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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

Published: June 1, 2019 doi: 10.3791/59621
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 1
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián
* These authors contributed equally

Summary

Qui descriviamo due approcci per caratterizzare gli eventi di polarizzazione cellulare nei linfociti B durante la formazione di un IS. Il primo, comporta la quantificazione del reclutamento di organelli e riarrangiamenti del citoscheletro nella membrana sinaptica. Il secondo è un approccio biochimico, per caratterizzare i cambiamenti nella composizione del centrosome, che subisce la polarizzazione alla sinapsi immunitaria.

Abstract

Il riconoscimento degli antigeni legati alla superficie da parte del recettore delle cellule B (BCR) innesca la formazione di una sinapsi immunitaria (IS), in cui sono coordinati sia la segnalazione che l'assorbimento dell'antigene. La formazione dell'IS comporta un rimodellamento dinamico dell'actina accompagnato dal reclutamento polarizzato nella membrana sinaptica degli organelli centrocellulari e intracellulari associati come i lisosomi e l'apparato di Golgi. Le fasi iniziali del rimodellamento dell'actin consentono alle cellule B di aumentare la superficie cellulare e massimizzare la quantità di complessi antigene-BCR raccolti alla sinapsi. In determinate condizioni, quando le cellule B riconoscono gli antigeni associati alle superfici rigide, questo processo è accoppiato al reclutamento locale e alla secrezione di lisosomi, che possono facilitare l'estrazione dell'antigene. Gli antigeni assorbiti vengono internalizzati in compartimenti endolsomici specializzati per la lavorazione in peptidi, che vengono caricati su molecole principali del complesso di istocompatibilità II (MHC-II) per un'ulteriore presentazione alle cellule che aiutano T. Pertanto, studiare le dinamiche di orgelli associate alla formazione di un IS è fondamentale per comprendere come vengono attivate le cellule B. Nel presente articolo discuteremo sia l'imaging che una tecnica biochimica utilizzata per studiare i cambiamenti nel posizionamento degli organelli intracellulari e nei riarrangiamenti del citoscheletro associati alla formazione di una IS nelle cellule B.

Introduction

I linfociti B sono una parte essenziale del sistema immunitario adattivo responsabile della produzione di anticorpi contro diverse minacce e dell'invasione degli agenti patogeni. L'efficienza della produzione di anticorpi è determinata dalla capacità delle cellule B di acquisire, elaborare e presentare antigeni incontrati in forma solubile o con tebranda superficiale1,2. Il riconoscimento degli antigeni attaccati alla superficie di una cellula di presentazione, da parte del BCR, porta alla formazione di uno stretto contatto intercellulare chiamato IS3,4. All'interno di questa piattaforma dinamica avviene sia la segnalazione a valle dipendente da BCR che l'internalizzazione degli antigeni in compartimenti endososomi. Gli antigeni assorbiti vengono elaborati e assemblati su molecole MHC-II e successivamente presentati ai linfociti T. Le interazioni B-T produttive, definite cooperazione cellulare B-T, permettono ai linfociti B di ricevere i segnali appropriati, che promuovono la loro differenziazione in plasmacellule o celle di memoria che producono anticorpi o cellule di memoria8.

Due meccanismi sono stati coinvolti nell'estrazione dell'antigene da parte delle cellule B. Il primo si basa sulla secrezione di proteasi provenienti da lisosomi che subiscono il reclutamento e la fusione presso la fessura sinaptica5,6. Il secondo, dipende da forze di trazione mediate Myosin IIA che innesca l'invaginazione dell'antigene contenente membrane che sono internalizzate in pozzi rivestiti di clathrin7 . La modalità di estrazione dell'antigene si basa sulle proprietà fisiche della membrana in cui si trovano gli antigeni. Tuttavia, in entrambi i casi, le cellule B subiscono due grandi eventi di rimodellamento: la riorganizzazione del citoscheletro actin e la polarizzazione degli organelli all'IS. Il rimodellamento del citoscheletro actina comporta una fase iniziale di diffusione, in cui le protrusioni dipendenti dall'actina nella membrana sinaptica aumentano la superficie a contatto con l'antigene. Segue una fase di contrazione, in cui le BCR accoppiate con gli antigeni sono concentrate al centro dell'IS dall'azione concertata dei motori molecolari e del rimodellamento del citoscheletro actina8,9,10, 11. La polarizzazione degli organelli si basa anche sulla ristrutturazione del citoscheletro actin. Ad esempio, il centrosore diventa disaccoppiato dal nucleo, dalla depolimerizzazione locale dell'actina associata,che consente il riposizionamento di questo organello all'IS 5,12. Nelle cellule B, il riposizionamento del centrosore a un polo cellulare (IS) guida il reclutamento di lisomi nella membrana sinaptica, che alla secrezione può facilitare l'estrazione e/o l'elaborazione di antigeni ad essere tesi dalla superficie6. I lisosomici reclutati all'IS sono arricchiti da MHC-II, che favorisce la formazione di complessi peptidi-MHC-II in compartimenti endosomici da presentare alle cellule T13. Inoltre, l'apparato di Golgi è stato osservato anche per essere reclutato da vicino all'IS14, suggerendo che le vesciche derivate da Golgi dal percorso secretoria potrebbero essere coinvolte nell'estrazione e/o nella lavorazione degli antigeni.

Complessivamente, i riarrangiamenti intracellulari di organelli e citoscheletri nelle cellule B durante la formazione di sinapsi sono i passi chiave che consentono un'efficiente acquisizione e elaborazione di antigeni necessari per la loro ulteriore attivazione. In questo lavoro introduciamo protocolli dettagliati su come eseguire l'imaging e l'analisi biochimica nelle cellule B per studiare il rimodellamento intracellulare degli organelli associati alla formazione di un IS. Queste tecniche includono: (i) Immunofluorescenza e analisi delle immagini delle cellule B attivate con perline rivestite di antigeni e su coverlips rivestiti di antigeni, che consente la visualizzazione e la quantificazione di componenti intracellulari mobilitati all'IS e (ii ) isolamento delle frazioni arricchite di centrosomi nelle cellule B mediante ultracentrifugazione su gradienti di saccarosio, che consente l'identificazione delle proteine associate al centroso, potenzialmente coinvolto nella regolazione della polarità cellulare.

