Summary
ويستخدم هذا البروتوكول تفاعلاً متسلسلاً للبوليميراز في الوقت الحقيقي القائم على المسبار، ومسباراً من نوع سولفورهوامين B (SRB)، واستنساخ 3 مناطق غير مترجمة (3' UTR)، وإمكانية اختبار لوسيفيراز للتحقق من الجينات المستهدفة لميرنا ذات الأهمية ولفهم وظائف الميرنا.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs التنظيمية الصغيرة التي يتم التعرف عليها لتعديل العديد من مسارات الإشارات داخل الخلايا في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان. وتتفاعل هذه التقييمات التنظيمية الصغيرة أساساً مع المناطق غير المترجمة البالغ عددها 3 مناطق (3' من جمهورية ترانسبورت) من الرسل المستهدفين (mRNAs) مما أدى في نهاية المطاف إلى تثبيط عمليات فك رموز الـ mRNAs وزيادة تحلل الحمض اتّصال اتّصاليّة الهدف. استناداً إلى مستويات التعبير والوظائف داخل الخلايا، miRNAs قادرة على أن تكون بمثابة عوامل تنظيمية من mRNAs oncogenic والورم المثبطة. تحديد الجينات المستهدفة حسن النية من ميرنا بين مئات أو حتى الآلاف من الأهداف المتوقعة حسابيا هو خطوة حاسمة لتمييز الأدوار والآليات الجزيئية الأساسية لميرنا من الفائدة. تتوفر العديد من برامج التنبؤ بالأهداف miRNA للبحث عن تفاعلات ميرنا-ميرنا المحتملة. ومع ذلك، فإن السؤال الأكثر تحديا هو كيفية التحقق من صحة الجينات المستهدفة المباشرة من ميرنا ذات الفائدة. يصف هذا البروتوكول استراتيجية قابلة للاستنساخ من الأساليب الرئيسية حول كيفية تحديد أهداف ميرنا المتعلقة بوظيفة ميرنا. يقدم هذا البروتوكول دليلاً عملياً على الإجراءات خطوة بخطوة للكشف عن مستويات ميرنا، والوظائف، وما يتصل بها من mRNAs الهدف باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على المسبار في الوقت الحقيقي (PCR)، اختبار sulforhodamine B (SRB) بعد اختبار محاكاة ميرنا للانف ، توليد منحنى الجرعة والاستجابة، والاختبار لوسيفيراز جنبا إلى جنب مع استنساخ 3 'UTR من الجين، وهو أمر ضروري لفهم صحيح لأدوار miRNAs الفردية.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs التنظيمية الصغيرة التي تعدل بشكل رئيسي عملية ترجمة وتدهور RNAs رسول (mRNAs) عن طريق الرد على 3 'المناطق غير المترجمة (3' UTR) في الجينات المستهدفة حسن النية1. ويمكن تنظيم التعبير عن الـ miRNAs من خلال آليات النسخ وما بعد النسخ. عدم التوازن في هذه الآليات التنظيمية يجلب مستويات التعبير miRNAs غير المنضبط والمميزة في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطانات2. يمكن أن يكون لميرنا واحد تفاعلات متعددة مع mRNAs متنوعة. وفي المقابل، يمكن التحكم في الميرنا الفردية من قبل العديد من miRNAs. لذلك، تتأثر شبكات الإشارات داخل الخلايا بشكل معقد بـ miRNAs التي يتم من خلالها بدء الاضطرابات والأمراض الفسيولوجية وتدهورها2،3،4، 5 , 6.على الرغم من أن التعبير المتغير من miRNAs لوحظ في أنواع مختلفة من السرطانات، والآليات الجزيئية التي تعدل آداب الخلايا السرطانية جنبا إلى جنب مع miRNAs لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.
