet i denne regionen, som gjør at centrosome å bli løsrevet fra kjernen, fremme sin polarisering til IS5. Her presenterer vi kvantifisering av utgangen på Centrosome og hvordan den er oppbrukt ved B celle aktivering (Figur 3). For å definere centrosome området som brukes til å kvantifisere tilknyttede utgangen, målte vi den fluorescens intensiteten til denne etiketten i konsentriske sirkler rundt centrosome. Radiusen ble definert basert på punktet der minst 70% av den fluorescens intensiteten til etiketten opprettholdes (figur 3b). Ved hjelp av denne tilnærmingen kan man kvantifisere reduksjonen i utgangen tetthet ved centrosome ved B-celle aktivering, som vist i figur 3c.
For å oppnå større oppløsning i fordelingen av organeller på IS-grensesnittet, aktiverte vi B-celler på antigen-belagt coverslips, merkings utgangen, Golgi-apparatet og endoplasmatiske-retikulum (figur 4a). Fordelingen av organeller på IS kan utføres ved dykking i Synaptic området i et sentralt og perifere området, anvende et kriterium vist i figur 4b. Dette var basert på tidligere arbeid som viser at bindende regler samles innenfor dette sentrale området, som mest sannsynlig tilsvarer den sentrale supramolekylært aktiverings kompleks (cSMAC)10,19. Figur 4a viser at organeller rekruttert til is, slik som Golgi-apparatet og endoplasmatiske-retikulum viser motsatte distribusjoner. Faktisk deres distribusjon indekser relatere med sine immunofluorescence flekker vist i figur 4c. Golgi apparatet viser en positiv verdi, noe som betyr at det er konsentrert i midten av IS mens endoplasmatiske retikulum viser negative verdier, noe som betyr at det er i hovedsak lokalisert ved den perifere regionen av IS. I tillegg er det mulig å ta verdiene av Synaptic området tidligere bestemt, for å måle spredningen området under B celle aktivering, som det er vist i tall 4d og 4e. Disse resultatene viser en økning i spredningen området på B celle aktivering, som tidligere beskrevet10,20.
Som i perle analysen, kan vi bestemme fordelingen av organeller mot immun synapse ved å ta XZ bilder av B-celler aktivert på antigen-belagt coverslips og måle organelle fluorescens over Z-dimensjonen (figur 4f). Den fluorescens intensiteten i utgangen i Z-flyet ble målt, slik det er representert i XZ-flyet i figur 4f, der en progressiv berikelse av utgangen på Synaptic-grensesnittet (brøk 1 og 2) kan observeres (figur 4G).
I tillegg til B-cellenes bildeanalyse utførte vi isolasjonen av centrosome fraksjoner for å kvantifisere centrosome proteiner (figur 5a). Denne tilnærmingen kan være viktig å utfylle studiet av IS formasjon i B-celler, gitt at centrosome polarizes til Synaptic membranen og har vist seg å koordinere lysosome smugling involvert i antigen utvinning og presentasjon21. Denne metoden ble tidligere beskrevet ved hjelp av store mengder celler (1 x 109 celler)17,18 men vi har standardisert en forenklet versjon, som bruker en redusert mengde celler og kan utføres ved hjelp av lavere volum ultracentrifuge (2-3 mL). Som vi viser i figur 5B, analyserte vi forskjellige celle fraksjoner ved proteinimmunoblotting og bestemte hvilke som tilsvarer centrosome-rike fraksjoner, ved gamma tubulin farging. Her viser vi et eksempel på proteiner som gjennomgår endringer i akkumulering ved centrosome, for eksempel utgangen og Arp2, som tidligere har blitt rapportert5.
