Summary
本明細行では、ISの形成中にBリンパ球における細胞偏光事象を特徴付ける2つのアプローチについて説明する。第1に、シナプス膜におけるオルガネラ募集および細胞骨格再配列の定量化を含む。第2は、免疫シナプスに偏光を受けるセントロソームの組成の変化を特徴付ける生化学的アプローチである。
Abstract
B細胞受容体(BCR)による表面つな起きた抗原の認識は、シグナル伝達と抗原取り込みの両方が調整される免疫シナプス(IS)の形成を引き起こす。IS形成は、セントロソームのシナプス膜およびリソソームおよびゴルジ装置などの関連細胞内器官への偏光募集を伴う動的アクチンリモデリングを含む。アクチンリモデリングの初期段階では、B細胞は細胞表面を増加させ、シナプスで集められた抗原BCR複合体の量を最大化することができます。特定の条件下では、B細胞が硬質表面に関連する抗原を認識すると、このプロセスはリソソームの局所的な募集および分泌に結合され、抗原抽出を容易にすることができる。取り込まれた抗原は、ペプチドに処理するための特殊なエンドリソソームコンパートメントに内部化され、これは主要な組織適合性複合体II(MHC-II)分子にロードされ、Tヘルパー細胞へのさらなるプレゼンテーションを行う。したがって、ISの形成に関連するオルガネラダイナミクスを研究することは、B細胞がどのように活性化されるかを理解する上で重要である。本稿では、B細胞におけるISの形成に関連する細胞内小器官位置および細胞骨格の再配列の変化を研究するために用いられるイメージングと生化学的手法の両方について議論する。
Introduction
Bリンパ球は、異なる脅威に対する抗体の産生および侵入病原体に対する抗体を産生する適応免疫系の不可欠な部分である。抗体産生の効率は、B細胞が可溶性または表面つな形1、2のいずれかで遭遇した抗原を獲得、処理および提示する能力によって決定される。提示細胞の表面に付着した抗原の認識は、BCRによって、IS3、4と呼ぶ近接細胞間接触の形成につながる。この動的なプラットホームの中でBCR依存の下流のシグナル伝達および内因性リソソームのコンパートメントへの抗原の内部化の両方が起こる。取り込み抗原はMHC-II分子に処理され、組み立てられ、その後Tリンパ球に提示される。生産的なB-T相互作用は、B-T細胞協調と呼び、Bリンパ球が適切なシグナルを受け取ることを可能にし、抗体産生血漿細胞または記憶細胞への分化を促進する8。
B細胞による抗原抽出には2つのメカニズムが関与している。最初の1つは、シナプス裂裂5、6で募集と融合を受けるリソソームに由来するプロテアーゼの分泌に依存しています。第2のものは、クラトリンコーティングされたピット7に内在する抗原含有膜の浸位を引き起こすミオシンIIA媒介引力に依存する。抗原抽出のモードは、抗原が見つかった膜の物理的特性に依存します。それにもかかわらず、いずれの場合も、B細胞は2つの主要な改造事象を受ける:アクチン細胞骨格の再編成とISへの小器官の偏光。アクチン細胞骨格リモデリングは、シナプス膜におけるアクチン依存性突起が抗原と接触する表面を増加させる初期広がり段階を伴う。これに続いて、抗原と組み合わせたBBCRが、分子モーターとアクチン細胞骨格の協調作用によってISの中心に集中する収縮期が続く。11.オルガネラの偏光もアクチン細胞骨格の改造に依存する。例えば、セントロソームは核から結合解除され、関連するアクチンの局所脱重合によって、この小器官をIS5、12に再配置することを可能にする。B細胞において、セントロソームを1つの細胞極(IS)に再配置すると、シナプス膜へのリソソーム募集が導かれ、分泌時に表面つなつ付け抗原6の抽出および/または処理を容易にすることができる。ISで募集されたリソソームは、T細胞13に提示されるエンドソームコンパートメントにおけるペプチド-MHC-II複合体の形成を支持するMHC-IIで濃縮される。さらに、ゴルジ装置はIS14に密接に採用されることも観察されており、分泌経路からのゴルジ由来小胞が抗原の抽出および/または処理に関与する可能性があることを示唆している。
全体として、シナプス形成中のB細胞における細胞内小器官および細胞骨格の再配列は、そのさらなる活性化に必要な効率的な抗原獲得および処理を可能にする重要なステップである。本研究では、B細胞におけるイメージングおよび生化学的解析を行う方法に関する詳細なプロトコルを紹介し、ISの形成に関連するオルガネラの細胞内改造を研究する。これらの技術には、(i)抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞の免疫蛍光および画像解析および抗原被覆線のスリップが含まれ、ISに動員される細胞内成分の可視化と定量が可能である(ii))スクロース勾配上の超遠心分離によるB細胞中のセントロソーム富化画分の単離は、セントロソームに関連するタンパク質の同定を可能にし、細胞極性の調節に関与する可能性がある。
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Protocol
注: IIA1.6 B セルを使用して、次の手順を実行しました。
1. 抗原被覆ビーズを使用したB細胞活性化
- 抗原被覆ビーズの調製
- B細胞を活性化するには、3μm NH2-ビーズの50μL(〜20 x 106ビーズ)を用いて調製された抗原(Agコーティングビーズ)または非活性化(BCR-リガンド-)抗原を使用してNH2-ビーズを共価的に被覆した。
