Summary
Häri beskriver vi två metoder för att karakterisera cellpolariseringshändelser i B-lymfocyter under bildandet av en IS. Den första, innebär kvantifiering av organell rekrytering och cytoskelettet rearrangemang vid Synaptic membranet. Den andra är en biokemisk metod, att karakterisera förändringar i sammansättningen av centrosome, som genomgår polarisering till immun synapsen.
Abstract
Erkännande av ytbundna antigener av B-cellreceptorn (BCR) utlöser bildandet av en immunsynapse (IS), där både signalering och antigen upptag samordnas. Är bildandet innebär dynamisk aktin remodeling åtföljs av den polariserade rekrytering till Synaptic membranet i centrosom och tillhörande intracellulära organeller såsom lysosomer och Golgi apparaten. Inledande stadier av aktin remodeling tillåta B-celler att öka sin cellyta och maximera mängden antigen-BCR komplex samlades vid synapsen. Under vissa förhållanden, när B-celler känner igen antigener i samband med stela ytor, är denna process kopplad till den lokala rekryteringen och utsöndringen av lysosomer, vilket kan underlätta antigen utvinning. Uptaken antigener internaliseras till specialiserade endo-lysosome fack för bearbetning till peptider, som lastas på större histocompatibility complex II (MHC-II) molekyler för vidare presentation till T Helper celler. Därför är att studera organell dynamik i samband med bildandet av en är avgörande för att förstå hur B-celler aktiveras. I den nuvarande artikeln kommer vi att diskutera både avbildning och en biokemisk teknik som används för att studera förändringar i intracellulär organell positionering och cytoskelettet rearrangemang som är förknippade med bildandet av en är i B-celler.
Introduction
B-lymfocyter är en viktig del av det adaptiva immunsystemet som ansvarar för att producera antikroppar mot olika hot och invaderande patogener. Effektiviteten i produktionen av antikroppar bestäms av B-cellernas förmåga att förvärva, bearbeta och presentera antigener som påträffas antingen i en löslig eller ytuppbundna form1,2. Erkännande av antigener som är knutna till ytan av en presenterande cell, av BCR, leder till bildandet av en nära intercellulära kontakt kallas är3,4. Inom denna dynamiska plattform sker både BCR-beroende nedströms signalering och internalisering av antigener till endo-lysosome fack. Uptaken antigener bearbetas och monteras på MHC-II molekyler och därefter presenteras för T-lymfocyter. Produktiva B-T interaktioner, benämnd B-T cell samarbete, tillåta B-lymfocyter att ta emot lämpliga signaler, som främjar deras differentiering till antikroppsproducerande plasmaceller eller minnesceller8.
Två mekanismer har varit inblandade i antigen utvinning av B-celler. Den första är beroende av utsöndringen av proteaser från lysosomer som genomgår rekrytering och fusion vid den synaptiska spalten5,6. Den andra, beror på myosin IIA-medierade dragkrafter som utlöser invagination av antigen som innehåller membran som internaliseras i clathrin-belagda gropar7. Läget för antigen utvinning förlitar sig på de fysikaliska egenskaperna hos det membran där antigener påträffas. Ändå, i båda fallen, B-celler genomgår två stora remodeling händelser: aktin cytoskelettet omorganisering och polarisering av organeller till is. Actin cytoskelettet remodeling innebär en första spridning skede, där Actin-beroende utskjutande på Synaptic membranet öka ytan i kontakt med antigenet. Detta följs av en kontraktion arrangerar gradvis, var bcrs tillsammans med antigener koncentreras i centrera av är vid den samordnade handlingen av molekylära motorer och aktin cytoskelettet remodeling8,9,10, 11. polarisering av organeller förlitar sig också på ombyggnad av aktin cytoskeleton. Till exempel blir centrosom unhopkopplad från kärnan, av lokala depolymerization av tillhörande aktin, som gör det möjligt att repositionera av denna organell till är5,12. I B-celler, ompositionering av centrosom till en cell Pole (is) guider Lysosomen rekrytering till Synaptic membranet, som vid sekretion kan underlätta utvinning och/eller bearbetning av ytbundna antigener6. Lysosomer rekryteras på IS är berikade med MHC-II, som gynnar bildandet av peptid-MHC-II komplex i endosomalt fack som skall presenteras för T-celler13. Dessutom har den Golgi apparaten också observerats för att vara nära rekryteras till IS14, vilket tyder på att Golgi-härledda blåsor från den sekretoriska vägen kan vara inblandade i antigen utvinning och/eller bearbetning.
Helt och hållet, intracellulära organell och cytoskelettet rearrangemang i B-celler under synapsen bildas är de viktigaste stegen som möjliggör effektiv antigen förvärv och bearbetning krävs för deras vidare aktivering. I detta arbete introducerar vi detaljerade protokoll om hur man utför avbildning och biokemisk analys i B-celler för att studera den intracellulära remodeling av organeller i samband med bildandet av en IS. Dessa tekniker inkluderar: (i) immunofluorescens och bildanalys av B-celler som aktiveras med antigen-belagda pärlor och på antigen-belagda täckglas, vilket möjliggör visualisering och kvantifiering av intracellulära komponenter som mobiliseras till IS och (II ) isolering av centrosome-berikade fraktioner i B-celler genom ultracentrifugering på sackaros gradienter, som gör det möjligt att identifiera proteiner i samband med centrosome, potentiellt involverade i regleringen av cellernas polaritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: följande steg utfördes med hjälp av IIA 1.6 B-celler.
