Summary
هنا نقوم بوصف نهجين لتوصيف أحداث استقطاب الخلايا في الخلايا الليمفاوية B أثناء تشكيل IS. الأول، ينطوي على التحديد الكمي للتوظيف الجهازي وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في الغشاء متشابك. والثاني هو نهج البيوكيميائية، لتوصيف التغيرات في تكوين سنتروسوم، الذي يخضع للاستقطاب إلى متشابك المناعة.
Abstract
التعرف على المستضدات المربوطة بالسطح بواسطة مستقبلات الخلايا B (BCR) يؤدي إلى تشكيل متشابك المناعة (IS)، حيث يتم تنسيق كل من الإشارات ومستضد. تشكيل IS ينطوي على إعادة عرض الأكتين ديناميكية يرافقه تجنيد الاستقطاب إلى غشاء متشابك من العضيات داخل الخلايا المركزية وما يرتبط بها مثل الليسوسوم وجهاز غولجي. المراحل الأولية من إعادة عرض الأكتين تسمح للخلايا B لزيادة سطح الخلية وتعظيم كمية من المجمعات مستضد-BCR التي تم جمعها في متشابك. في ظل ظروف معينة، عندما تعترف الخلايا B المستضدات المرتبطة بالأسطح الصلبة، وتقترن هذه العملية إلى التوظيف المحلي وإفراز الليسوسوم، والتي يمكن أن تسهل استخراج المستضد. يتم استيعاب المستضدات المركبة في مقصورات داخلية ومتخصصة للمعالجة في الببتيدات، والتي يتم تحميلها على الجزيئات الرئيسية مجمع التوافق النسيجي الثاني (MHC-II) لمزيد من العرض إلى خلايا مساعد T. لذلك، دراسة ديناميات الجهاز ية المرتبطة بتكوين IS أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية تنشيط الخلايا B. في هذه المقالة سوف نناقش كل من التصوير وتقنية البيوكيميائية المستخدمة لدراسة التغيرات في تحديد المواقع داخل الخلايا الأعضاء وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي التي ترتبط مع تشكيل IS في الخلايا B.
Introduction
الخلايا الليمفاوية B هي جزء أساسي من الجهاز المناعي التكيفي المسؤول ة عن إنتاج الأجسام المضادة ضد التهديدات المختلفة ومسببات الأمراض الغازية. يتم تحديد كفاءة إنتاج الأجسام المضادة من خلال قدرة الخلايا B على الحصول على، ومعالجة وتقديمالمستضدات التي تواجهها إما في شكل قابل للذوبان أو سطح المربوطة 1،2. التعرف على المستضدات المتصلة بسطح خلية تقديم، من قبل BCR، يؤدي إلى تشكيل اتصال قريب بين الخلايا يسمى IS3،4. داخل هذه المنصة الديناميكية يتم كل من الإشارات النهائية المعتمدة على BCR واستيعاب المستضدات في مقصورات بطانة اللمعة. تتم معالجة المستضدات التي يتم التقاطها وتجميعها على جزيئات MHC-II وتقدم بعد ذلك إلى الخلايا الليمفاوية T. التفاعلات المنتجة B-T، ودعا B-T خلية التعاون، والسماح للخلايا الليمفاوية B لتلقي الإشارات المناسبة، والتي تعزز تمايزها في خلايا البلازما المنتجة للأجسام المضادة أو خلايا الذاكرة8.
وقد شاركت آليتان في استخراج المستضد من قبل الخلايا B. الأول يعتمد على إفراز البروتياز الناشئة من الليسوسوم التي تخضع للتجنيد والانصهار في مشقوق متشابك5،6. والثاني، يعتمد على قوات سحب Myosin IIA بوساطة التي تؤدي إلى التهاب المهبل من مستضد يحتوي على الأغشية التي يتم استيعابها في حفر المغلفة clathrin7. يعتمد وضع استخراج المستضد على الخصائص الفيزيائية للغشاء الذي توجد فيه المستضدات. ومع ذلك، في كلتا الحالتين، تخضع الخلايا B لحدثين رئيسيين لإعادة تشكيل هما: إعادة تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين واستقطاب العضيات إلى تنظيم الدولة الإسلامية. إعادة عرض الهيكل الخلوي أكتين ينطوي على مرحلة الانتشار الأولية، حيث نتوءات تعتمد على الأكتين في الغشاء متشابك زيادة السطح في اتصال مع مستضد. ويلي ذلك مرحلة انكماش، حيث تتركز الـ BCRs إلى جانب المستضدات في مركز IS من خلال العمل المتضافر للمحركات الجزيئية وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين8،9،10، 11.الاستقطاب من العضيات يعتمد أيضا على إعادة تشكيل الهيكل السيتوهيكل الأكتين. على سبيل المثال ، يصبح السنتروسوم غير مرتبط من النواة ، عن طريق إزالة البلمرة المحلية من الأكتين المرتبطة بها ، والذي يسمح بإعادة تمركز هذه الجهازية إلى IS5،12. في الخلايا B، إعادة وضع سنتروسوم إلى عمود خلية واحد (IS) يرشد التوظيف اللايسوم إلى الغشاء متشابك، والتي عند إفراز يمكن أن تسهل استخراج و / أو معالجة المستضدات المربوطة السطحية6. يتم إثراء Lysosomes المعين في IS مع MHC-II، الذي يفضل تشكيل المجمعات الببتيد MHC-II في مقصورات بطانة الرحم لتقديمها إلى الخلايا T13. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا أن جهاز غولجي يتم تجنيده عن كثب إلى IS14،مما يشير إلى أن الحويصلات المستمدة من غولجي من المسار السري يمكن أن تشارك في استخراج مستضد و / أو معالجة.
وإجمالاً، فإن إعادة ترتيب الأعضاء داخل الخلايا والهيكل الخلوي في الخلايا B أثناء تكوين المشبك هي الخطوات الرئيسية التي تسمح باكتساب المستضد بكفاءة ومعالجتها اللازمة لمزيد من التنشيط. في هذا العمل نقدم بروتوكولات مفصلة حول كيفية إجراء التصوير والتحليل البيوكيميائي في الخلايا B لدراسة إعادة عرض داخل الخلايا من العضيات المرتبطة بتكوين IS. وتشمل هذه التقنيات ما يلي: '1' الفلورة المناعية وتحليل الصور للخلايا باء المنشطة بالخرز المغلف بالمستضد وعلى الأغطية المغلفة بالمستضد، مما يسمح بالتصور والتحديد الكمي للمكونات داخل الخلايا التي يتم تعبئتها إلى IS و(ii) ) عزل الكسور ذات الثراء المركزي في الخلايا B عن طريق التدرجات الفائقة على تدرجات السكروز، مما يسمح بتحديد البروتينات المرتبطة بالمركزية، والتي يحتمل أن تشارك في تنظيم قطبية الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام خلايا IIA1.6 B.