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Protocol

NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando le celle IIA1.6 B.

1. Attivazione a cellule B con perline rivestite di antigene

  1. Preparazione di perline rivestite di antigene
    1. Per attivare le cellule B, utilizzare le perline NH2rivestite covalentmente con antigene (Ag-coated beads), che vengono preparate utilizzando antigeni 50 (20 x 106) di 3 perline NH2con antigeni di attivazione (BCR-ligand) o non attivanti (BCR-ligand-).
    2. Per IIA1.6 le cellule B utilizzano il frammento anti-IgG-F(ab')2 come BCR-ligand e anti-IgM-F(ab')2 o albumina di siero bovina (BSA) come BCR-ligand-. Per attivare le cellule B primarie o IgM- B linea cellulare utilizzare anti-IgM-F(ab')2 come BCR-ligand e BSA come BCR-ligand-.
      NOTA: Per evitare il legame dei ligandi al recettore Fc, utilizzare F(ab') o F(ab')2 frammenti di anticorpi invece di anticorpi a lunghezza intera.
    3. Per procedere con la preparazione di perline rivestite di Ag, posizionare le perline in tubi di microcentrifuga a basso legame proteico per massimizzare il recupero delle perline durante la manipolazione del campione. Aggiungere 1 mL di 1x salina tampone di fosfato (PBS) per lavare le perline e centrifugare a 16.000 x g per 5 min. Aspirate il supernatante.
    4. Risospendere le perline con 500 luna dell'8% di glutaraldeide per attivare i gruppi NH2 e ruotare per 4 h a temperatura ambiente (RT).
      AVVISO: La soluzione di stock di glutaraldeide dovrebbe essere utilizzata solo in una cappa di fumi chimici. Seguire le istruzioni riportate nella scheda dati sulla sicurezza dei materiali (MSDS).
    5. Centrifuga perline a 16.000 x g per 5 min, rimuovere la glutaraldeide e lavare le perline altre tre volte con 1 mL di 1x PBS.
      AVVISO: La soluzione della glutaraldeide dovrebbe essere scartata come rifiuto chimico pericoloso.
    6. Risospendere le perline attivate in 100 -L di 1x PBS. Il campione può essere suddiviso in due tubi di microcentrifuga a basso legame proteico: 50 -L per il BCR-ligando e 50 -L per BCR-ligand-.
    7. Per preparare la soluzione dell'antigene, utilizzare due tubi di microcentriera a basso legame proteico da 2 mL contenenti 100 g/mL di soluzione antigene in 150 -L di PBS: un tubo con BCR-ligando e altro con BCR-ligand-.
    8. Aggiungete 50 - L di perline attivate in ogni tubo contenente 150 gradi di soluzione antigene, vortice e ruotare durante la notte a 4 gradi centigradi.
    9. Aggiungete 500 L di 10 mg/mL di BSA per bloccare i restanti gruppi reattivi DiH2 sulle perline e ruotare per 1 h a 4 gradi centigradi.
    10. Centrifugare le perline a 16.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante. Lavare le perline con 1x PBS freddo altre tre volte.
    11. Risospendere le perline attivate in 70 -L di 1x PBS.
    12. Per determinare la concentrazione finale di perline rivestite di Ag, diluire un piccolo volume di perline in PBS (1:200) e contare utilizzando un emocitometro. Quindi conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
      NOTA: Le perline rivestite di Ag non devono essere conservate per più di 1 mese.
  2. Preparazione di coperture poli-L-lisine
    1. Prima del test di attivazione della cella B con perline rivestite di Ag, preparare i copricapi rivestiti in poli-L-lisina (PLL-coverslips). Utilizzare un tubo da 50 mL contenente 40 mL di 0,01% w/v della soluzione PLL e immergere i coperchi di 12 mm di diametro nella soluzione. Ruotare durante la notte a RT.
    2. Lavare i copricopertine con 1x PBS e lasciare asciugare su un coperchio a 24 pozze coperti di pellicola di paraffina. Procedere con l'attivazione della cella B.
  3. Attivazione delle celle B
    1. Per avviare l'attivazione delle cellule B con perline, diluire prima la linea cellulare IIA1.6 B a 1,5 x 106 celle/mL in CLICK media (RPMI-1640 integrato con 2 mM L-Alanine-L-Glutamine - 55 beta-mercaptoethanol - 1 pirava da 1 mM streptomicina) - siero bovino fetale inattivato dal calore [FBS]).
    2. Unire 100 l (150.000 cellule) di cellule IIA1.6 B con perline rivestite di Ag a 1:1 rapporto in tubi da 0,6 mL. Mescolare delicatamente utilizzando un vortice e un seme su PLL-coverslips. Incubare per diversi punti temporali in un'incubatrice di coltura cellulare (37 c / 5% di CO2). I punti temporali di attivazione tipici sono 0, 30, 60 e 120 min. Per il tempo 0, posizionare i copripla PLL nel coperchio della piastra 24-well sul ghiaccio. Aggiungere la miscela di perline rivestite di cellule-Ag e incubare per 5 min sul ghiaccio.
      NOTA: È importante mescolare per vortice invece di pipettare su e giù, perché questo potrebbe ridurre il numero di perline nel campione, a causa del loro accumulo nella punta di plastica della pipetta. Utilizzare perline rivestite con BCR-ligand- come controllo negativo per ogni saggio. Si consiglia di attivare prima il tempo di incubazione più lungo e poi i seguenti punti temporali. Calcolare gli intervalli di attivazione per i campioni in modo che siano pronti per la fissazione allo stesso tempo.
    3. Aggiungere 100 l of cold 1x PBS ad ogni coperchio per interrompere l'attivazione e continuare con il protocollo di immunofluorescenza. Vedere la sezione protocollo 3.