Figur 1 : Polarisering av organeller mot is. (A) Immunofluorescence farging av Golgi apparatet (Rab6a) og mikrotubuli (α-tubulin) i IIA 1.6 B-celler INKUBERT med BCR-ligand + (0, 30, 60 og 120 min) eller BCR-ligand-perler (120 min). Pilspisser angir centrosome. BF = skarpt felt. Scale bar = 3 μm. (B) skjema som viser hvordan man beregner polariteten til organeller (Centrosome eller Golgi apparat) mot is. a = avstand mellom midten av cellen (CC) til organelle. b = avstand fra CC og til perle senteret (BC). (C, D) Representative prikk plott som viser polaritet indekser av organeller på ulike tidspunkt punkter for aktivering. Hvert punkt representerer én celle. (E) Immunofluorescence farging av lysosomer (Lamp1) i B-celler INKUBERT med BCR-ligand + (0, 30, 60 og 120 min) eller BCR-ligand-perler (120 min). BF = skarpt felt. Scale bar = 3 μm. (F) ordning som representerer hvordan polariteten indeksen av lysosomer. a = avstand mellom CC til masse senteret (MC). b = avstand fra CC til BC. G Representative prikk plott som viser polaritet indekser av lysosomer på ulike tidspunkt punkter for aktivering. Hvert punkt representerer én celle. 2-veis ANOVA med Sidak ' s post-test ble utført. Means med SEM vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Akkumulering av lysosomer på is. (A) Immunofluorescence farging av lysosomer (Lamp1) i B-celler INKUBERT med BCR-ligand + (0, 30, 60 og 120 min) eller BCR-ligand-perler (120 min). BF = skarpt felt. Skala bar = 3 μm. (B) skjema som viser hvordan du beregner akkumulering av organeller, for eksempel lysosomer ved perlen og Synaptic-området. Fluorescens av hele cellen (WCF), bead fluorescens (BF) og Synaptic området fluorescens (SAF) er angitt. (C, D) Representative bar grafer for akkumulering av lysosomer på perle og Synaptic området. N = 1. 20 > celler. 2-veis ANOVA med Sidak ' s post-test ble utført. Means med SEM vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Kvantifisering av utgangen ved centrosome under is-formasjonen. (A) Immunofluorescence farging av utgangen (Phalloidin) og mikrotubuli (α-Tubulin) i B-celler INKUBERT med BCR-ligand + (0 og 60 min) eller BCR-ligand-perler (0 og 60 min). Pilhodene indikerer centrosome. Skala bar = 3 μm. (B) skjema viser hvordan man skal beregne rekrutteringen eller reduksjonen av Centrosome tilknyttede komponenter. Centrosome området beregnes ved hjelp av en radius (X μm) som opprettholder minst 70% av maksimal fluorescens. (C) representative prikk plott viser utgangen ved centrosome under aktivering (BCR-ligand +) og ikke-aktivering (BCR-ligand-) forhold. N = 1. 15 > celler. 2-veis ANOVA med Sidak ' s post-test ble utført. Means med SEM vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Distribusjon av cellulære komponenter på Synaptic grensesnittet. (A) Immunofluorescence farging av utgangen (Phalloidin), endoplasmatiske retikulum (Sec61a), Golgi apparat (transfekterte med en KDELR-DN-GFP en negativ DOMINERENDE av KDEL reseptor, som lokaliseres i Golgi). B-celler ble sådd på coverslips belagt med en BCR-ligand + for 60 min. BF = lyse felt. Scale bar = 5 μm. (B) skjema som viser hvordan du fastslår spredningen av cellen og rekruttering av organeller i sentrum av is. I skjemaet angir CA celleområdet avgrenset av kortikale utgangen og CCA angir senter celleområdet. (C) Golgi apparater og endoplasmatiske retikulum fordeling på is, representert ved et søylediagram der en verdi > 0 indikerer en berikelse i MIDTEN av IS og < 0 indikerer en perifer distribusjon. N = 1. 20 > celler. Means med SEM vises. (D) representative bilder av B-celler merket for utgangen (Phalloidin) aktivert på AG-belagt coverslips på ulike tidspunkt punkter (0, 30 og 60 min), viser XZ og XY flyet. (E) graf som viser spredning området av B-celler i E. (F) skjema som viser hvordan du fastslår fordelingen av signalet av interesse i z-planet, og plottet per Z brøk. Rektangelet angir IS-grensesnittet. (G) fordeling av utgangen over Z-planet representert ved et linje plott av prosenten av fluorescens fordeling kontra hver Z-brøk. Rektangelet representerer IS-grensesnittet. N = 1. 25 > celler. Means med SEM vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Centrosome beriket fraksjoner av B-celler. (A) arbeidsflyt på hvordan du skaffer centrosome-beriket fraksjoner av sukrose gradient ultracentrifugation. (B) Immunoblot av fraksjoner innhentet fra hvile og aktivert B-celler (60 min). Centrosome fraksjoner oppdages ved merking med γ-tubulin og indikeres i det stiplede rektangelet (brøk 6 til 8). Centrosome tilhørende proteiner (utgangen og Arp2) er vist i Centrosome-rike fraksjoner under aktivering og hvile forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en omfattende metode for å studere hvordan B-lymfocytter re-organisere sine intracellulære arkitektur for å fremme dannelsen av en IS. Denne studien omfatter bruk av Imaging teknikker for å kvantifisere den intracellulære fordelingen av organeller, som centrosome, Golgi apparater og lysosomer under B celle aktivering, og hvordan de polariserer til IS. I tillegg beskriver vi en biokjemiske tilnærming til å studere endringer i centrosome sammensetning ved B celle aktivering.