- IIA1.6 B細胞については、BCR-リガンド+として抗IgG-F(ab')2フラグメントを使用し、抗IgM-F(ab')2またはウシ血清アルブミン(BSA)をBCR-リガンドとして用いる。 一次B細胞またはIgM+B細胞株を活性化するには、抗IgM-F(ab')2をBCR-リガンド+として、BSAをBCR-リガンドとして使用する-。
注:Fc受容体へのリガンドの結合を避けるには、全長抗体の代わりにF(ab')またはF(ab')2抗体断片を使用してください。 - Agコーティングビーズの調製を進めるには、サンプル操作中にビーズの回収を最大化するために、低タンパク質結合マイクロ遠心管にビーズを置きます。1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の1mLを加え、ビーズと遠心分離機を16,000 x gで5分間洗浄します。
- ビーズを8%グルタルアルデヒドの500 μLで再定着させ、NH2群を活性化し、室温(RT)で4時間回転させます。
注意:グルタルアルデヒドストック溶液は、化学ヒュームフードでのみ使用する必要があります。品目安全データ シート (MSDS) の指示に従ってください。 - 遠心ビーズを16,000 x gで5分間取り除き、グルタルアルデヒドを取り出し、1x PBSの1mLでビーズをさらに3回洗います。
注意:グルタルアルデヒド溶液は、有害な化学廃棄物として廃棄する必要があります。 - 活性ビーズを1x PBSの100 μLで再中断します。試料は、BCR-リガンド+の場合は50μL、BCR-リガンド用は50μLの2つの低タンパク質結合マイクロ遠心分離管に分けることができます。
- 抗原溶液を調製するには、PBSの150μLで抗原溶液の100 μg/mLを含む2つの2 mL低タンパク質結合マイクロ遠心分離管を使用する:BCR-リガンド+およびBCR-リガンド-と他の1つのチューブ。
- 150μLの抗原溶液を含む各チューブに50μLの活性ビーズ溶液を加え、渦を加え、4°Cで一晩回転させます。
- ビーズ上の残りの反応性NH2群をブロックするために10mg/mL BSAの500 μLを追加し、4 °Cで1時間回転させます。
- ビーズを16,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。ビーズを冷たい1x PBSでさらに3回洗います。
- 活性ビーズを1x PBSの70 μLで再中断します。
- Agコーティングビーズの最終的な濃度を決定するには、PBS(1:200)で少量のビーズを希釈し、ヘモサイトメーターを使用して数えます。その後、使用するまで4°Cに保存します。
注:アグコーティングビーズは1ヶ月以上保存しないでください。
- ポリL-リジンカバースリップの調製
- Agコーティングビーズを使用したB細胞活性化アッセイの前に、ポリ-L-リジンコーティングされたカバーリップ(PLL-カバースリップ)を調製する。PLL溶液の0.01%w/vの40 mLを含む50 mLチューブを使用し、12 mm径カバースリップを溶液に浸します。RT で一晩回転します。
- カバースリップを1x PBSで洗浄し、パラフィンフィルムで覆われた24ウェルプレートの蓋で乾燥させます。B セルのアクティブ化を続行します。
- B 細胞活性化
- ビーズでB細胞活性化を開始するには、まず、IIA1.6 B細胞株をCLICK培地で1.5 x 106細胞/mLに希釈します(RPMI-1640は2 mM L-アラニン-L-グルタミン+55 μM β-メルカプトエタノール+1mMMピルビン酸+100 U/mLストレプトマイシン)+5%熱不活性化胎児ウシ血清[FBS])。
- IIA1.6 B細胞の100 μL(150,000セル)とAgコーティングビーズを0.6 mLチューブで1:1比で組み合わせます。渦と種子をPLLカバースリップに穏やかに混ぜます。細胞培養インキュベーター内の異なる時間点に対してインキュベート(37°C/5%CO2)。一般的なアクティブ化時間は 0、30、60、120 分です。時間 0 の間、PLL カバースリップを氷の上の 24 ウェルプレートの蓋に入れます。細胞-Agコーティングビーズ混合物を追加し、氷の上に5分間インキュベートします。
注:これは、ピペットのプラスチック先端に蓄積するために、サンプル中のビーズの数を減らすことができるので、上下にピペットの代わりに渦によって混合することが重要です。各アッセイの負の対照として、BCR-リガンドでコーティングされたビーズを使用してください。最初に最も長いインキュベーション時間をアクティブにしてから、次の時間ポイントをアクティブにすることをお勧めします。サンプルのアクティブ化の間隔を計算して、同時に固定の準備ができるようにします。 - 各カバースリップに100 μLの冷たい1x PBSを加えて活性化を停止し、免疫蛍光プロトコルを続けます。プロトコルセクション3を参照してください。
2. 抗原被覆カバースリップに対するB細胞活性化
-
抗原コーティングされたカバースリップの調製
- 活性化前に、抗原溶液(10μg/mL BCR-リガンド+および0.5 μg/mLラット抗マウスCD45R/B220を含む1x PBS)を調製する。