1. B cell aktivering med antigen-belagda pärlor
- Beredning av antigen-belagda pärlor
- För att aktivera B-celler, Använd NH2-pärlor kovalent belagda med antigen (AG-belagda pärlor), som bereds med 50 μl (~ 20 x 106 pärlor) av 3 μm NH2-pärlor med aktiverande (BCR-ligand +) eller icke-aktiverande (BCR-ligand-) antigener.
- För IIA 1.6 B celler använda anti-IgG-F (AB ')2 fragment som BCR-ligand + och anti-IGM-f (AB ')2 eller bovint serum albumin (BSA) som BCR-ligand-. För att aktivera primära B-celler eller IgM+ B cellinjer använda anti-IGM-F (AB ')2 som BCR-LIGAND + och BSA som BCR-ligand-.
Anmärkning: för att undvika bindning av ligander till FC-receptorn, Använd F (AB ') eller F (AB ')2 antikroppar fragment i stället för fullängds antikroppar. - För att fortsätta med beredningen av AG-belagda pärlor, placera pärlorna i låg proteinbindning mikrocentrifug rör för att maximera pärlor återhämtning under provet manipulation. Tillsätt 1 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att tvätta pärlor och centrifugera vid 16 000 x g i 5 min. aspirera på supernatanten.
- Omsuspendera pärlorna med 500 μL 8% glutaraldehyd för att aktivera NH2 -grupperna och rotera för 4 h vid rumstemperatur (RT).
FÖRSIKTIGHET: lösningen av glutaraldehyd bör endast användas i ett kemiskt rök skydd. Följ instruktionerna på säkerhetsdatabladet (MSDS). - Centrifugera pärlor på 16 000 x g i 5 min, ta bort glutaraldehyd och tvätta pärlorna tre gånger med 1 ml 1x PBS.
FÖRSIKTIGHET: glutaraldehydlösningen ska kasseras som ett farligt kemiskt avfall. - Omsuspendera de aktiva pärlorna i 100 μL 1x PBS. Provet kan delas in i två mikrocentrifugrör med låg proteinbindningsgrad: 50 μL för BCR-ligand + och 50 μL för BCR-ligand-.
- För att bereda antigen lösningen Använd två 2 mL låg proteinbindnings-mikrocentrifugrör som innehåller 100 μg/mL antigen lösning i 150 μL PBS: ett rör med BCR-ligand + och andra med BCR-ligand-.
- Tillsätt 50 μL av den aktiva pärllösningen till varje tub som innehåller 150 μL antigen lösning, Vortex och rotera över natten vid 4 ° c.
- Tillsätt 500 μL 10 mg/mL BSA för att blockera kvarvarande reaktiva NH2 -grupper på pärlorna och rotera i 1 h vid 4 ° c.
- Centrifugera pärlorna vid 16 000 x g i 5 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten. Tvätta pärlorna med kallt 1x PBS tre gånger till.
- Omsuspendera de aktiva pärlorna i 70 μL 1x PBS.
- För att bestämma den slutliga koncentrationen av AG-belagda pärlor, späd en liten volym av pärlor i PBS (1:200) och räkna med hjälp av en hemocytometer. Förvara sedan vid 4 ° c till användning.
Obs: AG-belagda pärlor bör inte förvaras i mer än 1 månad.
- Beredning av poly-L-lysintäckare
- Före B-cells aktiverings analysen med AG-belagda pärlor, Förbered Poly-L-lysine-belagda täckband (PLL-täckglas). Använd ett 50 mL-rör som innehåller 40 mL 0,01% w/v PLL-lösning och sänk ned täckslinsen med 12 mm diameter i lösningen. Rotera över natten vid RT.
- Tvätta täckglaslocken med 1x PBS och låt torka på ett 24-väl plåtlock täckt med paraffin film. Fortsätt med B-cellsaktivering.
- B cell aktiveringen
- För att starta B-cellsaktivering med pärlor, först späda ut IIA 1,6 B cellinjer till 1,5 x 106 celler/ml i Klicka medium (rpmi-1640 kompletteras med 2 mm L-alanin-L-glutamin + 55 μm beta-merkaptoetanol + 1 mm pyruvat + 100 U/ml Penicillin + 100 μg/ml (streptomycin) + 5% värmeinaktiverat fetalt bovint serum [FBS]).
- Kombinera 100 μL (150 000 celler) av IIA 1,6 B-celler med AG-belagda pärlor på 1:1 förhållandet i 0,6 mL rör. Blanda försiktigt med en virvel och frö på PLL-COVERSLIPS. Inkubera för olika tidspunkter i en cell odlings inkubator (37 ° c/5% CO2). De typiska aktiverings tiderna är 0, 30, 60 och 120 min. För tid 0, placera PLL-COVERSLIPS i 24-brunnen plattan locket på isen. Tillsätt den cell-AG-belagda pärlblandningen och inkubera i 5 min på isen.
Obs: det är viktigt att blanda med Vortex istället för att Pipettera upp och ner, eftersom detta kan minska antalet pärlor i provet, på grund av att de ackumuleras i pipettens plastspets. Använd pärlor belagda med BCR-ligand-som en negativ kontroll för varje analys. Vi rekommenderar att du först aktiverar den längsta inkubationstiden och därefter följande tidpunkter. Beräkna intervall för aktivering för prover så att de är klara för fixering på samma gång. - Tillsätt 100 μL kallt 1x PBS till varje täckslip för att stoppa aktiveringen och fortsätta med immunofluorescensprotokollet. Se protokoll avsnitt 3.
2. B-cellsaktivering av antigen-belagda täckglas
-
Beredning av antigen-belagda täckglas
- Bered antigen lösningen (1x PBS som innehåller 10 μg/mL BCR-ligand + och 0,5 μg/mL råtta CD45R/B220) före aktiveringen.