1. B تنشيط الخلية مع الخرز المغلفة مستضد
- إعداد الخرز المغلفة مستضد
- لتنشيط الخلايا B،استخدم NH 2-الخرز المغلفة بشكل مشترك مع مستضد (الخرز المغلفة Ag)، والتي يتم إعدادها باستخدام 50 ميكرولتر (~ 20 × 106 الخرز) من 3 ميكرومتر NH 2-الخرز مع تفعيل (BCR-ligand +) أو عدم تفعيل (BCR-ligand-) مستضدات.
- لIIA1.6 B الخلايا استخدام المضادة للIgG-F (أب')2 جزء كما BCR-ligand + ومكافحة IgM-F(ab')2 أو البقري المصل الزلال (BSA) كما BCR-ligand-. لتنشيط الخلايا الأساسية B أو IgM+ B خط الخلية استخدام المضادة للIgM-F (أب')2 كما BCR-ligand + وBSA كما BCR-ligand-.
ملاحظة: لتجنب ربط الأربطة إلى مستقبلات Fc، استخدم F(ab') أو F(ab')2 أجزاء الأجسام المضادة بدلاً من الأجسام المضادة كاملة الطول. - للمضي قدما في إعداد الخرز المغلفة Ag، ووضع الخرز في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ملزمة البروتين منخفضة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخرز خلال التلاعب عينة. إضافة 1 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لغسل الخرز والطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق الخرز مع 500 درجة مئوية من 8٪ الجلوتالارهايد لتنشيط مجموعات NH2 وتناوب لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
تحذير: يجب استخدام محلول مخزون الجلوتارهايد لا يستخدم إلا في غطاء الدخان الكيميائي. اتبع الإرشادات الموجودة على ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS). - الخرز الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة الجلوتالالديهايد وغسل الخرز ثلاث مرات أخرى مع 1 مل من 1X PBS.
تحذير: يجب التخلص من محلول الجلوتارهايد كنفايات كيميائية خطرة. - إعادة تعليق الخرز المنشط في 100 درجة مئوية من 1X PBS. ويمكن تقسيم العينة إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ملزمة البروتين منخفضة: 50 درجة مئوية لBCR-ligand + و 50 درجة مئوية لBCR-ligand-.
- لإعداد محلول مستضد استخدام اثنين من 2 مل منخفضة البروتين ملزمة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من محلول مستضد في 150 درجة مئوية من PBS: أنبوب واحد مع BCR-ligand + وغيرها مع BCR-ligand-.
- إضافة 50 درجة مئوية من محلول الخرز المنشط لكل أنبوب يحتوي على 150 درجة مئوية من محلول المستضد، دوامة وتدوير بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إضافة 500 درجة مئوية من 10 ملغ / مل BSA لمنع ما تبقى من مجموعات NH2 التفاعلية على الخرز وتدوير لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
- طرد مركزي الخرز في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant. غسل الخرز مع الباردة 1X PBS ثلاث مرات أخرى.
- إعادة تعليق الخرز المنشط في 70 درجة مئوية من 1X PBS.
- لتحديد التركيز النهائي للحبات المغلفة Ag، تمييع كمية صغيرة من الخرز في PBS (1:200) وحساب باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. ثم يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يُستعمل.
ملاحظة: لا ينبغي تخزين الخرز المغلفة Ag لأكثر من شهر واحد.
- إعداد الأغطية بولي-L-يسين
- قبل تحديد تنشيط الخلية B مع الخرز المغلفة Ag، وإعداد الأغطية المغلفة بولي-L-يسين (PLL-coverslips). استخدام أنبوب 50 مل تحتوي على 40 مل من 0.01٪ ث / الخامس من محلول PLL وتزج الأغطية 12 ملم قطرها في الحل. تدوير بين عشية وضحاها في RT.
- اغسل الأغطية بـ 1x PBS واتركها لتجف على غطاء طبق يُغطّى بفيلم البارافين بـ 24 بئراً. تابع مع تنشيط الخلية B.
- تنشيط الخلية B
- لبدء تنشيط الخلية B مع الخرز، أولا تخفيف خط الخلية IIA1.6 B إلى 1.5 × 106 خلايا / مل في انقر المتوسطة (RPMI-1640 تستكمل مع 2 مل L-ألانين-L-الجلوتامين + 55 ميكرو متر بيتا ميركابتوإيثانول + 1 مليون بيروفات + 100 U / مل البنسلين + 100 ميكروغرام / مل العقدية) + 5٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني [FBS]).
- الجمع بين 100 درجة مئوية (150،000 خلية) من خلايا IIA1.6 B مع الخرز المغلفة Ag بنسبة 1:1 في أنابيب 0.6 مل. يُمزج بلطف باستخدام دوامة والبذور على الأغطية PLL. حضانة لنقاط زمنية مختلفة في حاضنة ثقافة الخلية (37درجة مئوية / 5٪ CO 2). نقاط وقت التنشيط النموذجية هي 0 و 30 و 60 و 120 دقيقة. للمرة 0، ضع غطاء PLL في غطاء لوحة 24 جيدا على الجليد. يُضاف خليط الخرز المطلي بالخلايا والخرز لمدة 5 دقائق على الثلج.
ملاحظة: من المهم أن تختلط بواسطة دوامة بدلا من الأنابيب صعودا وهبوطا، لأن هذا يمكن أن يقلل من عدد الخرز في العينة، وذلك بسبب تراكمها في طرف من البلاستيك من الماصة. استخدام الخرز المغلفة مع BCR-ligand- كسيطرة سلبية لكل نموذج. نوصي بتفعيل أطول فترة حضانة أولاً ثم النقاط الزمنية التالية. حساب فترات التنشيط للعينات بحيث تكون جاهزة للتثبيت في نفس الوقت. - إضافة 100 درجة مئوية من الباردة 1X PBS إلى كل غطاء لوقف التنشيط والاستمرار في بروتوكول الفلورة المناعية. انظر الفرع 3 من البروتوكول.
2. B تنشيط الخلية على الأغطية المغلفة مستضد
-
إعداد الأغطية المغلفة مستضد
- قبل التنشيط، قم بإعداد محلول المستضد (1x PBS الذي يحتوي على 10 ميكروغرام/مل BCR-ligand+ و0.5 ميكروغرام/مل الفئران المضادة للماوس CD45R/B220).
ملاحظة: خذ بعين الاعتبار إعداد الأغطية في اليوم السابق للحجز. B220 يحسن التصاق الخلية B، ومع ذلك، BCR-Ligand+ كافية لتوليد استجابة الانتشار. - ضع غطاء الغلاف عيار 12 مم على غطاء لوحة 24 بئر مغطى بفيلم البارافين، أضف 40 ميكرولتر من محلول المستضد على كل غطاء وحضانة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ختم لوحة لتجنب تبخر محلول مستضد.