注:アッセイの前日にカバーリップを準備することを検討してください。B220はB細胞接着性を向上させるが、BCR-リガンド+は拡散応答を生成するのに十分である。 - パラフィンフィルムで覆われた24ウェルプレートの蓋に12mmカバースリップを置き、各カバースリップに40μLの抗原溶液を加え、一晩4°Cでインキュベートします。抗原溶液の蒸発を避けるためにプレートをシールします。
- カバースリップを1x PBSで洗い、空気を乾かします。
- 活性化前に、抗原溶液(10μg/mL BCR-リガンド+および0.5 μg/mLラット抗マウスCD45R/B220を含む1x PBS)を調製する。
-
B 細胞活性化
- 活性化を開始するには、IIA1.6 B細胞をCLICK培地+5%FBSで1.5 x 106セル/mLに希釈する。
- 抗原コーティングされたカバースリップ(Agカバースリップ)に100μLの細胞を加え、37°C/5%CO2で細胞インキュベーターの異なる時間点を活性化します。一般的なアクティブ化時間は 0、30、60 分です。
注: セクション 1 と同様に、すべてのサンプルを同時に修正するために、最も長いアクティブ化時点から開始することをお勧めします。 - 時間0の間、氷の上にAgカバースリップを含む24ウェルプレート蓋を置き、細胞を追加します。氷の上で5分間インキュベートします。
- 各Agカバースリップのメディアを注意深く吸引し、100 μLの冷たい1x PBSを加えて活性化を停止します。免疫蛍光プロトコルを続行します。セクション 3 を参照してください。
3. 免疫蛍光
注:IIA 1.6 B細胞のBCRによる二次抗体の交差反応を避けるために、マウス由来の一次抗体を使用しないでください。
- 1x PBSを取り外し、各カバースリップの固定を続行します。
注:使用する固定媒体を決定するには、抗体/色素データシートを確認してください。例えば、ファロイジンによるアクチン標識用パラホルムアルデヒド(PFA)固定培地、及びペリセンタリンによるセントロソーム標識用メタノール固定を用いる。- 4%PFAを添加した1x PBSの50 μLを追加し、RTで10分間インキュベートします。
注意: ホルムアルデヒドは有毒です。この化学物質を使用する前に MSDS をお読みください。PFAソリューションは、手袋と安全メガネを着用した化学ヒュームフードの下でのみ行う必要があります。PFA溶液は、有害な化学廃棄物として廃棄する必要があります。 - または、50 μLのコールドメタノールを加え、20分間インキュベートします。
- 4%PFAを添加した1x PBSの50 μLを追加し、RTで10分間インキュベートします。
- 1x PBSで3回洗います。
注:カバースリップは1x PBSで最大3日間、この時点で4 °Cで保存することができます。 - 1x PBSを取り外し、各カバースリップに50 μLのブロッキングバッファー(2%BSA + 0.3 Mグリシン1x PBS)を追加します。RTで10分間インキュベートします。
- 穏やかに吸引し、透過性バッファー(PB)の50 μLを追加します(0.2% BSA + 0.05% サポニンを1x PBSで)RTで20分間インキュベートします。
- 抗体または染料をPB(カバースリップ当たり30μLを使用)で調べ、RTで1時間または4°Cで一晩インキュベートします。詳細については、材料の表を参照してください。
- 微小管組織センター(MTOC)またはセントロソームに標識するには、抗γ-ツブリン(1:500)、抗Cep55(1:500)、抗αチューブリン(1:500)、抗ペリセントリン(1:1000)の抗体を使用します。
注:セントロソーム標識B細胞については、セントリン-GFP発現プラスミドでトランスフェクトすることができる。 - ゴルジ装置の標識には抗Rab6a(1:500)を使用する。
注:他の抗体または染料も使用できます。 - リソソームの標識には、抗ランプ1(1:200)を使用してください。
注:抗H2-DMおよび抗MHC-IIはまた抗原処理コンパートメント15、16を標識するために使用することができる。 - 小乳状網膜を標識するために抗Sec61a(1:500)を使用する。
- アクチン細胞骨格については以下を考慮する:重合されたアクチンは、蛍光色素に結合したファロイジンによって可視化することができる。
注:LifeAct-GFP/RFP発現プラスミドをトランスフェクトしたB細胞は、アクチンの標識にも使用できます。
- 微小管組織センター(MTOC)またはセントロソームに標識するには、抗γ-ツブリン(1:500)、抗Cep55(1:500)、抗αチューブリン(1:500)、抗ペリセントリン(1:1000)の抗体を使用します。
- カバースリップをPBSで3回洗います。
- PBSで二次抗体または染料を希釈し(カバースリップあたり30μLを使用)、RTで1時間インキュベートします。
注:蛍光信号の品質を保つために、サンプルを直接光にさらすことは避けてください。 - カバースリップをPBSで3回洗います。
- カバースリップから PBS 溶液を取り外します。
- 顕微鏡スライドに4μLの取り付け試薬を追加します。カバースリップをスライドに取り付け、セル側を下向きにします。スライドを37°Cで30分間、または一晩RTで乾燥させます。
注:「アンチフェード」取り付け試薬の使用を検討してください(材料の表を参照)。 - 60xまたは100xオイル浸漬目的で共焦点または上蛍光顕微鏡上で蛍光画像を取得します。各集録では、ビーズと相互作用するB細胞を容易に同定するために、透過光または明るいフィールドを考慮する。