Obs: Överväg att förbereda täckglas dagen före analysen. B220 förbättrar adhesionen av B-celler, men BCR-ligand + är tillräcklig för att generera spridnings svaret. - Placera 12 mm täckglaslock på en 24-brunn plåt locket täckt med paraffin film, tillsätt 40 μL antigen lösning på varje täckslip och inkubera vid 4 ° c över natten. Försegla plattan för att undvika avdunstning av antigen lösning.
- Tvätta täckglas med 1x PBS och lufttorka.
- Bered antigen lösningen (1x PBS som innehåller 10 μg/mL BCR-ligand + och 0,5 μg/mL råtta CD45R/B220) före aktiveringen.
-
B cell aktiveringen
- För att starta aktiveringen, späd IIA 1,6 B-celler till 1,5 x 106 celler/ml i Klicka medel + 5% FBS.
- Tillsätt 100 μL av cellerna på en antigen-belagd täckslip (AG-täckslip) och aktivera för olika tidpunkter i en cellinkubator vid 37 ° c/5% CO2. De typiska aktiverings tiderna är 0, 30 och 60 min.
Anmärkning: som i avsnitt 1, rekommenderar vi börjar med den längsta aktiveringspunkten för att åtgärda alla prover på samma gång. - För tid 0, placera 24-brunnen plattan locket som innehåller AG-täckslip på is och tillsätt cellerna. Inkubera i 5 minuter på isen.
- Sug försiktigt upp mediet på varje AG-täckslip och tillsätt sedan 100 μL kallt 1x PBS för att stoppa aktiveringen. Fortsätt med immunofluorescensprotokollet. Se avsnitt 3.
3. immunofluorescens
Anmärkning: för att undvika korreaktivitet av den sekundära antikroppen med BCR i IIA 1,6 B-celler, Använd inte mus-härledda primära antikroppar.
- Ta bort 1x PBS och fortsätt med fixering av varje täckslip.
Obs: för att bestämma vilket bindnings medium som ska användas, kontrollera databladet för antikropp/färg. Till exempel, för aktin märkning av phalloidin använda PARAFORMALDEHYD (PFA) fixering medium, och för centrosom märkning av pericentrin använda metanol fixering.- Tillsätt 50 μL 1x PBS kompletterad med 4% PFA och inkubera i 10 minuter vid RT.
FÖRSIKTIGHET: formaldehyd är giftig. Läs belastningsbesvär innan du arbetar med denna kemikalie. PFA-lösningar bör endast göras under en kemisk draghuv som bär handskar och skyddsglasögon. PFA-lösningen ska kasseras som ett farligt kemiskt avfall. - Alternativt, tillsätt 50 μL kall metanol och inkubera i 20 min.
- Tillsätt 50 μL 1x PBS kompletterad med 4% PFA och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Tvätta tre gånger med 1x PBS.
Anmärkning: täckglas kan förvaras vid 4 ° c i denna punkt under högst tre dagar i 1x PBS. - Ta bort 1x PBS och tillsätt 50 μL blockeringsbuffert (2% BSA + 0,3 M glycin i 1x PBS) på varje täckslip. Inkubera vid RT i 10 minuter.
- Aspirera försiktigt och tillsätt 50 μL permeabiliseringsbuffert (PB) (0,2% BSA + 0,05% saponin i 1x PBS). Inkubera vid RT i 20 minuter.
- Bered antikropparna eller färgämnena i PB (Använd 30 μL per täckslip) och inkubera vid RT för 1 h eller över natten vid 4 ° c. Se material tabellen för mer information.
- För att märka mikrotubuli organiserande Center (MTOC) eller centrosom använda följande antikroppar: anti-γ-tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
Anmärkning: för centrosom märkning B-celler kan transfekterade med en centrin-GFP uttryck plasmid. - För märkning Golgi apparater använda anti-Rab6a (1:500).
Obs: andra antikroppar eller färgämnen kan också användas. - För märkning lysosomer, Använd anti-Lamp1 (1:200).
Anmärkning: anti-H2-DM och anti-MHC-II kan också användas för att märka antigen bearbetning fack15,16. - För märkning endoplasmatiska nätmagen använda anti-Sec61a (1:500).
- För aktin cytoskelettet överväga följande: polymeriserade aktin kan visualiseras av phalloidin konjugerat till fluorescerande färgämnen.
Anmärkningar: B-celler som transfekterade med en lifeact-GFP/RFP-uttryck plasmid kan också användas för att märka Actin.
- För att märka mikrotubuli organiserande Center (MTOC) eller centrosom använda följande antikroppar: anti-γ-tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
- Tvätta täckglätten tre gånger med PBS.
- Späd ut sekundär antikropp eller färgämnen i PBS (Använd 30 μL per täckslip) och inkubera 1 h vid RT.
Obs: Undvik att utsätta proverna för direkt ljus för att bevara kvaliteten på fluorescenssignalen. - Tvätta täckglätten tre gånger med PBS.
- Ta bort PBS-lösningen från täcklappar.
- Tillsätt 4 μL monteringsreagens i ett Mikroskop glas. Montera täckglaset på bilden med cell sidan vänd nedåt. Låt bilderna torka i 30 min vid 37 ° c eller vid RT över natten.
Obs: Överväg att använda en "anti-Fade" monteringsreagens (se tabellen med material). - Hämta fluorescensbilder på ett konfokala eller epifluorescensmikroskop med ett mål på 60 x eller 100x Oil Immersion. För varje förvärv överväga genomlysnings ljus eller ljusa fält för att enkelt identifiera B-celler interagerar med pärlor.