- اغسل الأغطية بـ 1x PBS والهواء الجاف.
- قبل التنشيط، قم بإعداد محلول المستضد (1x PBS الذي يحتوي على 10 ميكروغرام/مل BCR-ligand+ و0.5 ميكروغرام/مل الفئران المضادة للماوس CD45R/B220).
-
تنشيط الخلية B
- لبدء التنشيط، تمييع خلايا IIA1.6 B إلى 1.5 × 106 خلايا/مل في CLICK المتوسطة + 5٪ FBS.
- إضافة 100 درجة مئوية من الخلايا على غطاء المغلفة مستضد (Ag-coverslip) وتفعيل لنقاط زمنية مختلفة في حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية / 5٪ CO2. نقاط وقت التنشيط النموذجية هي 0 و 30 و 60 دقيقة.
ملاحظة: كما هو الحال في القسم 1، نوصي بالبدء بأطول نقطة زمنية تنشيط من أجل إصلاح كافة العينات في نفس الوقت. - للمرة 0، ضع غطاء اللوحة 24 جيدا التي تحتوي على Ag-coverslip على الجليد وإضافة الخلايا. الحضانة لمدة 5 دقائق على الجليد.
- يستنشق بعناية وسائل الإعلام على كل غطاء Ag ثم إضافة 100 درجة مئوية من الباردة 1X PBS لوقف التنشيط. استمر في بروتوكول الفلورة المناعية. انظر الفرع 3.
3- الفلورة المناعية
ملاحظة: لتجنب التفاعل عبر الأجسام المضادة الثانوية مع BCR من خلايا IIA 1.6 B لا تستخدم الأجسام المضادة الأساسية المشتقة من الماوس.
- إزالة PBS 1X والمضي قدما في تثبيت كل غطاء.
ملاحظة: لتحديد أي وسيط التثبيت للاستخدام، تحقق من ورقة بيانات الأجسام المضادة/صبغ. على سبيل المثال، لوضع العلامات على الأكتين عن طريق phalloidin استخدام paraformaldehyde (PFA) تثبيت المتوسطة، ولوضع العلامات المركزية عن طريق pericentrin استخدام تثبيت الميثانول.- إضافة 50 درجة مئوية من 1X PBS تستكمل مع 4٪ PFA وحضانة لمدة 10 دقيقة في RT.
تحذير: الفورمالديهايد سام. يرجى قراءة MSDS قبل العمل مع هذه المادة الكيميائية. يجب أن يتم حل PFA فقط تحت غطاء محرك السيارة الدخان الكيميائية يرتدي القفازات ونظارات السلامة. وينبغي التخلص من محلول الهيدروكربون المشبع بالفلور باعتباره نفايات كيميائية خطرة. - بدلا من ذلك، إضافة 50 درجة مئوية من الميثانول البارد والحضانة لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 50 درجة مئوية من 1X PBS تستكمل مع 4٪ PFA وحضانة لمدة 10 دقيقة في RT.
- غسل ثلاث مرات مع 1X PBS.
ملاحظة: يمكن تخزين الأغطية عند 4 درجة مئوية عند هذه النقطة لمدة ثلاثة أيام كحد أقصى في 1x PBS. - إزالة 1X PBS وإضافة 50 درجة مئوية من حظر العازلة (2٪ BSA + 0.3 M غليسين في 1X PBS) على كل غطاء. حضانة في RT لمدة 10 دقائق.
- يستنشق بلطف وإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت (PB) (0.2٪ BSA + 0.05٪ الصابونين في 1X PBS). حضانة في RT لمدة 20 دقيقة.
- إعداد الأجسام المضادة أو الأصباغ في PB (استخدام 30 ميكرولتر لكل غطاء) وحضانة في RT لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يرجى الرجوع إلى جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
- لتسمية مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة (MTOC) أو centrosome استخدام الأجسام المضادة التالية: المضادة γ-Tubulin (1:500)، المضادة لCep55 (1:500)، المضادة لα-tubulin (1:500)، المضادة للاستين (1:1000).
ملاحظة: للحصول على علامات سنتروسوم B الخلايا يمكن أن يكون transfected مع بلازميد التعبير سنترين-GFP. - لوضع العلامات على جهاز غولجي استخدام مكافحة Rab6a (1:500).
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام الأجسام المضادة أو الأصباغ الأخرى. - لوضع العلامات lysosomes، استخدم المضادة للمصباح1 (1:200).
ملاحظة: المضادة لH2-DM ومكافحة MHC-II يمكن أيضا أن تستخدم لتسمية مقصورات معالجة مستضد15،16. - لوضع العلامات على الشبكية الإندوبلازمية استخدام المضادة لSec61a (1:500).
- للهيكل الخلوي الأكتين النظر في ما يلي: يمكن تصور الأكتين البوليمرية من قبل Phalloidin مترافقة مع الأصباغ الفلورية.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام الخلايا B المنقولة مع بلازميد تعبير LifeAct-GFP/RFP لتسمية الأكتين.
- لتسمية مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة (MTOC) أو centrosome استخدام الأجسام المضادة التالية: المضادة γ-Tubulin (1:500)، المضادة لCep55 (1:500)، المضادة لα-tubulin (1:500)، المضادة للاستين (1:1000).
- غسل الأغطية ثلاث مرات مع PBS.
- تخفيف الأجسام المضادة الثانوية أو الأصباغ في PBS (استخدام 30 ميكرولتر لكل غطاء) وحضانة 1 ساعة في RT.
ملاحظة: تجنب تعريض العينات للضوء المباشر للحفاظ على جودة إشارة الفلورة. - غسل الأغطية ثلاث مرات مع PBS.
- إزالة حل PBS من الأغطية.
- إضافة 4 ميكرولتر من الكاشف المتصاعد إلى شريحة المجهر. قم بتركيب غطاء الغلاف على الشريحة مع جانب الخلية الذي يواجه لأسفل. السماح للشرائح لتجف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية أو في RT بين عشية وضحاها.
ملاحظة: خذ بعين الاعتبار استخدام كاشف تركيب "مضاد للتلاشي" (راجع جدول المواد). - احصل على صور الفلورة على مجهر confocal أو epifluorescence مع هدف غمر الزيت 60x أو 100x. لكل اكتساب النظر في الضوء المنقولة أو حقل مشرق لتحديد الخلايا B بسهولة التفاعل مع الخرز.
ملاحظة: خذ صور ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تغطي الخلية بأكملها باستخدام مكدسات z. نوصي بأخذ أكوام سميكة 0.5 ميكرومتر، ولكن هذا يعتمد على المجهر.