注: Z スタックを使用してセル全体をカバーする 3 次元 (3D) イメージを取ります。厚さ0.5μmのスタックを取ることをお勧めしますが、これは顕微鏡に依存します。
4. 画像解析
注: ImageJ ソフトウェアについては、次のアルゴリズムについて説明します。ただし、これは同等のソフトウェアを使用して実行できます。また、すべての蛍光強度測定では、画像の各ピクセルにおける蛍光の総量を考慮し、領域を考慮して、統合蛍光密度(ImageJの「RawIntDen」)を使用することを考慮してください。
- Ag被覆ビーズで活性化したB細胞におけるオルガネラ分布の解析
注: IS への細胞成分の偏光を定量化するために、IS に近接する値として任意の値を定義します。インデックスの範囲は-1(対偏光)と1(完全に偏光、ビーズ上のオブジェクト)で、以前にReversatらによって提示されました。12歳.- セントロソームおよびゴルジ装置の極性指数を推定する(図1B)。
注:このアルゴリズムは、1点に限定された小器官に使用することができます。- まず、円ツール選択を使用して分析するビード領域とセル領域を定義し、両方の境界を区切り、次に目的の領域 (ROI) として保存します。図1、図2、図3、図4を参照してください。
- 分析を実行してセル中心 (CC) とビード中心 (BC)を決定する|セルとビーズの領域をそれぞれ測定します。[結果] ウィンドウから取得した X 値と Y 値によって、中心座標が決まります。
- ImageJ のポイントツール選択を使用して、セントロソームまたはゴルジ装置(オルガネレ)の中心を手動で決定し、Analyzeを実行する|メジャー.[結果]ウィンドウから取得した X 値と Y 値によって座標が決まります。
- 次に、角度ツール選択を使用して CCからオルガネレ (a) と CC から BC (b)に角度を描画し、Analyze を実行します|メジャー.結果ウィンドウの角度値は、両方のベクトル (a と b)の間の角度 (α)を示します。
- 次の式を使用して極性インデックスを計算します。
- リソソームの極性指数を推定する(図1F)。
注:このアルゴリズムを使用して、リソソームなどの分散分布を示すオルガネラの極性を解析します。- 解析するビード領域とセル領域を定義し、円ツール選択を使用して両方の境界を区切り、ROI として保存します。ビーズと細胞領域が抑止されたら、蛍光チャネルを設定し、画像を1つのZスタックに投影します(画像|スタック |Z-プロジェクト [合計スライス]を実行し、[分析] を実行します|結果ウィンドウからマス中心(MC)座標(MX および MY)を測定して抽出します。
- MC用のオルガネラを変更する前に、上記のアルゴリズムを適用します。したがって、角度 (α) は CC-MC(a)および CC-BC (b)によって定義されます。
- 次の式を使用して極性を計算します。
- シナプス領域へのリソソーム募集を推定する(図2B)。
注: このアルゴリズムは、IS に隣接するオルガネラを定量化するために使用されます。- ビーズとセルの領域が決定されたら、CC と BC の間のベクトルの角度を決定し、イメージを回転して 0° の角度を達成します。
- 蛍光チャネルを設定し、画像を1つのZスタックに投影する (画像 |スタック |Z-Project [合計スライス])、細胞とビーズ領域の外側にあるすべての蛍光を一緒に排除します(ImageJの外側をクリア編集を実行)。
- 長方形ツール選択を使用して、ビーズに隣接する長方形を描画し、シナプス領域蛍光(SAF)を測定します。この四角形は、セルの幅の四分の一です。
- 画像全体を選択し、[分析] を実行 | 全細胞蛍光(WCF)を得るための測定。
- 次の式を使用して、IS に隣接する小器官蛍光率を計算します。
- 中心に細胞成分の募集を定量化する。
注:このアルゴリズムは、Obino et al.5から適応され、セントロソーム領域における小器官の濃縮を定量するために使用される。簡単に言えば、セントロソーム領域は、中心体系に関連する小器官蛍光が蛍光/半径プロットにおいて一定または70%以上のままであるドメインと考えます。この半径はアクティブ化時に変更される可能性があるため、このパラメータを休止状態に設定することが不可欠です。- ビーズとセル領域が決定されたら、ポイントツール選択を使用してセントロソームのローカリゼーションを定義します(図3B)。
- まず、定量化が可能なセントロソームの周囲の最大面積を決定し、セントロソームを囲む半径半径3μmの円を描くことによって決定する。
- 同心円の蛍光を測定し、蛍光/半径プロットを表示する ImageJ プラグインラジアル プロファイルを使用します。
- 蛍光強度の少なくとも70%が維持される最大半径を特定します。
- 蛍光密度比は、次の式を使用して計算します。
=
注:蛍光密度比は、細胞全体の分布と比較して、セントロソームにおける小器官の濃度を示す。
- セントロソームおよびゴルジ装置の極性指数を推定する(図1B)。
- Ag-カバースリップで活性化されたB細胞における細胞の広がりと分布の解析
- ISでのオルガネラ分布の推定(図4B)。
注:このアルゴリズムは、オルガネラのXY分布とISの中心における濃度の定量化を可能にします。中心部と全シナプス領域の蛍光密度の比率を定義する。得られた値は、それぞれ、オルガネラの末梢または中心分布を示す負から正まで変化し得る。- セルがカバーに接触しているスライスを確認します。