Notera: ta tredimensionella (3D) bilder, som täcker hela cellen med hjälp av z-stackar. Vi rekommenderar att ta 0,5 μm tjocka stackar, men detta beror på mikroskopet.
4. bildanalys
Anmärkning: följande algoritmer beskrivs för ImageJ programvara. Detta kan dock utföras med en likvärdig programvara. Tänk också på att för alla mätningar med fluorescensintensitet använder vi den integrerade fluorescensdensiteten ("RawIntDen" i ImageJ), eftersom denna parameter beaktar den totala mängden fluorescens i varje pixel i bilden, med hänsyn tagen till området.
- Analys av distributionen av organeller i B-celler som aktiveras med AG-belagda pärlor
Anmärkning: för att kvantifiera polariseringen av cellkomponenter till IS, definierar vi ett godtyckligt värde som ett mått på närhet till IS. Indexet spänner mellan-1 (anti-polariserat) och 1 (helt polariserat, objekt på Pärlan), som tidigare presenterades av REVERSAT et al.12.- Beräkna polaritetsindexet för apparaten centrosom och Golgi (figur 1b).
ANMÄRKNINGAR: denna algoritm kan användas för organeller som är begränsade till en enda punkt.- Först definiera pärla och cellområden att analysera med hjälp av cirkel verktyget valet att avgränsa gränserna för båda och sedan spara dem som regioner av intresse (ROI). Se figur 1, figur 2, figur 3och figur 4.
- Bestäm cell Center (CC) och Bead Center (BC) genom att köra Analyze | Mått på cell-respektive pärlområden. X-och Y-värden som erhålls från resultat fönstret bestämmer mittkoordinaterna.
- Manuellt bestämma mitten av centrosom eller Golgi apparat (organelle) med hjälp av punkt verktygs val i imagej och kör analysera | Åtgärd. X-och Y-värden som erhålls från resultat fönstret bestämmer koordinaterna.
- Sedan, rita en vinkel från CC till organelle (a) och CC till BC (b) med hjälp av vinkel verktyget val och kör analysera | Åtgärd. Vinkelvärdet i resultat fönstret visar vinkeln (α) mellan båda vektorer (a och b).
- Beräkna polaritetsindexet med hjälp av följande formel:
- Beräkna polaritetsindexet för lysosomer (figur 1f).
Obs: vi använder denna algoritm för att analysera polariteten hos organeller som visar en mer spridd fördelning, såsom lysosomer.- Definiera pärla och cellområden att analysera, med hjälp av cirkel verktyget val att avgränsa gränserna för båda, och spara dem som ROI. När pärl-och cellområdena har bestämts, Ställ in fluorescenskanalen och projicera bilden i en z-stapel (bild | Stackar | Z-projekt [Sum Slices]), sedan köra analysera | Mät och extrahera massan Center (MC) koordinater (MX och min) från resultatfönster.
- Tillämpa samma algoritm som nämns innan du ändrar organelle för MC. Således definieras vinkeln (α) av CC-MC (a) och CC-BC (b).
- Beräkna polariteten med hjälp av följande formel:
- Uppskattning Lysosomen rekrytering till Synaptic området (figur 2b).
Anmärkning: denna algoritm används för att kvantifiera en organell intill IS.- När pärla och cellområden har fastställts, bestämma vinkeln på vektorn mellan CC och BC och sedan rotera bilden för att uppnå en 0 ° vinkel.
- Ställ in Lysrörs kanalen och projicera bilden i en z-stapel (bild | Stackar | Z-projekt [Sum Slices]), eliminera all fluorescens som faller utanför cellen och pärla område tillsammans (kör Edit | rensa utanför i imagej).
- Med hjälp av rektangeln verktygs val, rita en rektangel intill pärlan och mäta Synaptic området fluorescens (SAF). Rektangeln är en fjärdedel av cellbredden.
- Välj hela bilden och kör analysera | Åtgärd för att få hela cellfluorescens (WCF).
- Beräkna den organellfluorescensprocent som gränsar till IS med hjälp av följande formel:
- Kvantifiera rekryteringen av cellulära komponenter till centrosome.
Anmärkning: denna algoritm, anpassad från obino et al.5, används för att kvantifiera anrikning av organeller vid centrosom området. Kortfattat anser vi att centrosom området som den domän där centrosom-associerade organell fluorescens förblir konstant eller över 70% i fluorescens/radie Plot. Det är viktigt att ange denna parameter vid vilo förhållanden eftersom denna radie kan ändras vid aktivering.- När pärl-och cellområden har bestämts, definiera lokaliseringen av centrosom med hjälp av punkt verktygs valet (figur 3b).
- Först bestämma det maximala området runt centrosom som är möjligt att kvantifiera, genom att dra en 3 μm-radie cirkel kring centrosom.
- Använd den radiella profilenimagej plugin, som mäter fluorescensen i koncentriska cirklar och visar en fluorescens/radieplot.
- Identifiera den maximala radie inom vilken minst 70% av fluorescensintensiteten bibehålls.
- Beräkna fluorescensdensitetsförhållandet med följande formel:
=
Anmärkning: fluorescensdensitetsförhållandet indikerar koncentrationen av en organell vid centrosom jämfört med dess fördelning i hela cellen.
- Beräkna polaritetsindexet för apparaten centrosom och Golgi (figur 1b).
- Analys av cell spridning och distribution av organeller i B-celler aktiverade på AG-COVERSLIPS
- Beräkna organelldistributionen vid IS (figur 4b).