2. Attivazione di cellule B su copricapi rivestiti di antigene

  1. Preparazione di coperture rivestite di antigene
    1. Prima dell'attivazione, preparare la soluzione di antigene (1x PBS contenente 10 g/mL BCR-ligando e 0,5 ratti anti-topo CD45R/B220).
      NOTA: Si consiglia di preparare i coperchi il giorno prima del saggio. B220 migliora l'adesione delle cellule B, tuttavia, il BCR-Ligand è sufficiente a generare la risposta di diffusione.
    2. Posizionare il coperchio da 12 mm su un coperchio a piastre da 24 pozzetti ricoperto di pellicola di paraffina, aggiungere 40 gradi di soluzione antigene su ciascun coperchio e incubare a 4 gradi durante la notte. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione della soluzione dell'antigene.
    3. Lavare i copricopro con 1x PBS e aria asciutta.
  2. Attivazione delle celle B
    1. Per avviare l'attivazione, diluire le celle IIA1.6 B a 1,5 x 106 celle/mL nel mezzo CLICK : 5% FBS.
    2. Aggiungete 100 celle su un coperchio rivestito di antigene (Ag-coverslip) e attivate per diversi punti temporali in un'incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi / 5% di CO2. I punti temporali di attivazione tipici sono 0, 30 e 60 min.
      NOTA: Come nella sezione 1, si consiglia di iniziare con il punto temporale di attivazione più lungo per correggere tutti i campioni contemporaneamente.
    3. Per il tempo 0, posizionare il coperchio della piastra 24-well contenente l'Ag-coverslip sul ghiaccio e aggiungere le cellule. Incubare per 5 min sul ghiaccio.
    4. Aspirare con attenzione il supporto su ogni Ag-coverslip e quindi aggiungere 100 l'l di freddo 1x PBS per fermare l'attivazione. Continuare con il protocollo di immunofluorescenza. Vedere la sezione 3.

3. Immunofluorescenza

NOTA: Per evitare la reattività incrociata dell'anticorpo secondario con il BCR delle cellule IIA 1.6 B, non utilizzare anticorpi primari derivati dal topo.

  1. Rimuovere il 1x PBS e procedere con la fissazione di ogni coverslip.
    NOTA: Per decidere quale supporto di fissaggio utilizzare, controllare il foglio dati anticorpo/tintura. Ad esempio, per l'etichettatura actina da phalloidin use paraformaldedede (PFA) supporto di fissazione, e per l'etichettatura centroso per fissazione di metanolo pericentrino.
    1. Aggiungere 50 - L di 1x PBS integrato con 4% PFA e incubare per 10 min a RT.
      AVVISO: La formaldeide è tossica. Si prega di leggere l'MSDS prima di lavorare con questa sostanza chimica. Le soluzioni PFA devono essere realizzate solo sotto una cofatura con fumi chimici che indossa guanti e occhiali di sicurezza. La soluzione PFA dovrebbe essere scartata come rifiuto chimico pericoloso.
    2. In alternativa, aggiungere 50 l di metanolo freddo e incubare per 20 min.
  2. Lavare tre volte con 1x PBS.
    NOTA: i coverlips possono essere conservati a 4 gradi centigradi a questo punto per un massimo di tre giorni in 1 x PBS.
  3. Rimuovere 1x PBS e aggiungere 50 - L di buffer di blocco (2% BSA - 0,3 M glicina in 1x PBS) su ogni coverslip. Incubare a RT per 10 min.
  4. Aspirate delicatamente e aggiungere 50 L di buffer di permeabilizzazione (PB) (0,2% BSA - 0,05% di saponina in 1x PBS). Incubare a RT per 20 min.
  5. Preparare gli anticorpi o i coloranti in PB (usare 30 L per coverslip) e incubare a RT per 1 h o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per ulteriori dettagli.
    1. Per etichettare il centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC) o il centrosori, utilizzare i seguenti anticorpi: anti-Tubulina (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-tubulina (1:500), anti-pericentrina (1:1000).
      NOTA: Per l'etichettatura centroso le cellule B possono essere trascate con un plasmide di espressione centrina-GFP.
    2. Per l'etichettatura Golgi apparatus utilizzare anti-Rab6a (1:500).
      NOTA: Possono essere utilizzati anche altri anticorpi o coloranti.
    3. Per l'etichettatura dei lisosomi, utilizzare anti-Lamp1 (1:200).
      NOTA: possono essere utilizzati anche anti-H2-DM e anti-MHC-II per etichettare i compartimenti di elaborazione dell'antigene15,16.
    4. Per l'etichettatura dell'endolasmico reticulum utilizzare anti-Sec61a (1:500).
    5. Per l'actina citoscheletro considerare quanto segue: actina polimerizzata può essere visualizzata da Phalloidin coniugata a coloranti fluorescenti.
      NOTA: le cellule B trascate da un plasmid di espressione LifeAct-GFP/RFP possono essere utilizzate anche per etichettare actin.
  6. Lavare i coperchi tre volte con PBS.
  7. Diluire l'anticorpo secondario o i coloranti in PBS (utilizzare 30 - L per coverslip) e incubare 1 h a RT.
    NOTA: Evitare di esporre i campioni alla luce diretta per preservare la qualità del segnale di fluorescenza.
  8. Lavare i coperchi tre volte con PBS.
  9. Rimuovere la soluzione PBS dai copricoperture.
  10. Aggiungere 4 -L di reagente di montaggio in un vetrino del microscopio. Montare la coverslip sulla diapositiva con il lato cella rivolto verso il basso. Lasciare asciugare i vetrini per 30 min a 37 o durante la notte.
    NOTA: è consigliabile utilizzare un reagente di montaggio "anti-dissolvenza" (vedere la tabella dei materiali).
  11. Acquisire immagini di fluorescenza su un microscopio confocale o epifluorescenza con un obiettivo di immersione ad olio 60x o 100x. Per ogni acquisizione considerare la luce trasmessa o campo luminoso per identificare facilmente le cellule B che interagiscono con le perline.
    NOTA: Prendi immagini tridimensionali (3D), che coprono l'intera cella utilizzando z-stack. Si consiglia di prendere 0,5 m di spessore, tuttavia questo dipende dal microscopio.

4. Analisi dell'immagine

NOTA: per il software ImageJ vengono descritti i seguenti algoritmi. Tuttavia, questo può essere eseguito utilizzando un software equivalente. Inoltre, si consideri che per tutte le misurazioni di intensità di fluorescenza usiamo la densità di fluorescenza integrata ("RawIntDen" in ImageJ), perché questo parametro considera la quantità totale di fluorescenza in ogni pixel dell'immagine, tenendo conto dell'area.