注:細胞境界を区切るために、ISの周辺に濃縮されたプラズマ膜またはアクチンに標識することができます。 - スライスの種類を 8 ビットに変更し、バイナライズ (|バイナリ |バイナリを作成し、最も近い外部ポイントを接続する プロセス |バイナリ |概要。ポリゴン ツール選択を使用して、セル領域 (CA) の境界を区切ります。
注: この手順は、セル境界のコントラストを高め、識別しやすくするために役立ちます。また、この時点で、ImageJ のパーティクルプラグインの分析を適用して CA を自動的に決定することも可能です。ただし、同じフィールド内の他のセルが結果を妨げる可能性があります。 - CAパラメータ (高さと幅) を取り、境界から境界から分離された中央の丸い領域を、高さと幅の値の四分の一で区切ります。
- 次の式を使用して、IS の中心にある蛍光密度分布を計算します。
- セルがカバーに接触しているスライスを確認します。
- Z平面でのオルガネラ分布を測定します(図4C)。
注:この分析は、Ag-カバースリップ上で活性化されたB細胞のZ平面間のオルガネラ蛍光の一般的な分布を決定し、Z分当たりの蛍光の割合を示す。- Zの蛍光分布を定量化するには、まず細胞がAgカバースリップと接触しているISの平面を決定し、次に細胞の上限に対応する平面を決定する。
- セルの中心に線を引きます。
- Z でイメージを再スライスする (画像 |スタック |)を使用して、XZ イメージを取得します。
- 高さを測定し、XZ画像を下部(ISインターフェース)から上部(セルの上側)まで同じ高さ(Z画分)の10連続長方形に分割し、各画像の蛍光信号を定量化します。
- 各Z画分の蛍光強度を10画分の総蛍光の合計で正規化する。
- 細胞のZ分の1当たりの蛍光強度のパーセンテージをプロットします。
- ISでのオルガネラ分布の推定(図4B)。
=
5. 安静および活性化B細胞からのセントロソーム富化画分の単離
注:タンパク質の劣化を避けるために、実験中にすべての溶液を4°Cに保ちます。このプロトコルは、前の作業17、18から適応されました。
- CLICK培地+2%熱不活性化FBS(比1:1)の2 mLでAgコーティングビーズで2 x 107 B細胞を活性化します。非活性化B細胞を休止B細胞と考えてください。
- サイトカラシンD(2 μM)とノコダゾール(0.2 μM)を加え、37°Cで1時間インキュベートします。
注:これらの薬物は、核汚染を避けるために、それぞれアクチン細胞骨格および微小管を脱重合することによって、核からセントロソームを穏やかに剥離するために使用される。 - 各サンプルを5mLの冷たい1x TBS(50 mMトリス-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl)で洗浄し、その後、0.1x TBSの1mLで8%ショ糖を補充します。
- 150 μLのセントロソームリシスバッファー(1mM HEPES、pH 7.2、0.5%NP-40、0.5mM MgCl2、0.1%β-メルカプトエタノール、1mMフェニルメチルスルホンド(PMSF)またはプロテイス阻害剤カクテルを使用して細胞を再中断し、前駆抑制剤カクテルを更新し、前駆剤を使用して、細胞を再濁させる。減少し、細胞のライシスがサンプルで同定されたかを示します。サンプルを1.5 mLチューブに入れます。
- 遠心分離機を4°Cで10分間10分間10,000xgで、核からオルガネラを分離する。
- 慎重に上清を回収し、300 μLの勾配バッファー(GB)(10 mM PIPES pH 7.2、0.1%トリトンX-100、0.1%β-メルカプトエタノール)を含む1.5 mLチューブの上に置きます。
- 4°Cで30分間10,000 x gで遠心分離機を60%ショ糖画分にセントロソームを濃縮する。
- 一方、GB + 70% ショクロースの450 μLをGB + 50%ショクロースの270 μL、次いでGB+40%ショクロースの270 μLを重ね合わせて2mL超遠心管に不連続勾配を調造する。
- 最初の遠心分離(セントロソーム濃縮画分)の後、界面に到達するまで上の分画(より密度の低い部分)を破棄し、チューブ内の残りのサンプルを渦にします。次いで、セントロソーム濃縮試料で以前に調製した不連続勾配の上にオーバーレイする。
注: グラデーションを乱さない場合は、すべてのピペッティング手順を慎重に実行する必要があります。 - 4°Cで40,000 x gの遠心分離機を4°Cで1時間、遠心ブレーキをオフに設定し、勾配を乱さないようにします。
- 100 μL の 12 分画を上部から始まる別々のチューブに集みます。
- γ-チューブリンをセントロソームマーカーとして用いて免疫ブロトによりセントロソーム濃縮画分を同定する。
注:我々は通常、分数6と8の間にセントロソーム富化抽出物を見つけます。
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Representative Results
本論文では、ビーズまたはカバーリップ上の固定化抗原を用いてB細胞を活性化し、ISの形成を誘導する方法を示す。免疫蛍光による異なる小器官の偏光を同定・定量化する方法と、ISに偏光するセントロソームとの動的な変化を受けるタンパク質を特徴付ける方法に関する情報を提供します。生化学的アプローチ。