Anmärkning: denna algoritm möjliggör kvantifiering av XY fördelningen av organeller och deras koncentration i mitten av IS. Vi definierar ett förhållande av fluorescensdensitet mellan det centrala och det totala synaptiska området. De erhållna värdena kan variera från negativa till positiva, vilket indikerar en perifer eller en central fördelning av organell, respektive.- Bestäm segmentet där cellen är i kontakt med locket.
Anmärkningar: för att avgränsa cellgränserna kan man märka plasmamembranet eller aktin som är berikat i periferin av is. - Ändra typ av segmentet till 8-bitars, sedan binarize (process | Binära | Gör binär) och Anslut den närmaste outsider Points-processen | Binära | Disposition. Avgränsa cell områdets (ca) gränser med hjälp av polygonverktygets markering.
ANMÄRKNINGAR: det här steget är användbart för att öka kontrasten i cellgränserna och göra det lättare att identifiera. Också, på denna punkt, är det möjligt att tillämpa den analysera partikel plugin av imagej att bestämma ca automatiskt. Men andra celler i samma fält kan störa resultatet. - Ta ca -parametrar (höjd och bredd) och avgränsa ett centralt rundat område, som avgränsas från gränserna med en fjärdedel av värdena för höjd och bredd, anser att detta område är cell Center området (CCA).
- Beräkna fluorescensdensitetsfördelningen i mitten av är med hjälp av följande formel:
- Bestäm segmentet där cellen är i kontakt med locket.
- Mät organelldistributionen i Z-plan (figur 4c).
Anmärkning: denna analys avgör den allmänna fördelningen av organell fluorescens över Z plan av B-celler aktiveras på AG-COVERSLIPS, visar andelen fluorescens per Z fraktion.- För att kvantifiera fluorescensfördelningen i Z, Bestäm först planet för det är där cellen är i kontakt med AG-täckslip och sedan det plan som motsvarar den övre gränsen för cellen.
- Rita en linje över cell Center.
- Reslice bilden i Z (bild | Stackar | Reslice), för att erhålla en XZ-bild.
- Mät höjden och dela upp XZ-bilden i 10 raka rektanglar med samma höjd (Z-fraktion) från botten (är Interface) till toppen (övre sidan av cellen) och kvantifiera fluorescenssignalen i var och en.
- Normalisera fluorescensintensiteten för varje Z-fraktion med summan av den totala fluorescensen av de 10 fraktionerna.
- Rita den procentuella fluorescensintensiteten per Z-fraktion i cellen.
- Beräkna organelldistributionen vid IS (figur 4b).
=
5. isolering av centrosome-berikad fraktion från vilande och aktiverade B-celler
Obs: Förvara alla lösningar vid 4 ° c under försöket för att undvika proteinnedbrytning. Detta protokoll anpassades från tidigare arbeten17,18.
- Aktivera 2 x 107 B-celler med AG-belagda pärlor i 2 ml klick medium + 2% VÄRMEINAKTIVERADE FBS (ratio 1:1). Överväg icke-aktiverade B-celler som vilande B-celler.
- Tillsätt cytochalasin D (2 μM) och nocodazol (0,2 μM) och inkubera i 1 h vid 37 ° c.
Obs: dessa läkemedel används för att försiktigt lossa centrosom från kärnan, genom depolymerizing aktin cytoskelettet och mikrotubuli, respektive, för att undvika nukleär kontaminering. - Tvätta varje prov med 5 mL kallt 1x msk (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) och sedan med 1 mL 0,1 x msk kompletterad med 8% sackaros.
- Omsuspendera cellerna med 150 μl av centrosom lyseringsbuffert (1 mm Hepes, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mm mgcl2, 0,1% beta-merkaptoetanol, 1 mm fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) eller proteashämmare cocktail) och Pipettera upp och ner tills viskositet minskar, vilket indikerar att cellen lysis är identifierad i provet. Sätt provet i en 1,5 mL tub.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 10 min vid 4 ° c för att separera organellerna från kärnan.
- Återställ supernatanten försiktigt och placera den ovanpå en 1,5 mL tub med 300 μL gradientbuffert (GB) (10 mM rör pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% beta-merkaptoetanol) som innehåller 60% sackaros.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 30 min vid 4 ° c för att koncentrera centrosomes i 60% sackaros fraktion.
- Under tiden, förbereda en diskontinuerlig gradient i 2 ml första rör genom att överlägga 450 μl av GB + 70% sackaros med 270 μl av GB + 50% sackaros och sedan 270 μl av GB + 40% sackaros.
- Efter den första centrifugeringen (centrosome-koncentrerad fraktion), kassera den övre fraktionen (mindre tät portion) tills den når gränssnittet och vortexta det resterande provet i röret. Sedan overlay ovanpå den diskontinuerliga lutning som tidigare utarbetats med centrosom berikade provet.
Observera: var noga med att inte störa övertoningen, alla pipettering måste utföras noggrant. - Centrifugera vid 40 000 x g i 1 h vid 4 ° c med minimal acceleration och med centrifugbromsen inställd på off, för att undvika att störa lutningen.
- Samla 12 fraktioner av 100 μL i separata rör som börjar från toppen.
- Identifiera centrosom berikade fraktioner av immunoblot med γ-tubulin som centrosom markör.
Anmärkning: vi brukar hitta centrosome-berikad extrakt mellan fraktioner 6 och 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuvarande artikeln visar hur B-celler kan aktiveras med hjälp av immobiliserade antigen på pärlor eller täckglas för att inducera bildandet av en IS. Vi ger information om hur man identifierar och kvantifiera polarisering av olika organeller av immunofluorescensen och hur man karakteriserar proteiner som genomgår dynamiska förändringar i deras förening till centrosome, som polariserar till IS, med hjälp av en biokemisk metod.