  1. Analisi della distribuzione degli organelli nelle cellule B attivate con perline rivestite con Ag
    NOTA: Per quantificare la polarizzazione dei componenti cellulari all'IS, definiamo un valore arbitrario come misura di prossimità all'IS. L'indice varia tra -1 (antipolarizzato) e 1 (completamente polarizzato, oggetto sul tallone), come è stato precedentemente presentato da Reversat et al.12 mila.
    1. Stimare l'indice di polarità per l'apparato centrosome e Golgi (Figura 1B).
      NOTA: questo algoritmo può essere utilizzato per gli organelli che sono limitati a un punto.
      1. Definire innanzitutto le aree del tallone e delle celle da analizzare utilizzando la selezione dello strumento cerchio per delimitare i confini di entrambi e quindi salvarli come aree di interesse (ROI). Vedere Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4.
      2. Determinare il centro della cella (CC) e il centro del tallone (BC) eseguendo Analizza . Misurare rispettivamente sulle aree delle celle e dei talloni. I valori X e Y ottenuti dalla finestra Risultati determinano le coordinate centrali.
      3. Determinare manualmente il centro dell'apparato centroso o Golgi (Organelle) utilizzando la selezione dello strumento punto in ImageJ ed eseguire Analizza Misurare. I valori X e Y ottenuti dalla finestra Risultati determinano le coordinate.
      4. Quindi, disegnate un angolo da CC a Organelle (a) e da CC a BC (b) utilizzando la selezione dello strumento Angolo ed eseguite Analizza Misurare. Il valore dell'angolo nella finestra dei risultati mostra l'angolo ()tra entrambi i vettori (a e b).
      5. Calcolare l'indice di polarità utilizzando la seguente formula:
        Equation 1
    2. Stimare l'indice di polarità per i lisosomi (Figura 1F).
      NOTA: utilizziamo questo algoritmo per analizzare la polarità degli organelli che mostrano una distribuzione più dispersa, come i lisosomi.
      1. Definire le aree del tallone e delle celle da analizzare, utilizzando la selezione dello strumento cerchio per delimitare i limiti di entrambi e salvarli come ROI. Una volta che le aree del tallone e delle cellule sono state determinate, impostare il canale di fluorescenza e proiettare l'immagine in una z-stack (Immagine Proprietà Stacks . -Project [Somma sezioni]), quindi eseguire Analizza Misurare ed estrarre le coordinate del centro di massa (MC) (MX e MY) dalle finestre dei risultati.
      2. Applicare lo stesso algoritmo menzionato prima di cambiare Organelle per MC. Di conseguenza, l'angolo ()è definito da CC-MC (a) e CC-BC (b).
      3. Calcolare la polarità utilizzando la seguente formula:
        Equation 2
    3. Stimare il reclutamento lisososo sobbelper l'area sinaptica (Figura 2B).
      NOTA: questo algoritmo viene utilizzato per quantificare un organello adiacente all'IS.
      1. Una volta determinate le aree del tallone e della cella, determinare l'angolo del vettore tra IL CC e il BC e quindi ruotare l'immagine per ottenere un angolo di 0 gradi.
      2. Impostare il canale fluorescente e proiettare l'immagine in una serie z(Immagine Proprietà Stacks . - Progetto [Somma sezioni]), eliminare tutta la fluorescenza che non rientra nella cella e nell'area del tallone insieme (esegui modifica e chiara all'esterno in ImageJ).
      3. Utilizzando la selezione dello strumento rettangolo, disegnate un rettangolo adiacente al tallone e misurate la fluorescenza dell'area sinaptica (SAF). Questo rettangolo è un quarto della larghezza della cella.
      4. Selezionare l'intera immagine ed eseguire Analizza Misurare per ottenere la fluorescenza dell'intera cella (WCF).
      5. Calcolare la percentuale di fluorescenza dell'organelle adiacente all'IS utilizzando la seguente formula:
        Equation 4
    4. Quantificare il reclutamento di componenti cellulari nel centrosome.
      NOTA: Questo algoritmo, adattato da Obino et al.5, viene utilizzato per quantificare l'arricchimento di organelli nell'area centrosorata. In breve, consideriamo l'area centrosoica come il dominio in cui la fluorescenza dell'orgelli associata al centroso rimane costante o superiore al 70% nella trama fluorescenza/raggio. È essenziale impostare questo parametro in condizioni di riposo perché questo raggio potrebbe cambiare al momento dell'attivazione.
      1. Una volta determinate le aree di perline e le celle, definire la localizzazione del centrosome utilizzando la selezione dello strumento punto ( Figura3B).
      2. In primo luogo, determinare l'area massima intorno al centrosome che è possibile quantificare, disegnando un cerchio di 3 m-radius che circonda il centrosome.
      3. Utilizzare il plugin ImageJ Profilo radiale, che misura la fluorescenza nei cerchi concentrici e visualizza un grafico a fluorescenza/raggio.
      4. Identificare il raggio massimo entro il quale viene mantenuta almeno il 70% dell'intensità della fluorescenza.
      5. Calcolare il rapporto di densità di fluorescenza utilizzando la seguente formula:
        Equation 5=Equation 6
        NOTA: Il rapporto di densità di fluorescenza indica la concentrazione di un organello al centrosore rispetto alla sua distribuzione in tutta la cellula.
  2. Analisi della diffusione cellulare e distribuzione degli organelli nelle cellule B attivate su Ag-coverslips
    1. Stimare la distribuzione di organelle all'IS (Figura 4B).
      NOTA: Questo algoritmo consente la quantificazione della distribuzione XY degli organelli e la loro concentrazione al centro dell'IS. Definiamo un rapporto di densità di fluorescenza tra l'area centrale e l'area sinaptica totale. I valori ottenuti possono variare da negativo a positivo, indicando rispettivamente una periferica o una distribuzione centrale dell'organello.
      1. Determinare la sezione in cui la cella è in contatto con il coperchio.
        NOTA: Per delimitare i confini cellulari si può etichettare la membrana plasmatica o actin che è arricchita nella periferia dell'IS.
      2. Modificare il tipo della sezione a 8 bit, quindi binario (Processo Proprietà Binary . Make Binary) e collegare i punti esterni più vicini Process Proprietà Binary . aspetti mpl generali. Delimitare i limiti dell'area della cella (CA) utilizzando la selezione dello strumento poligono.
        NOTA: questo passaggio è utile per aumentare il contrasto dei contorni delle celle e semplificarne l'identificazione. Inoltre, a questo punto, è possibile applicare il plugin Analizza particelle di ImageJ per determinare automaticamente la CA. Tuttavia, altre celle nello stesso campo possono interferire con i risultati.
      3. Prendere i parametri CA (altezza e larghezza) e delimitare un'area arrotondata centrale, separata dai contorni da un quarto dei valori di altezza e larghezza, considerare quest'area come l'area del centro della cella (CCA).
      4. Calcolare la distribuzione della densità di fluorescenza al centro dell'IS utilizzando la seguente formula:
        Equation 7
    2. Misurare la distribuzione dell'organanei nei piani di z (Figura 4C).
      NOTA: Questa analisi determina la distribuzione generale della fluorescenza dell'orgelli attraverso i piani delle cellule B attivate su ag-coverslips, mostrando la percentuale di fluorescenza per frazione z.
      1. Per quantificare la distribuzione della fluorescenza in , determinare innanzitutto il piano dell'IS in cui la cella è in contatto con l'Ag-coverslip e quindi il piano corrispondente al limite superiore della cella.
      2. Disegnare una linea al centro della cella.
      3. Reslice l'immagine in : (Immagine) Proprietà Stacks . Reslice), per ottenere un'immagine X.
      4. Misurare l'altezza e dividere l'immagine x in 10 rettangoli consecutivi della stessa altezza (frazione z) dal basso (interfaccia IS) verso l'alto (lato superiore della cella) e quantificare il segnale di fluorescenza in ciascuno di essi.
      5. Normalizzare l'intensità di fluorescenza di ogni frazione z per la somma della fluorescenza totale delle 10 frazioni.
      6. Tracciare la percentuale di intensità di fluorescenza per frazione di cella.