免疫蛍光によるB細胞のイメージングは、B細胞活性化時にISに募集されるセントロソーム、ゴルジ装置、リソソームなどのオルガネラのダイナミクスに従うことを可能にします。これらの小器官の分極をISに測定し、異なる条件下で比較する定量的パラメータを得ることができます。図1Aに示すように、セントロソームとゴルジ装置は、B細胞活性化時にISに募集される。BCR-リガンドで刺激されたB細胞では募集は認められなかった-BCR関与がISにセントロソームおよびゴルジ装置を動員するために必要であることを示す(図1A)。各小器官の極性指数を得るために、ISに近接する測定値として、オルガネラと細胞の中心との間の距離、ビーズ中心と細胞中心との間の距離、およびこれらの間の角度の3つの特徴を考慮しました。2 つのベクトル (図 1B)。このインデックスの範囲は-1 (対偏光) と 1 (完全に偏光、ビード上のオブジェクト) の範囲です。図1Cおよび1Dは、各オルガネラの極性指数が活性化の時間とプロットされるグラフを示す。免疫蛍光染色と一致して、セントロソームとゴルジ装置の両方は、活性化の長い時間ポイントでより正の極性指数を表示し、それらがISに徐々に募集される方法を反映する。このアルゴリズムは、1点に限定されたオルガネラに適用可能です。
また、リソソーム(図1E)のような分散分布を示すオルガネラの偏光を、前述の同じアルゴリズムを適用して定量化したが、リソソーム(図1F)。リソソームプールの極性指数は活性化時により正の値に達し、これはリソソームがB細胞活性化時にシナプスに向かって動員されていることを示す(図1G)。
我々はまた、シナプスインターフェース(ビーズ)とシナプスの近くにあるオルガネラの量と接触しているが、必ずしも接触していないオルガネラを決定するために2つのアルゴリズムを定義した。図2に示すように、シナプス界面に接触するリソソームを定量し、ビーズ領域のLAMP-1信号を細胞内の総蛍光とビーズ(図2B)で割った。ビード領域の直径によって、得られるパーセンテージの範囲が決まることを考慮することが重要です。例えば、表示される定量(図2B)では、直径3μmの円を描き、ビーズサイズ(3μm)を考慮した制限パラメータであるビーズで蛍光を測定します。このパラメータを使用して、結果は、リソソームがB細胞活性化時にシナプス界面に徐々に募集され、総質量の10〜15%に達することを示す(図2C)。示されているもう一つのアプローチは、シナプス領域へのリソソームの定量である。図2Dは、リソソームがISでリソソームの最大25%まで徐々に蓄積することを示している。全体的に、両方のタイプの解析を行うことにより、ISにおけるオルガネラの偏光およびドッキングを評価することができる。
B細胞活性化の間に、セントロソーム関連タンパク質のプールにおける変化が文書化されている5.例えば、B細胞活性化中にセントロソームでの関連を変化させるこれらのタンパク質の1つがアクチンである。この場合、アクチンはこの領域内で枯渇し、セントロソームが核から切り離され、IS5への偏光を促進する。ここでは、セントロソームにおけるアクチンの定量化と、B細胞活性化時のアクチンの枯渇方法を示す(図3)。関連するアクチンを定量するために使用されるセントロソーム領域を定義するために、この標識の蛍光強度をセントロソームを取り囲む同心円で測定した。半径は、標識の蛍光強度の少なくとも70%が維持される点に基づいて定義された(図3B)。このアプローチを用いて、図3Cに示すように、B細胞活性化時のセントロソームにおけるアクチン密度の低下を定量することができる。
IS界面におけるオルガネラの分布においてより高い分解能を得るために、抗原被覆カバースリップ、標識アクチン、ゴルジ装置および小虫網膜上のB細胞を活性化した(図4A)。ISにおけるオルガネラの分布は、中央および周辺領域にシナプス領域を潜り込むことで行うことができ、図4Bに示す基準を適用する。これは、BBCがこの中央領域内に集まることを示す以前の研究に基づいており、これはおそらく中央超分子活性化複合体(cSMAC)10,19に対応する可能性が高い。図4Aは、ゴルジ装置や小プスミック網膜などのISに募集されたオルガネラが反対分布を示していることを示す。実際、その分布指数は、図4Cに示す免疫蛍光染色と相関している。ゴルジ装置は正の値を示し、小和性網膜は負の値を示す一方で、ISの中心に集中していることを意味し、これは主にISの周辺領域に局在することを意味する。さらに、予め決定したシナプス領域の値をとることができますが、図4Dおよび4Eに示すように、B細胞活性化時の拡散領域を測定することができる。これらの結果は、前述の10,20として、B細胞活性化時の広がり領域の増加を示す。
ビーズアッセイと同様に、抗原被覆で活性化されたB細胞のXZ画像を撮り、Z次元全体でオルガネラ蛍光を測定することにより、免疫シナプスに向かうオルガネラの分布を決定することができる(図4F)。Z面におけるアクチンの蛍光強度を測定し、図4FのXZ平面で表されているように、シナプス界面におけるアクチンの進行性濃縮(画分1および2)が観察できる(図4G)。