Den avbildning av B-celler genom immunofluorescens tillåter oss att följa dynamiken i organeller såsom centrosome, Golgi apparat och lysosomer, som rekryteras till IS upon B cell aktivering. Man kan få kvantitativa parametrar för att mäta polariseringen av dessa organeller till IS och jämföra dem under olika förhållanden. Som vi visar i figur 1a, den centrosome och Golgi apparaten REKRYTERAS till is upon B cell aktiveringen. Rekrytering observerades inte i B-celler som stimulerades med BCR-ligand-vilket tyder på att BCR-engagemang krävs för att mobilisera centrosom och Golgi apparaten till is (figur 1a). För att få en polaritetsindex för varje organell, som en mätning av dess närhet till is, vi ansåg tre funktioner: avståndet mellan organell och mitten av cellen, avståndet mellan pärla centrum och cell centrum, och vinkeln mellan dessa två vektorer (figur 1b). Detta index varierar mellan-1 (anti-polariserat) och 1 (helt polariserat, objekt på Pärlan). Figur 1c och 1d visar grafer där polaritetsindex för varje organell ritas kontra aktiveringstid. I samförstånd med immunofluorescenspfärgning, både centrosom och Golgi apparaten, Visa mer positiva polaritet index på längre tid aktiveringspunkter, vilket återspeglar hur de successivt rekryteras till is. Denna algoritm är tillämplig för organeller som är begränsade till en punkt.
Dessutom kvantifierade vi polariseringen av organeller som visar en dispergerad fördelning, såsom lysosomer (figur 1e), genom att tillämpa samma algoritm som nämndes tidigare, men att ändra punkt koordinaten genom Mass centrens koordinater för lysosomer (figur 1f). Vi kan konstatera att polaritetsindex av Lysosomen pooler nå mer positiva värden vid aktivering, vilket indikerar att lysosomerna håller på att mobiliseras mot synapsen på B-cellsaktivering (figur 1G).
Vi definierade också två algoritmer för att bestämma organeller som är i kontakt med Synaptic Interface (pärla) och mängden organeller i närheten av synapsen, men inte nödvändigtvis i kontakt. Som vi visar i figur 2, vi kvantifierat lysosomer kontakta Synaptic Interface (figur 2A), genom att dividera LAMP-1 signal vid pärlytan av den totala fluorescens i cellen plus pärlan (figur 2b). Det är viktigt att tänka på att diametern på pärlytan bestämmer intervallen av de erhållna procentsatserna. Till exempel, i den kvantifiering som visas (figur 2b) ritar vi en cirkel med en diameter på 3 μm för att mäta fluorescensen på Pärlan, vilket är en begränsande parameter med hänsyn till pärlstorleken (3 μm). Med denna parameter visar resultaten att lysosomer successivt rekryteras till det synaptiska gränssnittet vid B-cellsaktivering, vilket når 10-15% av den totala massan (figur 2C). En annan metod som visas är kvantifiering av lysosomer till synaptiska området. Figur 2D visar att lysosomer successivt ackumuleras upp till 25% av deras LYSOSOMER vid is. Sammantaget genom att utföra båda typerna av analys kan man utvärdera polarisering och dockning av organeller vid IS.
Under B cell aktiveringen, förändringar i poolen av centrosome-associerade proteiner har dokumenterats5. Till exempel är ett av dessa proteiner som förändrar deras förening vid Centrosome under B cell aktiveringen Actin. I detta fall aktin blir utarmat inom denna region, som gör att centrosom att bli fristående från kärnan, främja dess polarisering till is5. Här presenterar vi kvantifieringen av aktin på centrosome och hur den är uttömda på B-cellsaktivering (figur 3). För att definiera den centrosom område som används för att kvantifiera tillhörande Actin, vi mätt fluorescensintensitet av denna etikett i koncentriska cirklar kring centrosom. Radien definierades utifrån den punkt där minst 70% av etikettens fluorescensintensitet bibehålls (figur 3b). Med detta tillvägagångssätt kan man kvantifiera minskningen i aktin densitet vid centrosom på B cell aktiveringen, som visas i diagram 3c.
För att få större upplösning i distributionen av organeller vid is-gränssnittet, aktiverade vi B-celler på antigen-belagda täckglas, märkning Actin, den Golgi apparaten och endoplasmatiska nätmagen (figur 4a). Fördelningen av organeller på IS kan utföras genom att dyka Synaptic området i en central och perifera området, tillämpa ett kriterium som visas i figur 4b. Detta baserades på tidigare arbete som visar att bcrs samlas inom detta centrala område, vilket sannolikt motsvarar den centrala Supramolekylära aktiverings komplexet (csmac)10,19. Figur 4a visar att organeller som rekryterats till is, såsom den Golgi apparaten och endoplasmatiska nätmagen Visa motsatta fördelningar. Deras distributions index korrelerar i själva verket med deras immunofluorescensfärgning som visas i figur 4c. Den Golgi apparaten visar ett positivt värde, vilket innebär att den är koncentrerad i mitten av is medan endoplasmatiska nätmagen visar negativa värden, vilket innebär att det är främst lokaliserad i den perifera regionen av is. Dessutom är det möjligt att ta värdena i det synaptiska området som tidigare fastställts, för att mäta spridningsområdet under B-cellsaktivering, som det visas i figurerna 4D och 4e. Dessa resultat visar en ökning av spridningsområdet på B-cellsaktivering, som tidigare beskrivits10,20.