5. Isolamento della frazione arricchita centroso dalle cellule B attive e di riposo

NOTA: Durante l'esperimento, tenere tutte le soluzioni a 4 gradi centigradi per evitare la degradazione delle proteine. Questo protocollo è stato adattato dal lavoro precedente17,18.

  1. Attiva 2 x 107 celle B con perline rivestite di Ag in 2 mL di media CLICK : FBS inattivato dal calore del 2% (rapporto 1:1). Considerare le cellule B non attivate come celle B a riposo.
  2. Aggiungete la citochalasina D (2 m) e la nocodazolo (0,2 m) e incubate per 1 h a 37 gradi centigradi.
    NOTA: Questi farmaci sono utilizzati per staccare delicatamente il centrosore dal nucleo, depolinizzando il citoscheletro e i microtubuli, rispettivamente, per evitare la contaminazione nucleare.
  3. Lavare ogni campione con 5 mL di 11 TBS freddo (50 mM MM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) e poi con 1 mL di 0,1x TBS integrato con 8% di saccarosio.
  4. Risospendere le cellule con 150 % di buffer di lisi centroso (1 mM HEPES, pH 7.2, 0,5% NP-40, 0,5 mM MgCl2, 0,1% beta-Mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) o cocktail inibitore proteassi) e pipetate verso il basso fino alla vicosità diminuisce, che indica che la lisi delle cellule è identificata nel campione. Mettere il campione in un tubo da 1,5 mL.
  5. Centrifuga a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, per separare gli organelli dal nucleo.
  6. Recuperare con attenzione il supernatante e posizionarlo sopra un tubo da 1,5 mL con 300 l of gradient buffer (GB) (10 mM PIPES pH 7.2, 0.1% Triton X-100, 0.1% beta-mercaptoethanolo) contenente il 60% di saccarosio.
  7. Centrifuga a 10.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi per concentrare i centrisomi nella frazione di saccarosio 60%.
  8. Nel frattempo, preparate un gradiente discontinuo in tubi di ultracentrifuga da 2 mL sovrapponendo 450 - L di GB , 70% di saccarosio con 270 , l'l di GB, 50% di saccarosio e poi 270 l undisa ( 40% di saccarosio).
  9. Dopo la prima centrifugazione (frazione centro-concentrata), scartare la frazione superiore (porzione meno densa) fino a raggiungere l'interfaccia e vortice il campione rimanente nel tubo. Quindi, sovrapponi sopra il gradiente discontinuo precedentemente preparato con il campione arricchito per il centrosome.
    NOTA: Fare attenzione a non interrompere il gradiente, tutte le procedure di pipettaggio devono essere eseguite con attenzione.
  10. Centrifuga a 40.000 x g per 1 h a 4 gradi centigradi con un'accelerazione minima e con il freno centrifuga impostato, per evitare di interrompere la pendenza.
  11. Raccogliere 12 frazioni di 100 gradi in tubi separati a partire dall'alto.
  12. Identificare le frazioni arricchite centrosome con immunoblot usando la z-tubulina come marcatore centroso.
    NOTA: Di solito troviamo estratti arricchiti di centrosome tra le frazioni 6 e 8.

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Representative Results

Il presente articolo mostra come le cellule B possono essere attivate utilizzando antigene immobilizzato su perline o coverlips per indurre la formazione di un IS. Forniamo informazioni su come identificare e quantificare la polarizzazione di diversi organelli mediante immunofluorescenza e come caratterizzare le proteine che subiscono cambiamenti dinamici nella loro associazione al centrosome, che si polarizza all'IS, approccio biochimico.