B細胞イメージング解析に加えて、セントロソーム関連タンパク質を定量するためにセントロソーム富率の単離を行った(図5A)。このアプローチは、B細胞におけるIS形成の研究を補完するために重要であり得、中心論者がシナプス膜に偏光し、抗原抽出および提示21に関与するリソソームの人身売買を調整することが示されたことを考えると。この方法は、以前に大量の細胞(1 x 109細胞)17、18を使用して説明しましたが、我々は、細胞の量を減らし、より少量を使用して行うことができる簡略化されたバージョンを標準化しました超遠心管(2-3 mL)。図5Bに示すように、免疫ブロッティングによって異なる細胞画分を分析し、ガンマチューブリン染色によりセントロソームが豊富な画分に対応するものを決定しました。ここでは、以前に報告されたActinおよびArp2などのセントロソームでの蓄積の変化を受けるタンパク質の例を示す。
図 1:ISに向かうオルガネラの分極(A) BCR-リガンド+(0、30、60および120分)またはBCR-リガンドビーズ(120分)でインキュベートしたIIA1.6 B細胞におけるゴルジ装置(Rab6a)および微小管(α-tubulin)の免疫蛍光染色。矢印はセントロソームを示します。BF = 明るいフィールド。スケールバー = 3 μm. (B) ISに向かうオルガネラ(セントロソームまたはゴルジ装置)の極性指数を計算する方法を示すスキーム。a = 細胞の中心 (CC) からオルガネラまでの距離。b = CC とビード中心 (BC) までの距離。(C, D)活性化の異なる時点におけるオルガネラの極性指数を示す代表的なドットプロット。各ドットは 1 つのセルを表します。(E) BCR-リガンド+(0、30、60および120分)またはBCR-リガンドビーズ(120分)でインキュベートしたB細胞におけるリソソーム(Lamp1)の免疫蛍光染色。BF = 明るいフィールド。スケールバー = 3 μm. (F)スキームリソソームの極性指数の計算方法を表す。a = CC からマス中心(MC)までの距離。b = CC から BC までの距離。(G)活性化の異なる時点におけるリソソームの極性指数を示す代表的なドットプロット。各ドットは 1 つのセルを表します。シダックのポストテストを伴う2ウェイANOVAを行った。SEM を持つ手段が表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:ISにおけるリソソームの蓄積(A) BCR-リガンド+(0、30、60および120分)またはBCR-リガンドビーズ(120分)でインキュベートしたB細胞におけるリソソーム(Lamp1)の免疫蛍光染色。BF = 明るいフィールド。スケールバー = 3 μm. (B) ビーズとシナプス領域におけるリソソームなどのオルガネラの蓄積を計算する方法を示すスキーム。全細胞の蛍光(WCF)、ビーズ蛍光(BF)およびシナプス領域蛍光(SAF)が示される。(C, D)ビーズおよびシナプス領域におけるリソソームの蓄積のための代表的な棒グラフ。N = 1。20 > セル。シダックのポストテストを伴う2ウェイANOVAを行った。SEM を持つ手段が表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:IS形成中のセントロソームにおけるアクチンの定量(A) BCR-リガンド+(0および60分)またはBCR-リガンドビーズ(0および60分)でインキュベートしたB細胞におけるアクチン(ファロイジン)および微小管(α-Tubulin)の免疫蛍光染色。矢印の頭は、セントロソームを示します。スケールバー = 3 μm(B)Centrosome 関連コンポーネントの募集または枯渇を計算する方法を示すスキーム。セントロソーム領域は、最大蛍光の少なくとも70%を維持する半径(X μm)を使用して計算されます。(C)活性化(BCR-リガンド+)および非活性化(BCR-リガンド-)条件下でセントロソームでアクチンを示す代表的なドットプロット。N = 1。15 > セル。シダックのポストテストを伴う2ウェイANOVAを行った。SEM を持つ手段が表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:シナプス界面における細胞成分の分布(A)アクチン(ファロイジン)、小胞体(Sec61a)、ゴルジ装置(KDELR-DN-GFPを移植したKDEL受容体の陰性支配剤をトランスフェクトし、ゴルジに局所する)の免疫蛍光染色。B細胞を60分間BCR-リガンド+で被覆したカバーリップに播種したBF=明るいフィールドを用いた。スケールバー = 5 μm(B)ISの中心における細胞の広がり領域とオルガネラの募集を決定する方法を示すスキーム。スキームでは、CAは皮質アクチンによって区切られた細胞領域を示し、CCAは中心細胞領域を示す。(C) ゴルジ装置およびISにおける小和性網膜分布は、値>0がISの中心に濃縮を示し、<0が周辺分布を示す棒グラフで表される。N = 1。20 > セル。SEM を持つ手段が表示されます。(D) アクチン(ファロイジン)に標識されたB細胞の代表的な画像は、異なる時点(0、30、60分)でAg被覆カバースリップ上で活性化され、XZおよびXY平面を示す。(E)E(F)におけるB細胞の拡散領域を示すグラフは、Z平面における対象信号の分布、およびZ分数当たりのプロットを決定する方法を示すスキームである。四角形は IS インターフェイスを示します。(G)各Z分数に対する蛍光分布のパーセンテージの線プロットで表されるZ平面を横切るアクチンの分布。四角形は IS インターフェイスを表します。N = 1。25 > セル。