4. تحليل الصور
ملاحظة: يتم وصف الخوارزميات التالية لبرنامج ImageJ. ومع ذلك، يمكن تنفيذ ذلك باستخدام برنامج مكافئ. أيضا، النظر في أن لجميع قياسات كثافة الفلورة نستخدم كثافة الفلورة المتكاملة ("RawIntDen" في ImageJ)، لأن هذه المعلمة تنظر في المبلغ الإجمالي للفلورة في كل بكسل من الصورة، مع الأخذ في الاعتبار المنطقة.
- تحليل توزيع العضيات في الخلايا B تنشيط مع الخرز المغلفة Ag
ملاحظة: لتحديد استقطاب مكونات الخلايا إلى IS، نعرّف قيمة عشوائية كمقياس للقرب من IS. يتراوح المؤشر بين -1 (مكافحة الاستقطاب) و 1 (الاستقطاب الكامل، كائن على حبة)، كما سبق أن قدم من قبل Reversat وآخرون.12.- تقدير مؤشر القطبية لجهاز سنتروسوم وغولجي (الشكل1B).
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخوارزمية للعضوية التي تقتصر على نقطة واحدة.- قم أولاً بتعريف مناطق الخرزة والخلايا لتحليلها باستخدام تحديد أداة الدائرة لتحديد حدود كليهما، ثم حفظها كمناطق اهتمام (ROI). انظر الشكل 1والشكل 2والشكل 3والشكل 4.
- تحديد مركز الخلية(CC) ومركز حبة (قبلالميلاد)عن طريق تشغيل تحليل | قياس على مناطق الخلية وحبة على التوالي. تحدد قيم X و Y التي تم الحصول عليها من إطار النتائج إحداثيات المركز.
- يدويا تحديد مركز الجهاز سنتروسوم أو غولجي(Organelle) باستخدام اختيار أداة نقطة في ImageJ وتشغيل تحليل | قياس. تحدد قيم X و Y التي تم الحصول عليها من إطار النتائج الإحداثيات.
- ثم، رسم زاوية من CCإلى Organelle (أ) وCC إلى BC (ب)باستخدام اختيار أداة زاوية وتشغيل تحليل | قياس. تظهر قيمة الزاوية في نافذة النتائج الزاوية (α) بين كلا المتجهين (a و b).
- حساب فهرس القطبية باستخدام الصيغة التالية:
- تقدير مؤشر القطبية للليسوسوم (الشكل1F).
ملاحظة: نستخدم هذه الخوارزمية لتحليل قطبية العضيات التي تعرض توزيع أكثر تشتتاً، مثل lysosomes.- حدد مناطق الخرزة والخلايا لتحليلها، باستخدام تحديد أداة الدائرة لتحديد حدود كليهما، وحفظها كعائد استثمار. مرة واحدة وقد تم ردع حبة ومناطق الخلية، وتعيين قناة الفلورة والمشروع الصورة في واحد z-المكدس (صورة | مكدسات | Z-المشروع [مجموع شرائح])، ثم تشغيل تحليل | قياس واستخراج إحداثيات مركز الكتلة (MC) (MX وMY) من إطارات النتائج.
- تطبيق نفس الخوارزمية المذكورة قبل تغيير Organelle لMC. وهكذا، يتم تعريف الزاوية (α) بواسطة CC-MC (أ) و CC-BC (b).
- حساب القطبية باستخدام الصيغة التالية:
- تقدير التوظيف اللايسوم في منطقة متشابك (الشكل2باء).
ملاحظة: يتم استخدام هذه الخوارزمية لتحديد مقدار organelle المجاورة لIS.- بمجرد تحديد مناطق الخرزة والخلايا، حدد زاوية المتجه بين CC وBC ثم قم بتدوير الصورة لتحقيق زاوية 0 درجة.
- تعيين قناة الفلورسنت والمشروع الصورة في واحد z-المكدس (صورة | مكدسات | Z-المشروع [شرائح المجموع]، والقضاء على جميع الفلورة التي تقع خارج الخلية ومنطقة حبة معا (تشغيل تحرير | واضحة خارج في ImageJ).
- باستخدام اختيار أداة مستطيل، رسم مستطيل المتاخمة للحبة وقياس الفلورة منطقة متشابك (القواتالمسلحةالسودانية). هذا المستطيل هو ربع عرض الخلية.
- حدد الصورة بأكملها وتشغيل تحليل | إجراء للحصول على الفلورةالخلية بأكملها (WCF).
- حساب نسبة الفلورة العضوية المجاورة لـ IS باستخدام الصيغة التالية:
- تحديد حجم توظيف المكونات الخلوية إلى مركز.
ملاحظة: تُستخدم هذه الخوارزمية،المقتبسة من أوبينو وآخرون 5، لتحديد كمية إثراء الأعضاء في المنطقة المركزية. باختصار، نحن نعتبر المنطقة المركزية كمجال حيث الفلورة العضوية المرتبطة المركزية لا تزال ثابتة أو فوق 70٪ في مؤامرة الفلورة / دائرة نصف قطرها. من الضروري تعيين هذه المعلمة في ظروف الراحة لأن نصف القطر هذا يمكن أن يتغير عند التنشيط.- مرة واحدة وقد تم تحديد حبة ومناطق الخلية، وتحديد توطين centrosome باستخدام اختيار أداة نقطة (الشكل3B).
- أولاً، تحديد المساحة القصوى حول المركز الذي يمكن قياسه كمياً، عن طريق رسم دائرة نصف قطرها 3 ميكرومتر تحيط بسنتروسوم.
- استخدام ImageJ البرنامج المساعد شعاعي الشخصي، الذي يقيس الفلورة في الدوائر متحدة المركز ويعرض مؤامرة الفلورة / دائرة نصف قطرها.
- تحديد دائرة نصف قطرها القصوى التي يتم الحفاظ على ما لا يقل عن 70٪ من كثافة الفلورة.
- حساب نسبة كثافة الفلورة باستخدام الصيغة التالية:
=
ملاحظة: تشير نسبة كثافة الفلورة إلى تركيز الجهاز في المركز مقارنة بتوزيعه في الخلية بأكملها.
- تقدير مؤشر القطبية لجهاز سنتروسوم وغولجي (الشكل1B).
- تحليل انتشار الخلايا وتوزيع العضيات في الخلايا B تفعيلها على Ag-coverslips
- تقدير توزيع الأعضاء في IS (الشكل4B).
ملاحظة: تسمح هذه الخوارزمية بالقياس الكمي لتوزيع أجهزة بناء الذاكرة وتركيزها في مركز IS. نحن نحدد نسبة كثافة الفلورة بين المنطقة المركزية وإجمالي متشابك. يمكن أن تختلف القيم التي تم الحصول عليها من سلبية إلى إيجابية، مما يشير إلى توزيع محيطي أو مركزي للأورغانل، على التوالي.- تحديد الشريحة التي تكون الخلية في اتصال مع الغطاء.