L'imaging delle cellule B mediante immunofluorescenza ci permette di seguire le dinamiche di organelli come il centrosore, l'apparato Golgi e i lisosomi, che vengono reclutati nell'IS dopo l'attivazione cellulare B. Si possono ottenere parametri quantitativi per misurare la polarizzazione di questi organelli all'IS e confrontarli in condizioni diverse. Come si esagera in Figura 1A, il Centrosome e Golgi Apparatus vengono reclutati all'IS su attivazione cellulare B. Il reclutamento non è stato osservato nelle cellule B stimolate con BCR-ligand, il che indica che l'impegno di BCR è necessario per mobilitare l'apparato centroso e Golgi all'IS (Figura 1A). Per ottenere un indice di polarità per ogni organello, come misura della sua vicinanza all'IS, abbiamo considerato tre caratteristiche: la distanza tra l'organello e il centro della cella, la distanza tra il centro del tallone e il centro della cella, e l'angolo tra questi due vettori (Figura 1B). Questo indice varia tra -1 (antipolarizzato) e 1 (completamente polarizzato, oggetto sul tallone). Figura 1C e 1D mostrano grafici in cui gli indici di polarità di ogni organelle vengono tracciati rispetto al tempo di attivazione. In accordo con la colorazione immunofluorescenza, sia l'apparato centroso che quello di Golgi, mostrano indici di polarità più positivi su punti di attivazione più lunghi, riflettendo il modo in cui vengono reclutati progressivamente nell'IS. Questo algoritmo è applicabile per gli organelli confinati a un punto.

Inoltre, abbiamo quantificato la polarizzazione degli organelli che visualizzano una distribuzione dispersa, come i lisosomi (Figura 1E), applicando lo stesso algoritmo menzionato in precedenza, ma modificando la coordinata del punto in base alle coordinate del centro massa di lisosomi (Figura 1F). Possiamo osservare che gli indici di polarità delle piscine lisosomiche raggiungono valori più positivi al momento dell'attivazione, il che indica che i lisosomi vengono mobilitati verso la sinapsi sull'attivazione delle cellule B (Figura 1G).

Abbiamo anche definito due algoritmi per determinare gli organelli che sono in contatto con l'interfaccia sinaptica (perline) e la quantità di organelli in prossimità della sinapsi, ma non necessariamente in contatto. Come si esprimo in Figura 2, abbiamo quantificato lisosomi contattando l'interfaccia sinaptica (Figura 2A), dividendo il segnale LAMP-1 nell'area del tallone per la fluorescenza totale nella cella più il tallone (Figura 2B). È importante considerare che il diametro dell'area del tallone determina le gamme delle percentuali ottenute. Ad esempio, nella quantificazione visualizzata (Figura 2B), disegniamo un cerchio con un diametro di 3 m per misurare la fluorescenza sul tallone, che è un parametro restrittivo considerando la dimensione del tallone (3 m). Utilizzando questo parametro, i risultati mostrano che i lisosomi vengono reclutati progressivamente nell'interfaccia sinaptica al momento dell'attivazione della cella B, raggiungendo il 10-15% della massa totale (Figura 2C). Un altro approccio mostrato è la quantificazione dei lisosomi nell'area sinaptica. La figura 2D mostra che i lisosomi accumulano progressivamente fino al 25% dei loro lisosomi all'IS. Nel complesso, eseguendo entrambi i tipi di analisi si può valutare la polarizzazione e l'attracco degli organelli all'IS.

Durante l'attivazione delle cellule B, sono state documentate modifiche nel pool di proteine associate al centrosore5. Per esempio, una di queste proteine che cambia la loro associazione al Centrosome durante l'attivazione della cellula B è l'actin. In questo caso l'actina si esaurisce all'interno di questa regione, che permette al centrosore di staccarsi dal nucleo, promuovendone la polarizzazione all'IS5. Qui presentiamo la quantificazione dell'actina al Centrosome e come si esaurisce dopo l'attivazione della cellula B (Figura 3). Per definire l'area centrosomiana utilizzata per quantificare l'actina associata, abbiamo misurato l'intensità di fluorescenza di questa etichetta in cerchi concentrici che circondano il centrosome. Il raggio è stato definito in base al punto in cui viene mantenuta almeno il 70% dell'intensità di fluorescenza dell'etichetta (Figura 3B). Utilizzando questo approccio si può quantificare la diminuzione della densità di actina al centrosome dopo l'attivazione della cellula B, come mostrato nella Figura 3C.

Per ottenere una maggiore risoluzione nella distribuzione degli organelli all'interfaccia IS, abbiamo attivato le cellule B sui copricapi rivestiti di antigene, etichettando actin, l'apparato Golgi e il reticolo endoplasmico (Figura 4A). La distribuzione degli organelli all'IS può essere effettuata immergendo l'area sinaptica in un'area centrale e periferica, applicando un criterio illustrato nella Figura 4B. Questo si basava su lavori precedenti che mostravano che le BCR si riuniscono all'interno di questa area centrale, che molto probabilmente corrisponde al complesso centrale di attivazione sopramolecolare (cSMAC)10,19. La figura 4A mostra che gli organelli reclutati nell'IS, come l'apparato di Golgi e il reticolo endolasmico mostrano distribuzioni opposte. Infatti, i loro indici di distribuzione sono correlati con la colorazione dell'immunofluorescenza illustrata nella Figura 4C. L'apparato Golgi mostra un valore positivo, il che significa che è concentrato al centro dell'IS, mentre il reticolo endolosmico mostra valori negativi, il che significa che è localizzato principalmente nella regione periferica dell'IS. Inoltre, è possibile prendere i valori dell'area sinaptica precedentemente determinata, per misurare l'area di diffusione durante l'attivazione della cella B, come mostrato nelle figure 4D e 4E. Questi risultati mostrano un aumento dell'area di diffusione all'attivazione della cella B, come descritto in precedenza10,20.

Come nel saggio di perline, possiamo determinare la distribuzione di organelli verso la sinapsi immunitaria prendendo le immagini X , di cellule B attivate su coverlips rivestiti di antigene e misurando la fluorescenza dell'organello attraverso la dimensione di z (Figura 4F). È stata misurata l'intensità di fluorescenza dell'actina nel piano di z, in quanto è rappresentata nel piano X , in Figura 4F, dove è possibile osservare un progressivo arricchimento dell'actin nell'interfaccia sinaptica (frazioni 1 e 2) (Figura 4G).

Oltre all'analisi dell'imaging delle cellule B, abbiamo eseguito l'isolamento delle frazioni arricchite di centrosoper per quantificare le proteine associate al centrosore (Figura 5A). Questo approccio può essere importante per completare lo studio della formazione is nelle cellule B, dato che il centrosizza alla membrana sinaptica e ha dimostrato di coordinare il traffico lisosomico coinvolto nell'estrazione dell'antigene e nella presentazione21. Questo metodo è stato descritto in precedenza utilizzando grandi quantità di celle (1 x 109 celle)17,18 ma abbiamo standardizzato una versione semplificata, che utilizza una quantità ridotta di celle e può essere eseguita utilizzando un volume inferiore tubi ultracentrici (2-3 mL). Come si mostra nella Figura 5B, abbiamo analizzato diverse frazioni cellulari per immunoblotting e determinato quali corrispondono a frazioni ricche di centroso, per colorazione di tubulina gamma. Qui mostriamo un esempio di proteine che subiscono cambiamenti nel loro accumulo al centrosome, come Actin e Arp2, che sono stati precedentemente segnalati5.