وقد أظهرت الأدلة المتراكمة أن الأدوار الأورامأو المثبطة للأورام من miRNAs تعتمد على أنواع السرطانات. على سبيل المثال، من خلال استهداف مربع forkhead o3 (FOXO3)، miR-155 يعزز انتشار الخلايا، والنقي، والمقاومة الكيميائية لسرطان القولون والمستقيم7،8. وعلى النقيض من ذلك، فإن تقييد غزو الخلايا الدبقية يسببه miR-107 عن طريق تنظيم البروتين المتجانس من الدرجة العصبية locus 2 (NOTCH2) التعبير9. تقييم التفاعلات ميرنا الهدف فيما يتعلق وظائف ميرنا هو جزء لا غنى عنه لفهم أفضل كيف miRNAs تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة في كل من الدول الصحية والمرضى10. وبالإضافة إلى ذلك، فإن اكتشاف هدف (أهداف) حسن النية من miRNAs يمكن أن توفر كذلك استراتيجية دقيقة لضبطها لعلاج يستند إلى ميرنا مع مختلف الأدوية المضادة للسرطان. ومع ذلك، فإن التحدي الرئيسي في مجال التقييمات الوطنية للجمهورية الإسلامية هو تحديد الأهداف المباشرة للجمهورية. هنا، يتم تقديم أساليب مفصلة كنهج تجريبية قابلة للاستنساخ لتحديد الجينات الهدف ميرنا. وينطوي التصميم التجريبي الناجح لتحديد هدف ميرنا علىخطوات واعتبارات مختلفة (الشكل 1). مقارنة مستويات ميرنا الناضجة في الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية يمكن أن تكون واحدة من الإجراءات الشائعة لاختيار ميرنا ذات الأهمية (الشكل1A). الدراسة الوظيفية لميرنا مختارة للكشف عن آثار ميرنا على انتشار الخلايا من المهم لتضييق قائمة أفضل الأهداف المرشحة المحتملة من ميرنا ذات الفائدة (الشكل1B). واستناداً إلى الوظائف التي تم التحقق من صحتها تجريبياً لـ miRNAs، يلزم إجراء مراجعة منهجية للمؤلفات وقاعدة البيانات في الشركة التي لها برنامج التنبؤ المستهدف بالحمض النووي الريبي (MIRNA) للبحث عن المعلومات الأكثر صلة بوظائف الجينات (الشكل1C). ويمكن تحقيق تحديد الجينات المستهدفة الحقيقية لميرنا ذات الأهمية من خلال تنفيذ تجارب مثل اختبار لوسيفيراز جنبا إلى جنب مع استنساخ 3 'UTR من الجينات، PCR في الوقت الحقيقي، والنشاف الغربي (الشكل1D). والهدف من البروتوكول الحالي هو توفير أساليب شاملة للتجارب الرئيسية، وتفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على المسبار في الوقت الحقيقي، والاختبار بسولفورهوامين B (SRB) بعد أن تحاكي ميرنا عمليات الانحراف، وتوليد منحنى الجرعة والاستجابة، و لوسيفيراز اختبار جنبا إلى جنب مع استنساخ 3 'UTR من جين. البروتوكول الحالي يمكن أن تكون مفيدة لفهم أفضل لوظائف miRNAs الفردية والآثار المترتبة على ميرنا في علاج السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ناضجة ميكرورنا (ميرنا) تحليل التعبير
-
ناضجة ميرنا الحمض النووي التكميلي (cDNA) التوليف
- إضافة 254 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي و 4.5 ميكرولتر من خليط ديوكسيريبونوكليس الأول (DNase I)، ثم إضافة المياه النقية جداً في أنابيب قطاع PCR لتعويض ما يصل إلى 18 ميكرولتر (الشكل2A). إعداد رد الفعل لكل عينة RNA مجموع تنقية من عدة خطوط الخلية باستخدام كمية كافية من خليط DNase الأول على أساس العدد الإجمالي من ردود الفعل.
ملاحظة: تتكون خلائط DNase I من DNase I (1.8 ميكرولتر)، ومثبط اتّصال الريبونوكليس (0.3 ميكرولتر)، و25 ممغكل2 (2.4 ميكرولتر). ولشراء الحمض النووي الريبي الكلي، تم تطبيق طريقة استخراج تستند إلى العمود بدلاً من استخدام طريقة استخراج تعتمد على الفينول الكلوروفورم. وأفيد بأن غلة استخراج بعض miRNAs يمكن أن تختلف اعتمادا على عدد الخلايا عند استخدام طريقة استخراج الفينول الكلوروفورم القائم11،12. - احتضان الأنابيب في دورة الحرارية. تشغيل الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية، وتعطيل الحرارة DNase الأول من قبل 5 دقيقة الحضانة في 90 درجة مئوية. على الفور وضع الأنابيب على الجليد بعد الحضانة.
- نقل 7.1 ميكرولتر من DNase عالجت الجيش الملكي النيبالي الكلي في 2 مجموعات من الأنابيب الجديدة ومن ثم إضافة 1.5 ميكرولتر من التمهيديات المضادة للتحسس لجين غليسيرالدهايد-3-فوسفات dehydrogenase (GAPDH) (الشكل2B).