ملاحظة: لتحديد حدود الخلية يمكن للمرء تسمية غشاء البلازما أو actin التي يتم إثراؤها في محيط IS. - تغيير نوع الشريحة إلى 8 بت، ثم binarize (عملية | ثنائي | جعلثنائي) وربط أقرب نقطة خارجية عملية | ثنائي | المخطط التفصيلي. تحديد حدود منطقة الخلية (CA) باستخدام تحديد أداة المضلع.
ملاحظة: هذه الخطوة مفيدة لزيادة تباين حدود الخلية وتسهيل التعرف. أيضا، في هذه المرحلة، فمن الممكن لتطبيق البرنامج المساعد تحليل الجسيمات من ImageJ لتحديد المرجع المصدق تلقائيا. ومع ذلك، يمكن أن تتداخل الخلايا الأخرى في نفس الحقل مع النتائج. - خذ معلمات المرجع المصدق (الارتفاع والعرض) وحد منطقة مدورة مركزية مفصولة عن الحدود بربع قيم الارتفاع والعرض، خذ هذه المنطقة كمنطقة مركز الخلية (CCA).
- حساب توزيع كثافة الفلورة في مركز IS باستخدام الصيغة التالية:
- تحديد الشريحة التي تكون الخلية في اتصال مع الغطاء.
- قياس توزيع الأعضاء في الطائرات Z (الشكل4C).
ملاحظة: يحدد هذا التحليل التوزيع العام للفلورة العضوية عبر طائرات Z من الخلايا B المنشطة على غطاء Ag، مما يبين النسبة المئوية للفلورة لكل كسر Z.- لتحديد توزيع الفلورة في Z، أولاً تحديد مستوى IS حيث تكون الخلية على اتصال مع غطاء Ag ثم الطائرة المقابلة للحد الأعلى للخلية.
- رسم خط عبر مركز الخلية.
- إعادة تقطيع الصورة في Z (صورة | مكدسات | قم بإعادةالشريحة)، للحصول على صورة XZ.
- قياس الارتفاع وتقسيم صورة XZ إلى 10 مستطيلات متتالية من نفس الارتفاع (Z fraction) من أسفل (واجهة IS) إلى الجزء العلوي (الجانب العلوي من الخلية) وتحديد إشارة الفلورة في كل واحد.
- تطبيع كثافة الفلورة من كل كسر Z بمجموع الفلورة الإجمالية للكسور 10.
- رسم النسبة المئوية لشدة الفلورة لكل جزء Z من الخلية.
- تقدير توزيع الأعضاء في IS (الشكل4B).
=
5. عزل الكسر المنزّر السنتروسوم من الخلايا B المثبقية والمنشطة
ملاحظة: حافظ على جميع الحلول عند درجة حرارة 4 درجة مئوية أثناء التجربة لتجنب تدهور البروتين. تم تكييف هذا البروتوكول من العمل السابق17،18.
- تفعيل 2 × 107 B الخلايا مع الخرز المغلفة Ag في 2 مل من انقر المتوسطة + 2٪ الحرارة المعطلة FBS (نسبة 1:1). خذ بعين الاعتبار الخلايا B غير المنشطة كخلايا B يستريح.
- إضافة سيتوتشالاسين D (2 μM) ونوكوبازول (0.2 درجة مئوية) وحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم استخدام هذه الأدوية لفصل بلطف centrosome من النواة، عن طريق إزالة البلمرة الأكتين السيتوهيكل الخلوي وmicrotubules، على التوالي، لتجنب التلوث النووي. - اغسل كل عينة بـ 5 مل من السل البارد 1x TBS (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 7.6، 150 مل من حمض الكلى) ثم بـ 1 مل من 0.1 x TBS مع السكروز بنسبة 8%.
- إعادة تعليق الخلايا مع 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للليسات المركزية (1 mM HEPES, pH 7.2,0.5% NP-40, 0.5 m M MgCl 2, 0.1% بيتا ميركابتوإيثانول, 1 مليون فينيل ميثيل سولفونل فلوريد (PMSF) أو كوكتيل مثبطات البروتياز) وماصة صعودا وهبوطا حتى اللزوجة النقصان، مما يشير إلى تحديد تحليل الخلية في العينة. وضع العينة في أنبوب 1.5 مل.
- الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية، لفصل العضيات من النواة.
- استعادة بعناية supernatant ووضعها على رأس أنبوب 1.5 مل مع 300 درجة مئوية من العازلة التدرج (GB) (10 مليون متر متري PH 7.2، 0.1٪ تريتون X-100، 0.1٪ بيتا ميركابتوإيثانول) التي تحتوي على 60٪ السكروز.
- الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لتركيز centrosomes في كسر السكروز 60٪.
- وفي الوقت نفسه، إعداد التدرج غير المستمر في 2 مل أنابيب فائقة الطرد المركزي عن طريق تراكب 450 ميكرولتر من GB + 70٪ السكروز مع 270 ميكرولتر من GB + 50٪ السكروز ثم 270 درجة مئوية من GB + 40٪ السكروز.
- بعد الطرد المركزي الأول (الكسر المركز- مركزة)، تجاهل الجزء العلوي (جزء أقل كثافة) حتى تصل إلى واجهة ودوامة العينة المتبقية في الأنبوب. ثم، تراكب على رأس التدرج متقطع أعدت مسبقا مع عينة المخصب centrosome.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم تعطيل التدرج يجب تنفيذ كافة إجراءات توجيه الأنابيب بعناية. - الطرد المركزي في 40،000 × ز لمدة ساعة في 4 درجة مئوية مع الحد الأدنى من التسارع ومع الفرامل الطرد المركزي تعيين إلى قبالة، لتجنب تعطيل التدرج.
- جمع 12 كسور من 100 درجة مئوية في أنابيب منفصلة تبدأ من أعلى.
- تحديد الكسور الغنية سنتروسوم عن طريق المناعية باستخدام γ-tubulin كعلامة سنتروسوم.
ملاحظة: عادة ما نجد مقتطفات سنتروسوم المخصب بين الكسور 6 و 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توضح هذه المقالة كيف يمكن تنشيط الخلايا B باستخدام مستضد معطلة على الخرز أو الأغطية للحث على تشكيل IS. نحن نقدم معلومات عن كيفية تحديد وقياس الاستقطاب من العضيات المختلفة عن طريق الفلورة المناعية وكيفية توصيف البروتينات التي تخضع لتغيرات ديناميكية في ارتباطها إلى مركز، الذي يستقطب إلى IS، وذلك باستخدام النهج البيوكيميائي.