Som i pärlanalys, kan vi bestämma fördelningen av organeller mot immun synapsen genom att ta XZ bilder av B-celler aktiveras på antigen-belagda täckglas och mäta organell fluorescens över Z-dimensionen (figur 4F). Fluorescensintensiteten för aktin i Z-planet mättes, eftersom den representeras i XZ-planet i figur 4F, där en progressiv berikning av aktin vid det synaptiska gränssnittet (fraktioner 1 och 2) kan observeras (figur 4G).
Förutom B-cellbildningsanalys utförde vi isoleringen av centrosome-berikade fraktioner för att kvantifiera centrosome-associerade proteiner (figur 5a). Detta tillvägagångssätt kan vara viktigt att komplettera studiet av är bildandet i B-celler, med tanke på att centrosom polariserar till Synaptic membranet och har visat sig samordna Lysosomen människohandel inblandade i antigen utvinning och presentation21. Denna metod beskrevs tidigare med stora mängder celler (1 x 109 celler)17,18 men vi har standardiserat en förenklad version, som använder en reducerad mängd celler och kan utföras med lägre volym ultracentrifuge-rör (2-3 mL). Som vi visar i Figur 5b, analyserade vi olika cell fraktioner genom Immunoblotting och bestämde vilka som motsvarar centrosome-Rich fraktioner, av gamma tubulin färgning. Här visar vi ett exempel på proteiner som genomgår förändringar i deras ackumulering vid centrosome, såsom Actin och Arp2, som tidigare har rapporterats5.
Figur 1 : Polarization av organeller in mot är. A) immunofluorescenfärgning av Golgiapparaten (Rab6a) och mikrotubuli (α-tubulin) i IIa 1.6 B-celler som inkuberas med BCR-ligand + (0, 30, 60 och 120 min) eller BCR-ligand-pärlor (120 min). Pilspetsar indikerar centrosome. BF = ljust fält. Skalstapel = 3 μm. (B) schema som beskriver hur man beräknar polaritetsindexet för organeller (centrosome eller Golgi apparat) mot is. a = avståndet mellan cellens mitt (CC) till Organellen. b = avstånd från CC och till pärlcentrum (BC). (C, D) Representativa dot tomter visar polaritet index av organeller vid olika tidpunkter för aktivering. Varje punkt representerar en cell. E) immunofluorescenscfärgning av lysosomer (Lamp1) i B-celler som inkuberats med BCR-ligand + (0, 30, 60 och 120 min) eller BCR-ligand-pärlor (120 min). BF = ljust fält. Skalstapel = 3 μm. (F) system som representerar hur polaritetsindexet för lysosomer ska beräknas. a = avstånd mellan CC till Mass Center (MC). b = avstånd från CC till BC. G Representativa dot tomter visar polaritet index av lysosomer vid olika tidpunkter för aktivering. Varje punkt representerar en cell. 2-vägs ANOVA med Sidaks eftertest utfördes. Medel med SEM visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Ackumulering av lysosomer vid is. A) immunofluorescenscfärgning av lysosomer (Lamp1) i B-celler som inkuberas med BCR-ligand + (0, 30, 60 och 120 min) eller BCR-ligand-pärlor (120 min). BF = ljust fält. Skalbar = 3 μm. (B) system som skildrar hur man beräknar ansamling av organeller såsom lysosomer vid Pärlan och synaptiska området. Fluorescens i hela cellen (WCF), pärlfluorescens (BF) och Synaptic Area fluorescens (SAF) indikeras. (C, D) Representativa stapeldiagram för ackumulering av lysosomer vid pärla och synaptiska området. N = 1. 20 > celler. 2-vägs ANOVA med Sidaks eftertest utfördes. Medel med SEM visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kvantifiering av aktin på centrosom under är bildande. A) immunofluorescenfärgning av aktin (Phalloidin) och mikrotubuli (α-tubulin) i B-cellersominkuberas med BCR-ligand + (0 och 60 min) eller BCR-ligand-pärlor (0 och 60 min). Pilhuvuden indikerar centrosome. Skalstapel = 3 μm. (B) schema som beskriver hur man beräknar rekrytering eller utarmning av centrosome associerade komponenter. Den centrosom området beräknas med hjälp av en radie (X μm) som upprätthåller minst 70% av den maximala fluorescens. C) representativa punktdiagram som visar aktin vid centrosom under aktiverande (BCR-ligand +) och icke-aktiverande (BCR-ligand-) villkor. N = 1. 15 > celler. 2-vägs ANOVA med Sidaks eftertest utfördes. Medel med SEM visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Distribution av cellulära komponenter vid Synaptic Interface. (A) immunofluorescensinfärgning av aktin (Phalloidin), endoplasmatiska Retikulum (Sec61a), Golgi-apparat (transfected med en KDELR-DN-GFP en negativ dominerande ställning av kdel-receptorn, som lokaliserar i Golgi). B-celler var seedade på täckglas belagda med en BCR-ligand + för 60 min. BF = ljust fält. Skalstapel = 5 μm. (B) system som skildrar hur man bestämmer spridningsområdet av cellen och rekrytering av organeller i mitten av is. I schemat anger ca det cellområde som avgränsas av kortikal aktin och CCA indikerar centrum cellområdet. C) Golgi-apparat och endoplasmatisk NÄTDISTRIBUTION vid is, företrädd av ett stapeldiagram där ett värde > 0 indikerar en berikning i mitten av is och < 0 indikerar en perifer fördelning. N = 1. 20 > celler. Medel med SEM visas. D) representativa bilder av B-celler märkta för aktin (phalloidin) aktiverade på AG-belagda täckglas vid olika tidpunkter (0, 30 och 60 min), som visar XZ-och XY-planet. (E) diagram som visar spridningsområdet för B-celler i E. (F) system som beskriver hur man bestämmer fördelningen av signalen av intresse i Z-planet, och handlingen per z-fraktion. Rektangeln anger är-gränssnittet. Gdistribution av aktin över det Z-plan som representeras av en linje av den procentuella fluorescensfördelningen jämfört med varje z-fraktion. Rektangeln representerar IS-gränssnittet. N = 1. 25 > celler. Medel med SEM visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Centrosome berikade fraktioner av B-celler. A) arbetsflöde för hur man erhåller centrosome-berikade fraktioner av sackaros gradient ultracentrifugering. B) immunoblot fraktioner erhållna från vilande och aktiverade B-celler (60 min). Centrosome-Rich fraktioner detekteras genom märkning med γ-tubulin och indikeras inom streckad rektangel (fraktion 6 till 8). Centrosome tillhörande proteiner (Actin och Arp2) visas i centrosome-Rich fraktioner i att aktivera och vila villkorar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en omfattande metod för att studera hur B-lymfocyter omorganisera sin intracellulära arkitektur för att främja bildandet av en IS. Denna studie omfattar användning av avbildningstekniker för att kvantifiera den intracellulära fördelningen av organeller, såsom centrosome, Golgi apparat och lysosomer under B cell aktiveringen, och hur de polariserar till IS. Dessutom beskriver vi en biokemisk metod för att studera förändringar i centrosom komposition vid B-cellsaktivering.