Figure 1
Figura 1 : Polarizzazione degli organelli verso l'IS. (A) Colorazione immunofluorescenza dell'apparato di Golgi (Rab6a) e dei microtubuli (z-tubulina) nelle cellule IIA1.6 B incubate con BCR-ligand, (0, 30, 60 e 120 min) o perline BCR-ligand-bele (120 min). Le punte delle frecce indicano il centropo. BF - Campo luminoso. Barra di scala (B) Schema che illustra come calcolare l'indice di polarità degli organelli (apparato centrale o Golgi) verso l'IS. a : distanza tra il centro della cella (CC) e l'organello. b - Distanza dal CC e al centro del tallone (BC). (C, D) Grafici a punti rappresentativi che mostrano indici di polarità di organelli in diversi punti temporali di attivazione. Ogni punto rappresenta una cella. (E) Colorazione immunofluorescenza di Lysosomes (Lamp1) in cellule B incubate con BCR-ligand, (0, 30, 60 e 120 min) o perline BCR-ligand-ligand-(120 min). BF - Campo luminoso. Barra di scala - 3 m. (F)Schema che rappresenta come calcolare l'indice di polarità di Lysososomes. a Distanza tra CC e centro massa (MC). b - Distanza da CC a BC. (G) Per quanto mi ribasso, la Grafici a punti rappresentativi che mostrano indici di polarità di lisosomi in diversi punti temporali di attivazione. Ogni punto rappresenta una cella. ANOVA a 2 vie con post-test di Sidak è stato eseguito. Vengono visualizzati i mezzi con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Accumulo di lisosomi all'IS. (A) Colorazione immunofluorescenza dei lisosomi (Lamp1) in cellule B incubate con BCR-ligand, (0, 30, 60 e 120 min) o perle BCR-ligand (120 min). BF - campo luminoso. Barra di scala (B) Schema che illustra come calcolare l'accumulo di organelli come i lisosomi al tallone e l'area sinaptica. Sono indicate la fluorescenza dell'intera cella (WCF), la fluorescenza del tallone (BF) e la fluorescenza dell'area sinaptica (SAF). (C, D) Grafici a barre rappresentativi per l'accumulo di lisosomi al tallone e all'area sinaptica. N - 1 . 20 > Celle. ANOVA a 2 vie con post-test di Sidak è stato eseguito. Vengono visualizzati i mezzi con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Quantificazione dell'atto in corrispondenza del centrosodurante la formazione dell'IS. (A) Colorazione immunofluorescenza di actina (Phalloidin) e microtubuli (z-Tubulin) nelle cellule B incubate con BCR-ligand, (0 e 60 min) o perline BCR-ligand-(0 e 60 min). Le teste di freccia indicano il centrosome. Barra di scala - 3 xm. (B) Schema che illustra come calcolare il reclutamento o l'esaurimento dei componenti associati Centrosome. L'area centrosoica viene calcolata utilizzando un raggio (X) che mantiene almeno il 70% della fluorescenza massima. (C) Grafici a punti rappresentativi che mostrano l'atto al centrosome in base alle condizioni di attivazione (BCR-ligand) e non attivante (BCR-ligand-). N - 1 . 15 > Celle. ANOVA a 2 vie con post-test di Sidak è stato eseguito. Vengono visualizzati i mezzi con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Distribuzione di componenti cellulari nell'interfaccia sinaptica. (A) Immunofluorescenza colorazione di actin (Phalloidin), Endoplasmic Reticulum (Sec61a), apparato Golgi (trasvenuto con un KDELR-DN-GFP un dominante negativo del recettore KDEL, che localizza nel Golgi). Le cellule B sono state seminate su copritrici rivestite con un BCR-ligando per 60 min. Barra di scala - Schema di 5 m. (B) che illustra come determinare l'area di diffusione della cella e il reclutamento di organelli al centro dell'IS. Nello schema, CA indica l'area della cella delimitata da actin corticale e CCA indica l'area della cella centrale. (C) La distribuzione del reticolo golgi apparato e dell'endoplasmico all'IS, rappresentata da un grafico a barre in cui un valore >0 indica un arricchimento al centro dell'IS e < 0 indica una distribuzione periferica. N - 1 . 20 > Celle. Vengono visualizzati i mezzi con SEM. (D) Immagini rappresentative delle cellule B etichettate per actin (Phalloidin) attivate sui coperchi rivestiti di Ag in diversi momenti (0, 30 e 60 min), che mostrano il piano X e XY. (E) Grafico che mostra l'area di diffusione delle cellule B nello schema E. (F) che illustra come determinare la distribuzione del segnale di interesse nel piano di z e il grafico per frazione. Il rettangolo indica l'interfaccia IS. (G) Distribuzione dell'actina attraverso il piano z rappresentato da un grafico di linea della percentuale di distribuzione della fluorescenza rispetto a ciascuna frazione. Il rettangolo rappresenta l'interfaccia IS. N - 1 . 25 > Celle. Vengono visualizzati i mezzi con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Frazioni arricchite centroso delle cellule B. (A) Flusso di lavoro su come ottenere frazioni arricchite per surtorcosi ostinazione ultracentrizione. (B) Immunoblot di frazioni ottenute da cellule B attivate e attivate (60 min). Le frazioni ricche di centrososi vengono rilevate etichettando con la z-tubulina e sono indicate all'interno del rettangolo tratteggiato (frazione da 6 a 8). Le proteine associate al centrosome (Actin e Arp2) sono mostrate in frazioni ricche di centrososi nelle condizioni di attivazione e di riposo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Descriviamo un metodo completo per studiare come i linfociti B riorganizzano la loro architettura intracellulare per promuovere la formazione di un IS. Questo studio include l'uso di tecniche di imaging per quantificare la distribuzione intracellulare di organelli, come centrosome, apparato di Golgi e lisosomi durante l'attivazione della cellula B, e come si polarizzano all'IS. Inoltre, descriviamo un approccio biochimico allo studio dei cambiamenti nella composizione centrosoria dopo l'attivazione delle cellule B.