تصوير الخلايا B عن طريق الفلورة المناعية يسمح لنا لمتابعة ديناميات العضيات مثل المركزية، جهاز غولجي والليسوسوم، والتي يتم تجنيدها إلى IS عند تنشيط الخلية B. ويمكن للمرء أن يحصل على بارامترات كمية لقياس استقطاب هذه العضيات إلى IS ومقارنتها في ظل ظروف مختلفة. كما نظهر في الشكل 1A، يتم تجنيد جهاز Centrosome وGolgi إلى IS عند تفعيل الخلية B. لم يلاحظ التجنيد في الخلايا B التي تم تحفيزها مع BCR-ligand- مما يشير إلى أن المشاركة BCR مطلوبة لتعبئة جهاز مركز وغولجي إلى IS (الشكل1A). للحصول على مؤشر القطبية لكل organelle، كقياس لقربها من IS، نظرنا في ثلاث ميزات: المسافة بين organelle ومركز الخلية، والمسافة بين مركز حبة ومركز الخلية، وزاوية بين هذه متجهين (الشكل1B). يتراوح هذا المؤشر بين -1 (المضادة للاستقطاب) و 1 (الاستقطاب الكامل، كائن على حبة). الشكل 1C و 1D تظهر الرسوم البيانية حيث يتم رسم مؤشرات القطبية من كل organelle مقابل وقت التنشيط. وبالاتفاق مع تلطيخ المناعة، يعرض كل من جهاز المركز والجهاز الغولجي مؤشرات قطبية أكثر إيجابية عند نقاط زمنية أطول للتفعيل، مما يعكس كيفية تجنيدهم تدريجياً في تنظيم «الدولة الإسلامية». تنطبق هذه الخوارزمية على العضيات المحصورة في نقطة واحدة.
بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتحديد استقطاب العضيات التي تعرض توزيعًا مشتتًا، مثل lysosomes (الشكل1E)،من خلال تطبيق نفس الخوارزمية المذكورة من قبل، ولكن تغيير إحداثيات النقطة بواسطة إحداثيات مركز الكتلة الليسوسوم(الشكل 1F). يمكننا أن نلاحظ أن مؤشرات القطبية من برك lysosome تصل إلى قيم أكثر إيجابية عند التنشيط، مما يشير إلى أن يتم تعبئة lysosomes نحو متشابك عند تنشيط الخلية B (الشكل1G).
كما حددنا خوارزميتين لتحديد العضيات التي هي على اتصال مع واجهة متشابك (حبة) وكمية من العضيات على مقربة من متشابك، ولكن ليس بالضرورة في اتصال. كما نبين في الشكل 2، ونحن lysosomes كميا الاتصال واجهة متشابك (الشكل2A)، عن طريق تقسيم إشارة LAMP-1 في منطقة حبة من مجموع الفلورة في الخلية بالإضافة إلى حبة (الشكل2B). من المهم أن نعتبر أن قطر منطقة حبة يحدد نطاقات النسب المئوية التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال، في القياس الكمي المعروض (الشكل2B)،نرسم دائرة بقطر 3 ميكرومتر لقياس الفلورة في حبة، وهي معلمة تقييدية بالنظر إلى حجم الخرزة (3 ميكرومتر). باستخدام هذه المعلمة، تظهر النتائج أن يتم توظيف الليسوسوم تدريجيا إلى واجهة متشابك عند تنشيط الخلية B، لتصل إلى 10-15٪ من الكتلة الإجمالية (الشكل2C). وثمة نهج آخر يظهر هو التحديد الكمي للليسوسوم اتفي بالمنطقة المتشابكة. ويبين الشكل 2D أن الليسوسوم تتراكم تدريجيا ما يصل إلى 25٪ من lysosomes بهم في IS. عموما، من خلال إجراء كلا النوعين من التحليل يمكن للمرء أن يقيم الاستقطاب والإرساء من العضيات في IS.
أثناء تنشيط الخلية B، تم توثيق التغييرات في مجموعة من البروتينات المرتبطة بcentrosome5. على سبيل المثال، واحدة من هذه البروتينات التي تغير ارتباطها في Centrosome أثناء تنشيط الخلية B هو أكتين. في هذه الحالة يصبح الأكتين منضبًا داخل هذه المنطقة، مما يسمح للسنتروسوم أن يصبح منفصلاً عن النواة، مما يعزز استقطابه إلى IS5. هنا نقدم التحديد الكمي للأكتين في سنتروسوم وكيف يتم استنفاده على تنشيط الخلية B (الشكل3). لتحديد المنطقة المركزية المستخدمة لتحديد كمية الأكتين المرتبطة بها، قمنا بقياس شدة الفلورة لهذه التسمية في دوائر متحدة المركز المحيطة بالكونسنتروسوم. تم تعريف نصف القطر على أساس النقطة التي يتم فيها الحفاظ على ما لا يقل عن 70٪ من كثافة الفلورة للتسمية (الشكل3B). باستخدام هذا النهج يمكن للمرء أن يحدد مقدار الانخفاض في كثافة الأكتين في مركز على تنشيط الخلية B، كما هو مبين في الشكل 3C.
للحصول على دقة أكبر في توزيع العضيات في واجهة IS، قمنا بتنشيط الخلايا B على الأغطية المغلفة بالمستضد، وسم أكتين، وجهاز غولجي والشبكية endoplasmic (الشكل4A). ويمكن توزيع العضيات في IS عن طريق الغوص في منطقة متشابك في منطقة مركزية ومحيطية، وتطبيق المعايير المبينة في الشكل 4B. وقد استند ذلك إلى عمل سابق يبين أن تقارير الـ BCRs تتجمع داخل هذه المنطقة المركزية، والتي من المرجح أن تتوافق مع مجمع التنشيط فوق الجزيئي المركزي (cSMAC)10و19 . ويبين الشكل 4ألف أن العضيات التي تم تجنيدها في تنظيم الدولة الإسلامية، مثل جهاز غولجي والشبكية الإندوبلازمية تعرض توزيعات معاكسة. في الواقع، ترتبط مؤشرات التوزيع الخاصة بهم مع تلطيخ الفلورة المناعية الخاصة بهم كما هو موضح في الشكل 4C. يظهر جهاز غولجي قيمة إيجابية، مما يعني أنه يتركز في مركز تنظيم «الدولة الإسلامية» في حين أن الشبكية الإندوبلازمية تظهر القيم السلبية، مما يعني أنه يتم توطينه بشكل رئيسي في المنطقة الطرفية من تنظيم «الدولة الإسلامية». بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن تأخذ قيم منطقة متشابك المحددة سابقا، لقياس منطقة الانتشار أثناء تنشيط الخلية B، كما هو مبين في الشكلين 4D و 4E. تظهر هذه النتائج زيادة في منطقة الانتشار عند تنشيط الخلية B، كما سبق وصفها10،20.