För att främja bildandet av en is i B-celler, använde vi immobiliserade antigener (antigen-belagda pärlor) i stället för lösliga immun-komplex eftersom den förstnämnda utlöser inrättandet av en diskret kontakt plats där cytoskelettet rearrangemang och organell polarisation kan lätt studeras. En kritisk aspekt i Imaging B cell Activation är beredningen av proverna. Alla bild förvärv bör helst få en 1:1 cell: pärla förhållande, att kvantifiera polarisering av organeller till en unik plats för antigen kontakt. Men i vissa fall B-celler kan fånga två eller flera pärlor, vilket gör det svårt att välja en enda plats för antigen Encounter. För att undvika bildandet av pärlaggregat, är det viktigt att Vortex antigen-konjugerade pärlor noggrant innan du lägger dem till cellerna. För immunofluorescensexperiment rekommenderar vi dessutom att man utesluter från kvantifiering av celler som fångar mer än en pärla för att undvika feltolkningar vid bildanalys. Ett annat kritiskt steg i beredningen av prover är fixering/permeabilization skick. Till exempel, vi rekommenderar att fastställa celler med metanol för att optimera mikrotubule färgning och 4% PFA för phalloidin färgning. Vid samtidig märkning aktin cytoskelettet och microtubules, ett alternativ kan vara att märka aktin pool av transfecting celler med en lifeact-GFP/RFP uttryck plasmid i kombination med mikrotubuli färgning. Bild förvärv används för att kvantifiera polarisering av centrosome och andra intracellulära organeller kan utföras med ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop. För att få en korrekt kvantifiering vid olika z-flygplan, till exempel i spridnings analysen, krävs dock konfokalmikroskopi.
För den centrosom isolering protokoll som beskrivs här, ett kritiskt steg är att få en lämplig mängd prover för att kunna kvantifiera proteiner med immunoblot. Med tanke på att B-celler har en stor kärna och deras cytoplasma är mindre än 30% av deras totala cell volym, att få högre avkastning av cytoplasmiska proteiner kan vara utmanande. Av denna anledning rekommenderar vi att du använder cirka 20 x 106 B-celler för varje aktiveringstid för att centrosom isolering.
En betydande begränsning av dessa metoder är att aktivering med antigen-konjugerade pärlor inte omfattar komplexiteten i den miljö där ytbundna antigener presenteras för B-celler in vivo. Denna begränsning kan åtgärdas genom att komplettera kulturen eller pärlor med andra co-stimulerande faktorer, såsom cytokiner och komponenter i den extracellulära matrisen. Det är dock viktigt att använda lämpliga kontroller i dessa fall för att korrekt tolka resultaten.
Betydelsen av de metoder som presenteras i detta arbete förlitar sig på den integrerade metod som används för att studera B-cell immun synapsen: (1) polarisering av organeller och deras fördelning och (2) förändringarna i protein sammansättningen vid centrosome. På grund av det stora antalet celler som krävs för att utföra en signifikomlig analys och den stora mängden data som genereras i denna process, de olika kvantifieringsalgoritmerna som presenteras i detta arbete underlättar analysen av cell avbildning. Dessutom är de algoritmer som används för cellpolarisering lätt att automatiseras av makron funktioner i ImageJ, vilket är ett användbart verktyg för att minska repetitiva uppgifter och spara tid.
Dessa experimentella procedurer kan extrapoleras till andra typer av celler som upprättar polariserade fenotyper för att uppnå en viss cellulär funktion. Dessutom kan dessa protokoll optimeras genom att inkludera andra analyser, till exempel aktiviteten hos de associerade proteinerna såsom kinaser eller proteaser i Centrosome-berikade fraktioner. Sammantaget kan dessa studier ge mekanistisk inblick i cell signalering och molekylära vägar som reglerar inrättandet av cellpolaritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
M.-I.Y. stöds av ett forskningsanslag från FONDECYT #1180900. J.I., D.F. och J.L. stöddes av stipendier från Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Vi tackar David Osorio från Pontificia Universidad Católica de Chile för videoinspelning och redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