For å fremme dannelsen av en IS i B-celler, brukte vi immobilisert antigener (antigen-belagt perler) i stedet for løselig uimottakelig-komplekser fordi den tidligere utløser etablering av en diskret kontakt nettsted der cytoskeleton rearrangements og organelle polarisering kan enkelt bli studert. Et kritisk aspekt i Imaging B celle aktivering er utarbeidelse av prøvene. Alle bildeoppkjøp bør ideelt sett få en 1:1 celle: perle ratio, for å kvantifisere polarisering av organeller til et unikt sted av antigen kontakt. Men i noen tilfeller B-celler kan fange to eller flere perler, og dermed gjør det vanskelig å velge et enkelt område av antigen møte. For å unngå dannelse av perle aggregater, er det viktig å Vortex antigen-bøyd perler grundig før du legger dem til cellene. I tillegg, for immunofluorescence eksperimenter, anbefaler vi unntatt fra kvantifisering celler som fanger mer enn én perle, for å unngå feiltolkninger under bildeanalyse. Et annet kritisk trinn i utarbeidelsen av prøvene er fiksering/permeabilization tilstand. For eksempel anbefaler vi å fikse celler med metanol for å optimalisere mikrotubulinettverket farging og 4% PFA for phalloidin farging. Når samtidig merking utgangen cytoskeleton og mikrotubuli, kan et alternativ være å merke utgangen bassenget ved transfecting celler med en LifeAct-GFP/RFP uttrykk plasmider i kombinasjon med mikrotubulinettverket farging. Image oppkjøpet brukes til å kvantifisere polarisering av Centrosome og andre intracellulære organeller kan utføres med et epifluorescence mikroskop. Men for å få en nøyaktig kvantifisering på ulike z-fly, for eksempel i spredningen analysen, konfokalmikroskopi mikroskopi er nødvendig.
For den centrosome isolasjons protokollen som beskrives her, er et kritisk trinn å skaffe en passende mengde prøver for å kunne kvantifisere proteiner etter immunoblot. Gitt at B-celler har en stor kjerne og deres cytoplasma er mindre enn 30% av deres totale celle volum, få høyere avkastning av cytoplasmatiske proteiner kan være utfordrende. Derfor anbefaler vi at du bruker ca. 20 x 106 B celler for hvert aktiverings tidspunkt for centrosome isolering.
En betydelig begrensning av disse metodene er at aktivering med antigen-bøyd perler ikke inkluderer kompleksiteten i miljøet der overflate-bundet antigener er presentert for B-celler i vivo. Denne begrensningen kan løses ved å supplere kulturen eller perlene med andre stimulerende faktorer, slik som cytokiner og komponenter i ekstracellulære matrise. Det er imidlertid avgjørende å bruke de riktige kontrollene i disse tilfellene for å tolke resultatene riktig.
Betydningen av metodene som presenteres i dette arbeidet er avhengig av den integrerte tilnærmingen brukes til å studere B-cellen immune synapse: (1) polarisering av organeller og deres distribusjon og (2) endringene i protein sammensetning på centrosome. På grunn av det store antallet celler som kreves for å utføre en betydning analyse og den store mengden data som genereres i denne prosessen, de ulike kvantifisering algoritmer som presenteres i dette arbeidet forenkle analyse av celle Imaging. I tillegg er algoritmene som brukes for celle polarisering, enkle å automatize ved å bruke makrofunksjoner i ImageJ, som er et nyttig verktøy for å redusere repetitive oppgaver og spare tid.
Disse eksperimentelle prosedyrer kan ekstrapolert til andre typer celler som etablerer polarisert fenotyper for å oppnå en viss cellulær funksjon. I tillegg kan disse protokollene optimaliseres ved å inkludere andre analyser, for eksempel aktiviteten til de tilknyttede proteinene som kinaser eller proteaser i Centrosome-beriket fraksjoner. Samlet sett kan disse studiene gi mekanistisk innsikt i celle signalering og molekylære trasé som regulerer etablering av celle polaritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
M.-I.Y. er støttet av et forskningsstipend fra FONDECYT #1180900. J.I., D.F. og JL ble støttet av stipend fra Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Vi takker til David Osorio fra Pontificia Universidad Católica de Chile for videoopptak og redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