ملاحظة: يصبح المبلغة من [رنا] إجماليّة ل [كدن] تأليف 100 [نغ] في هذا خطوة. تركيز المخزون من المواد التمهيدية المضادة للحاسة GAPDH هو 10 μM. إضافة المبادئ التمهيدية المضادة للتحسس GAPDH هو لتوليد cDNAs GAPDH باستخدام طريقة التمهيدي الجينات محددة. - احتضان الأنابيب باستخدام دورة الحرارية. تبدأ في 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تليها رد الفعل في 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 3.4 ميكرولتر من النسخ العكسي (RT) خليط إنزيم في كل رد فعل (الشكل2B). تتكون خلائط إنزيم RT من 100 m deoxyribonucleotide triphosphates (0.15 μL)، 10X RT العازلة (1.5 ميكرولتر)، مثبطات الريبونوكليس (0.75 ميكرولتر)، وإنزيم النسخ العكسي (1 ميكرول). إعداد كمية كافية من الخلائط على أساس العدد الإجمالي من ردود الفعل.
- إضافة 3 ميكرولتر من 5X RT التمهيديات لميرنا محددة في كل رد فعل (الشكل2B).
ملاحظة: الحجم الإجمالي هو 15 درجة مئوية لكل رد فعل. - تشغيل الأنابيب باستخدام دورة الحرارية. تبدأ عند 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها رد الفعل عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وأخيراعند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يتم إنشاء cDNAs واحد الذين تقطعت بهم السبل في هذه الخطوة لكل من الجين ميرنا محددة وGAPDH في نفس الأنبوب.
- إضافة 254 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي و 4.5 ميكرولتر من خليط ديوكسيريبونوكليس الأول (DNase I)، ثم إضافة المياه النقية جداً في أنابيب قطاع PCR لتعويض ما يصل إلى 18 ميكرولتر (الشكل2A). إعداد رد الفعل لكل عينة RNA مجموع تنقية من عدة خطوط الخلية باستخدام كمية كافية من خليط DNase الأول على أساس العدد الإجمالي من ردود الفعل.
-
تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR) وتحليل البيانات
- تمييع كل cDNA بالماء النقي بنسبة 1:49.
- إعداد مخاليط التفاعل لميرنا محددةوGAPDH (الجدول 1). للكشف عن ميرنا محددة وGAPDH، إعداد ردود الفعل الثلاثية لكل عينة cDNA.
- إجراء تحليل PCR والبيانات في الوقت الحقيقي (الشكل2C). تحليل البيانات باستخدام طريقة CT المقارنة13،14.
2. ميكرورنا (ميرنا) تقليدترانسفيكأيشن
ملاحظة: يتم تحديد miRNA-107 من الخطوة 1. منذ ميرنا-107 هو أسفل تنظيم في الخلايا السرطانية مقارنة مع الخلايا العادية، ويمكن التكهن بأن ميرنا-107 هو ميرنا قمعالورم. في حالة ميرنا التي يتم تنظيمها في الخلايا السرطانية مقارنة مع الخلايا الطبيعية (على سبيل المثال،ميرنا-301) ، يمكن تطبيق oligonucleotides المضادة للتحسس ضد ميرنا-301 للخطوات 2 و 3 و 4.
- عد الخلايا مع جهاز غرفة العد ولوحة الخلايا في لوحة 96 جيدا. كثافة الخلايا هي 2 × 103 خلايا / 100 ميكرولتر لكل بئر. لا تستخدم وسائط ثقافة الخلية التي تحتوي على البنسلين-ستربيماتسين (P/S) لأن P/S يمكن أن تقلل من كفاءة التغوط.
-
إعداد مجموعة من خليط التغوط لنقل الخلايا في عدة تركيزات نهائية من محاكاة التحكم ميرنا ومحاكاة ميرنا-107 في اليوم التالي (الشكل3).
- من المخزون (تركيز 25 درجة مئوية) من محاكاة التحكم ميرنا أو ميرنا-107 تقليد، تخفيف وإضافة كمية المقابلة من محاكاة السيطرة أو ميرنا-107 تقليد في وسائل الإعلام انخفاض المصل جنبا إلى جنب مع كاشف التغوط باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (الشكل3A). يُمزج القلة التي تحتوي على خلائط بلطف باستخدام الميكرومابيت. يجب أن يكون المبلغ الإجمالي للقلة (ميرنا تقليد السيطرة + ميرنا-107 تقليد) نفسه في كل بئر. وتشمل الآبار الفارغة 100 درجة مئوية من وسائل الإعلام ثقافة الخلية ووسائط المصل المنخفض التي تحتوي على كاشف التغوط دون خلايا.
- بعد 10 دقائق الحضانة في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وخلط بلطف oligo تحتوي على المخاليط مرة أخرى ثم إضافة 50 درجة مئوية من المخاليط في كل بئر. الحفاظ على الخلايا المنقولة في حاضنة ثقافة الخلية. استبدال كاشف التغوط التي تحتوي على وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية الطازجة التي تحتوي على كل من المصل البقري الجنيني (FBS) و P / S بعد 6-12 ح الحضانة. مزيد من احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة. مدة العلاج الإجمالية لتقليد ميرنا هي 96 ساعة.