كما هو الحال في فحص حبة، يمكننا تحديد توزيع العضيات نحو متشابك المناعة عن طريق اتخاذ الصور XZ من الخلايا B تفعيلها على الأغطية المغلفة مستضد وقياس الفلورة العضوية عبر البعد Z (الشكل4F). تم قياس كثافة الفلورة من الأكتين في الطائرة Z، كما هو ممثّل في مستوى XZ في الشكل 4F، حيث يمكن ملاحظة الإثراء التدريجي للأكتين في واجهة متشابك (الكسرين 1 و 2) (الشكل4G).
بالإضافة إلى تحليل التصوير ب الخلايا B، قمنا بعزل الكسور ذات الثراء المركزلتحديد كمية البروتينات المرتبطة بـ centrosome (الشكل5A). هذا النهج يمكن أن تكون مهمة لاستكمال دراسة تشكيل IS في الخلايا B، بالنظر إلى أن الاستقطاب المركزي إلى الغشاء متشابك وقد ثبت لتنسيق الاتجار الليسوسوم المشاركة في استخراج مستضد وعرض21. تم وصف هذه الطريقة سابقا باستخدام كميات كبيرة من الخلايا (1 × 109 خلايا)17،18 ولكن قمنا بتوحيد نسخة مبسطة ، والتي تستخدم كمية مخفضة من الخلايا ويمكن تنفيذها باستخدام أقل حجم أنابيب فائقة الطرد المركزي (2-3 مل). كما نبين في الشكل 5B، قمنا بتحليل كسور الخلايا المختلفة عن طريق المناعة وتحديد تلك التي تتوافق مع الكسور الغنية سنتروسوم ، عن طريق تلطيخ توبولين غاما. هنا نعرض مثالا على البروتينات التي تخضع لتغيرات في تراكمها في سنتروسوم، مثل أكتين وArp2، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا5.
الشكل 1 : استقطاب العضيات نحو تنظيم «الدولة الإسلامية». (أ) تلطيخ المناعة لجهاز غولجي (Rab6a) وmicrotubules (α-tubulin) في خلايا IIA1.6 B الحاضنة مع BCR-ligand+ (0 و 30 و 60 و 120 دقيقة) أو BCR-ligand- الخرز (120 دقيقة). رؤوس الأسهم تشير إلى المركزية. BF = حقل مشرق. شريط مقياس = 3 ميكرومتر (ب) مخطط يصور كيفية حساب مؤشر القطبية من العضيات (المركزية أو جهاز غولجي) نحو IS. a = المسافة بين مركز الخلية (CC) إلى organelle. ب = المسافة من CC وإلى مركز حبة (BC). (C, D) قطع زمنية تمثيلية تظهر مؤشرات القطبية للأعضاء في نقاط زمنية مختلفة للتنشيط. تمثل كل نقطة خلية واحدة. (E) تلطيخ مناعة الليسوسوم (Lamp1) في الخلايا B الحاضنة مع BCR-ligand + (0، 30، 60 و 120 دقيقة) أو BCR-ligand- الخرز (120 دقيقة). BF = حقل مشرق. شريط مقياس = 3 μm. (F)مخطط يمثل كيفية حساب مؤشر القطبية من Lysosomes. a = المسافة بين CC إلى مركز الكتلة (MC). ب = المسافة من CC إلى BC. (زاي) قطع زمنية تمثيلية تظهر مؤشرات القطبية للليسوسوم في نقاط زمنية مختلفة للتنشيط. تمثل كل نقطة خلية واحدة. تم إجراء اختبار ANOVA في اتجاهين مع اختبار ما بعد إداك. يتم عرض الوسائل مع SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : تراكم الليسوسوم في IS. (أ) تلطيخ مناعة الليسوسوم (Lamp1) في الخلايا B الحاضنة مع BCR-ligand+ (0، 30، 60 و 120 دقيقة) أو BCR-ligand-الخرز (120 دقيقة). BF = حقل مشرق. شريط مقياس = 3 ميكرومتر (ب) مخطط يصور كيفية حساب تراكم العضيات مثل الليسوسوم في حبة ومنطقة متشابك. يشار إلى الفلورة من الخلية بأكملها (WCF)، الفلورة حبة (BF) والفلورة منطقة متشابك (SAF). (C, D) الرسوم البيانية شريط ممثل لتراكم lysosomes في حبة ومنطقة متشابك. N = 1. 20 > خلايا. تم إجراء اختبار ANOVA في اتجاهين مع اختبار ما بعد إداك. يتم عرض الوسائل مع SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : التحديد الكمي للأكتين في المركز أثناء تشكيل IS. (أ) تلطيخ المناعة من الأكتين (Phalloidin) وmicrotubules (α-Tubulin) في الخلايا B الحاضنة مع BCR-ligand + (0 و 60 دقيقة) أو BCR-ligand- الخرز (0 و 60 دقيقة). رؤوس الأسهم تشير إلى المركزية. شريط مقياس = 3 ميكرومتر (ب) مخطط يصور كيفية حساب توظيف أو استنفاد المكونات المرتبطة سنتروسوم. يتم حساب المنطقة المركزية باستخدام دائرة نصف قطرها (X μm) التي تحافظ على ما لا يقل عن 70٪ من الفلورة القصوى. (C) قطع الأراضي نقطة ممثل تظهر الأكتين في مركز في ظل تفعيل (BCR-ligand +) وعدم تفعيل (BCR-ligand-) الشروط. N = 1. 15 > خلايا. تم إجراء اختبار ANOVA في اتجاهين مع اختبار ما بعد إداك. يتم عرض الوسائل مع SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : توزيع المكونات الخلوية في واجهة متشابك. (أ) تلطيخ المناعة من الأكتين (Phalloidin)، الشبكية Endoplasmic (Sec61a)، جهاز غولجي (transfected مع KDELR-DN-GFP المهيمنة السلبية من مستقبلات KDEL، الذي يتوطين في غولجي). تم زرع الخلايا B على الأغطية المغلفة مع BCR-ligand + لمدة 60 دقيقة BF = حقل مشرق. شريط مقياس = 5 ميكرومتر (ب) مخطط يصور كيفية تحديد منطقة الانتشار في الخلية وتجنيد العضيات في مركز IS. في المخطط، يشير CA إلى منطقة الخلية المحددة بواسطة الأكتين القشري وCCA يشير إلى منطقة الخلية المركزية. (C) جهاز غولجي وتوزيع الشبكية endoplasmic في IS، ممثلة في الرسم البياني شريط حيث قيمة >0 يشير إلى إثراء في وسط IS و < 0 يشير إلى توزيع الطرفية. N = 1. 20 > خلايا. يتم عرض الوسائل مع SEM. (D) الصور التمثيلية للخلايا B المسمى الأكتين (Phalloidin) تنشيط على الأغطية المغلفة Ag في نقاط زمنية مختلفة (0 و 30 و 60 دقيقة)، والتي تظهر XZ و XY الطائرة. (هـ)رسم بياني يبين منطقة الانتشار للخلايا B في E. (F) مخطط يصور كيفية تحديد توزيع إشارة الاهتمام في الطائرة Z، والمؤامرة لكل جزء Z. يشير المستطيل إلى واجهة IS. (G) توزيع الأكتين عبر الطائرة Z ممثلة بقطعة خط من نسبة توزيع الفلورة مقابل كل كسر Z. يمثل المستطيل واجهة IS. N = 1. 25 > خلايا. يتم عرض الوسائل مع SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : الكسور الغنية من الخلايا B. (أ) سير العمل من كيفية الحصول على الكسور الغنية سنتروسوم عن طريق السكروز التدرج ultracentrifugation. (ب) مناعة الكسور التي تم الحصول عليها من الخلايا B يستريح وتنشط (60 دقيقة). يتم الكشف عن الكسور الغنية المركزعن عن طريق وضع العلامات مع γ-tubulin ويشار إليها داخل مستطيل متقطع (كسر 6 إلى 8). تظهر البروتينات المرتبطة بـ Centrosome (Actin وArp2) في الكسور الغنية بالسنتروسوم في ظروف التنشيط والراحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نصف طريقة شاملة لدراسة كيفية إعادة تنظيم الخلايا الليمفاوية B الهندسة المعمارية داخل الخلايا لتعزيز تشكيل IS. وتشمل هذه الدراسة استخدام تقنيات التصوير لتحديد كمية التوزيع داخل الخلايا من العضيات، مثل سنتروسوم، جهاز غولجي والليسوسوم خلال تنشيط الخلية B، وكيف أنها الاستقطاب إلى IS. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف نهج البيوكيميائية لدراسة التغيرات في تكوين سنتروسوم على تنشيط الخلية B.