SEM を持つ手段が表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:セントロソームはB細胞の分数を濃縮した。(A) スクロース勾配超遠心分離によるセントロソーム富率を得る方法のワークフロー。(B)安静および活性化B細胞から得られた分画の免疫ブロット(60分)。セントロソームが豊富な画分はγ-チューブリンで標識することによって検出され、破線の長方形(画分6~8)内に示されます。セントロソーム関連タンパク質(アクチンおよびArp2)は、活性化および安静条件においてセントロソームが豊富な画分で示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、Bリンパ球がISの形成を促進するために細胞内アーキテクチャを再編成する方法を研究する包括的な方法を説明する。本研究では、B細胞活性化時のセントロソーム、ゴルジ装置、リソソームなどのオルガネラの細胞内分布を定量化するイメージング技術の使用と、それらがISに偏光する方法を含む。さらに、B細胞活性化時のセントロソーム組成の変化を研究するための生化学的アプローチについて述べた。
B細胞におけるISの形成を促進するために、前者は細胞骨格の再配置と小器官の離散的接触部位の確立を引き起こすので、可溶性免疫複合体の代わりに固定化抗原(抗原被覆ビーズ)を使用した。偏光は容易に研究することができる。イメージングB細胞活性化の重要な側面は、サンプルの調製である。すべての画像取得は理想的には1:1細胞:ビーズ比を得るべきであり、抗原接触のユニークな部位への小器官の偏光を定量する。しかし、場合によってはB細胞が2つ以上のビーズを捕捉できるため、抗原の1部位を選択することが困難になります。ビーズ凝集体の形成を避けるためには、細胞に添加する前に抗原結合ビーズを徹底的に渦にすることが重要です。また、免疫蛍光実験では、画像解析中の誤解を避けるために、複数のビーズを捕捉する定量細胞から除外することをお勧めします。サンプルの調製のもう一つの重要なステップは固定/透過状態である。例えば、小タノールで細胞を固定して微小管染色を最適化し、ファロイジン染色に対して4%のPFAを最適化することをお勧めします。アクチン細胞骨格および微小管を同時に標識する場合、代替は、微小管染色と組み合わせてLifeAct-GFP/RFP発現プラスミドで細胞をトランスフェクトすることによってアクチンプールに標識することができる。セントロソームおよび他の細胞内小器官の偏光を定量するために用いられる画像集録は、エピ蛍光顕微鏡で行うことができる。しかしながら、異なるZ平面で正確な定量を得るためには、例えば広がりアッセイにおいて、共焦点顕微鏡検査が必要である。
ここで説明するセントロソーム単離プロトコルの場合、重要なステップは、免疫ブロトによってタンパク質を定量することができる適切な量のサンプルを得ることである。B細胞は大きな核を有し、その細胞質は総細胞体積の30%未満であることを考えると、細胞質タンパク質のより高い収率を得ることは困難であり得る。このため、セントロソーム単離には、各活性化時間ポイントに約 20 x 106 B セルを使用することをお勧めします。
これらの方法の重要な制限は、抗原共役ビーズによる活性化は、表面連結抗原が生体内のB細胞に提示される環境の複雑さを含まないということです。この制限は、細胞質および細胞外マトリックスの成分などの他の共刺激因子と培養またはビーズを補うことによって対処することができる。ただし、結果を正しく解釈するには、このような場合に適切なコントロールを使用することが重要です。
本研究で提示される方法の重要性は、(1)小器官の分極とその分布、(2)セントロソームにおけるタンパク質組成の変化というB細胞免疫シナプスの研究に用いられる統合的アプローチに依存する。このプロセスで生成される大量の細胞と、このプロセスで生成される大量のデータが必要なため、この研究で提示される異なる定量アルゴリズムは、細胞イメージングの分析を容易にします。さらに、細胞偏光に使用されるアルゴリズムは、繰り返しタスクを減らし、時間を節約するのに便利なツールであるImageJのMACROS関数によって自動化することが容易です。
これらの実験手順は、特定の細胞機能を達成するために偏光型を確立する他のタイプの細胞に外挿することができる。さらに、これらのプロトコルは、他のアッセイ、例えば、セントロソーム富率画におけるキナーゼまたはプロテアーゼなどの関連タンパク質の活性を含むことによって最適化することができる。全体的に、これらの研究は、細胞極性の確立を調節する細胞シグナル伝達および分子経路に機械的洞察を提供することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
M.-I.Y.は、FONDECYT#1180900からの研究助成金によって支援されています。J.I.、D.F.、J.L.は、コミシオン・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジアのフェローシップによって支援されました。私たちは、ビデオの録画と編集のためにポンティフィシア大学カトリカデチリからデビッド・オソリオに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
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