Per promuovere la formazione di un IS nelle cellule B, abbiamo usato antigeni immobilizzati (perline rivestite di antigeni) invece di complessi immunitari solubili perché il primo innesca la creazione di un sito di contatto discreto dove riarrangia citoscheletri e orgamici la polarizzazione può essere facilmente studiata. Un aspetto critico nell'imaging dell'attivazione delle cellule B è la preparazione dei campioni. Tutte le acquisizioni di immagini dovrebbero idealmente ottenere un rapporto 1:1 cella : perline, per quantificare la polarizzazione di organelli in un sito unico di contatto con l'antigene. Tuttavia, in alcuni casi le cellule B possono catturare due o più perline, rendendo così difficile scegliere un singolo sito di incontro di antigene. Per evitare la formazione di aggregati di perline, è importante vortice a fondo perline coniugate con antigene prima di aggiungerle alle cellule. Inoltre, per gli esperimenti di immunofluorescenza, si consiglia di escludere dalle cellule di quantificazione che catturano più di un tallone, al fine di evitare interpretazioni errate durante l'analisi delle immagini. Un altro passaggio critico nella preparazione dei campioni è la condizione di fissazione/permeabilizzazione. Per esempio, si consiglia di fissare le cellule con metanolo per ottimizzare la colorazione dei microtubuli e il 4% di PFA per la colorazione di phalloidin. Quando si etichettano contemporaneamente citoscheletro e microtubuli actin, un'alternativa può essere quella di etichettare il pool di actine traducendo le cellule con un plasmid di espressione LifeAct-GFP/RFP in combinazione con la colorazione dei microtubuli. L'acquisizione di immagini utilizzate per quantificare la polarizzazione del Centrosome e di altri organelli intracellulari può essere eseguita con un microscopio a epifluorescenza. Tuttavia, per ottenere una quantificazione accurata su diversi piani z, ad esempio nel test di diffusione, è necessaria la microscopia confocale.

Per il protocollo di isolamento centroso descritto qui, una fase critica è ottenere una quantità appropriata di campioni per essere in grado di quantificare le proteine per immunoblot. Dato che le cellule B hanno un grande nucleo e il loro citoplasma è inferiore al 30% del loro volume totale di cellule, ottenere rese più elevate di proteine citoplasmiche può essere difficile. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare circa 20 x 106 cellule B per ogni punto di tempo di attivazione per l'isolamento centrosome.

Una limitazione significativa di questi metodi è che l'attivazione con perline coniugate con antigene non include la complessità dell'ambiente in cui gli antigeni legati alla superficie vengono presentati alle cellule B in vivo. Questa limitazione può essere affrontata integrando la coltura o perline con altri fattori co-stimolanti, come citochine e componenti della matrice extracellulare. Tuttavia, è fondamentale utilizzare i controlli appropriati in questi casi per interpretare correttamente i risultati.

L'importanza dei metodi presentati in questo lavoro si basa sull'approccio integrato utilizzato per studiare la sinapsi immunitaria delle cellule B: (1) la polarizzazione degli organelli e la loro distribuzione e (2) i cambiamenti nella composizione delle proteine al centrosome. A causa del gran numero di cellule necessarie per eseguire un'analisi significative e della grande quantità di dati generati in questo processo, i diversi algoritmi di quantificazione presentati in questo lavoro facilitano l'analisi dell'imaging cellulare. Inoltre, gli algoritmi utilizzati per la polarizzazione cellulare sono facili da automatizzare dalle funzioni MACROS in ImageJ, che è uno strumento utile per ridurre le attività ripetitive e risparmiare tempo.

Queste procedure sperimentali possono essere estrapolate ad altri tipi di cellule che stabiliscono fenotipi polarizzati al fine di realizzare una determinata funzione cellulare. Inoltre, questi protocolli possono essere ottimizzati includendo altri saggi, ad esempio l'attività delle proteine associate come chinasi o proteasi in frazioni arricchite di Centrosome. Nel complesso, questi studi possono fornire informazioni meccanicistiche sulla segnalazione cellulare e sulle vie molecolari che regolano l'istituzione della polarità cellulare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

M.-I.Y. è supportato da una borsa di ricerca di FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e J.L. sono stati sostenuti da borse di studio del Comisiàn Nacional de Ciencia y Tecnolog. Ringraziamo David Osorio della Pontificia Universidad Catalia de Chile per la registrazione video e l'editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanol Fisher Scientific A412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular Marienfield-Superior 111500
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG  LifeTech  A21206 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgG Thermo Fisher Scientific  A-11071 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific  A21238 1:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Amino- Dynabeads ThermoFisher 14307D
Anti-pericentrin  Abcam ab4448  1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6 Abcam ab95954 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61 Abcam ab15575 1:200 dilution recomended but should be optimized
BSA  Winkler  BM-0150
CaCl2 Winkler CA-0520
Culture plate T25 BD 353014
Fiji Software Fiji col.
Fluoromount G Electron Microscopy Science 17984-25
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050061
Glutaraldehyde Sigma  G7651 
Glycine Winkler  BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 315-005-003 IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific 31186 IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific SH30071.03 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KCl Winkler PO-1260
Leica SP8 TCS microscope Leica
NaCl Winkler SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope  Nikon
Parafilm M P1150-2
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μm Polyscience 17145-5
Poly-L-Lysine Sigma P8920 Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibody Abcam ab6160 1:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibody Cell signaling 3243 1:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55  Abcam ab170414 1:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody  Abcam ab16504  1:1000 for Western Blot
RPMI-1640 Biological Industries 01-104-1A
Saponin  Merck 558255
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Sucrose Winkler  SA-1390 
Triton X-100  Merck 9036-19-5
Tube 50 ml Corning 353043

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References

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Immunologia e infezione Numero 148 Polarità cellulare lisososomano citoscheletro centrosome sinapsi immunitaria linfociti B analisi delle immagini
Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi
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