لتعزيز تشكيل IS في الخلايا B، استخدمنا المستضدات المعطلة (الخرز المغلفة مستضد) بدلا من المجمعات المناعية القابلة للذوبان لأن الأول يؤدي إلى إنشاء موقع اتصال منفصلحيث إعادة ترتيب الهيكل الخلوي وorganelle يمكن دراسة الاستقطاب بسهولة. جانب حاسم في تنشيط الخلايا B التصوير هو إعداد العينات. يجب أن تحصل جميع عمليات الاستحواذ على الصور بشكل مثالي على خلية 1:1: نسبة الخرزة، لتحديد استقطاب العضيات إلى موقع فريد من نوعه للاتصال بالمستضد. ومع ذلك، في بعض الحالات يمكن للخلايا B التقاط اثنين أو أكثر من الخرز، مما يجعل من الصعب اختيار موقع واحد من مواجهة مستضد. لتجنب تشكيل المجاميع حبة، من المهم أن دوامة الخرز المترافق ة قبل إضافتها إلى الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لتجارب الفلورة المناعية، نوصي باستبعاد الخلايا الكمية التي تلتقط أكثر من حبة واحدة، من أجل تجنب سوء التفسير أثناء تحليل الصورة. وثمة خطوة حاسمة أخرى في إعداد العينات هي حالة التثبيت/النفاذية. على سبيل المثال، نوصي بإصلاح الخلايا مع الميثانول لتحسين تلطيخ microtubule و 4٪ PFA لتلطيخ الفيلويدين. عند وضع العلامات في وقت واحد الأكتين هيكل عظمي وmicrotubules، يمكن أن يكون بديلا لتسمية تجمع الأكتين عن طريق نقل الخلايا مع LifeAct-GFP / RFP التعبير بلازميد في تركيبة مع تلطيخ microtubule. يمكن إجراء اكتساب الصور المستخدمة لتحديد الاستقطاب من Centrosome وغيرها من العضيات داخل الخلايا مع المجهر الظهارة. ومع ذلك، للحصول على كمية دقيقة في مختلف الطائرات z، على سبيل المثال في الفحص الانتشار، مطلوب الفحص المجهري البؤري.
بالنسبة لبروتوكول العزل المركزي الموضح هنا، هناك خطوة حاسمة هي الحصول على كمية مناسبة من العينات لتكون قادرة على قياس البروتينات عن طريق المناعة. وبالنظر إلى أن الخلايا B لديها نواة كبيرة والسيتوبلازم أقل من 30٪ من إجمالي حجم الخلايا، والحصول على عوائد أعلى من البروتينات السيتوبلازمية يمكن أن يكون تحديا. لهذا السبب، نوصي باستخدام ما يقرب من 20 × 106 B الخلايا لكل نقطة وقت التنشيط لعزل centrosome.
وهناك قيد كبير من هذه الأساليب هو أن التنشيط مع الخرز المترافق لا يشمل تعقيد البيئة التي يتم فيها تقديم المستضدات المربوطة بالسطح إلى الخلايا B في الجسم الحي. ويمكن معالجة هذا القيد عن طريق استكمال الثقافة أو الخرز مع غيرها من العوامل التحفيزية المشتركة, مثل السيتوكينات ومكونات المصفوفة خارج الخلية. ومع ذلك، من الأهمية بمكان استخدام الضوابط المناسبة في هذه الحالات من أجل تفسير النتائج بشكل صحيح.
تعتمد أهمية الأساليب المعروضة في هذا العمل على النهج المتكامل المستخدم لدراسة المشبك المناعي للخلية B: (1) استقطاب العضيات وتوزيعها و(2) التغيرات في تكوين البروتين في المركز. ونظراً للعدد الكبير من الخلايا اللازمة لإجراء تحليل الإشارات والكمية الكبيرة من البيانات المتولدة في هذه العملية، فإن خوارزميات القياس الكمي المختلفة المعروضة في هذا العمل تيسر تحليل تصوير الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإن الخوارزميات المستخدمة لاستقطاب الخلايا من السهل أتمتتها بواسطة وظائف MACROS في ImageJ، وهي أداة مفيدة لتقليل المهام المتكررة وتوفير الوقت.
ويمكن استقراء هذه الإجراءات التجريبية لأنواع أخرى من الخلايا التي تنشئ الأنماط الظاهرية المستقطبة من أجل إنجاز وظيفة خلوية معينة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين هذه البروتوكولات عن طريق تضمين الاختبارات الأخرى، على سبيل المثال، نشاط البروتينات المرتبطة بها مثل الكيناسيس أو البروتياز في الكسور ذات التخصيب المركز. بشكل عام، يمكن أن توفر هذه الدراسات نظرة ميكانيكية في إشارات الخلايا والمسارات الجزيئية التي تنظم إنشاء قطبية الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
M.-I.Y. مدعوم بمنحة بحثية من FONDECYT #1180900. وحظيت كل من لجنة الدراسات الدولية ووزارة العدل وشركة J.L. بدعم من زمالات من اللجنة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا. نشكر ديفيد أوسوريو من جامعة بونتيفيسيا الكاثوليكية في شيلي على تسجيل الفيديو وتحريره.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