3- سفورهودومين ب (SRB)
-
تثبيت الخلايا
- إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية في كل بئر من لوحة وملء على الفور 100 درجة مئوية من حمض ثلاثي كلورو الخليك 10٪ (TCA) في كل بئر. يستنشق بعناية وسائل الإعلام ثقافة الخلية من كل بئر لتجنب أي تلف الخلية والانفصال من القاع.
ملاحظة: إعداد 40٪ TCA عن طريق إضافة 20 غرام من مسحوق TCA في 50 مل من الماء المقطر. من 40٪ TCA، وجعل 10٪ TCA عن طريق تخفيف 40٪ TCA مع الماء المقطر بنسبة تخفيف 1:3. - احتفظ باللوحة التي تحتوي على 10% TCA في ثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة ساعة واحدة.
- غسل لوحة عدة مرات عن طريق الغمر في حوض المياه وتجفيفها. إزالة المياه الزائدة من داخل الآبار عن طريق النقر على لوحة حتى لا يكون هناك ماء في الآبار. ترك لوحة على مقاعد البدلاء المختبر لتجفيفه قبل الذهاب إلى الخطوة التالية.
- إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية في كل بئر من لوحة وملء على الفور 100 درجة مئوية من حمض ثلاثي كلورو الخليك 10٪ (TCA) في كل بئر. يستنشق بعناية وسائل الإعلام ثقافة الخلية من كل بئر لتجنب أي تلف الخلية والانفصال من القاع.
-
تلطيخ الخلايا
- ماصة 50 درجة مئوية من 0.4٪ SRB الحل في كل بئر بما في ذلك الآبار الفارغة. هز الصحن بلطف حتى يغطي حل SRB بنسبة 0.4% باستمرار الجزء السفلي من الآبار.
ملاحظة: إعداد واستخدام 0.4٪ SRB الحل عن طريق إضافة 0.4 غرام من مسحوق SRB في 100 مل من حمض الخليك 1٪. هز الحل بعناية لخلطه. التفاف زجاجة من 0.4٪ حل SRB في مادة واقية خفيفة مثل رقائق الألومنيوم. تخزين 0.4٪ SRB الحل في الثلاجة. - بعد الحضانة لمدة 40 دقيقة إلى 60 دقيقة، وغسل لوحة عن طريق الرينمنة مع 1٪ حمض الخليك. غسل لوحة حتى يتم غسلها تماما صبغة غير منضم بعيدا (الشكل3B).
- ترك لوحة على مقاعد البدلاء المختبر لتجفيفه قبل الذهاب إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: يجب أن يتم تجفيف اللوحة بالكامل قبل الذهاب إلى الخطوة 3.3.
- ماصة 50 درجة مئوية من 0.4٪ SRB الحل في كل بئر بما في ذلك الآبار الفارغة. هز الصحن بلطف حتى يغطي حل SRB بنسبة 0.4% باستمرار الجزء السفلي من الآبار.
-
قياس الامتصاص
- ماصة 100 درجة مئوية من حل قاعدة تريس (10 MM) في الآبار المقابلة بما في ذلك الآبار الفارغة. الحفاظ على لوحة على شاكر لمدة 10 دقيقة.
4. توليد منحنى الجرعة والاستجابة
- تحليل بيانات SRB في جدول بيانات. طرح الامتصاص الفارغ من قيم الامتصاص لكل مجموعة وحساب متوسط (AVE) والانحراف المعياري (STD) لقيم الامتصاص لكل مجموعة.
- حساب النسبة المئوية لمتوسط الامتصاص (AVE) والانحراف المعياري (STD)( لكل مجموعة باستخدام قيم امتصاص SRB.
ملاحظة: AVE٪ من التحكم ميرنا تقليد المجموعة المعالجة هو 100٪. حساب STD٪ باستخدام الصيغة التالية: STD٪ = (STD من كل مجموعة / AVE امتصاص السيطرة تقليد المجموعة المعالجة) × 100. - استيراد البيانات الخام بما في ذلك تركيزات العلاج، AVE٪، وSTD٪ في البرنامج عن طريق محاذاة عموديا تلك البيانات. بما أن السجل 0 غير معرّف، قم بتعيين التركيز الأول للمحورX إلى قيمة قريبة من 0 (على سبيل المثال ، 0.01).
- انقر فوق إنشاء علامة التبويب الرسم البياني واختر أشرطة خطأ مبعثر بسيطة. حدد أعمدة ورقة العمل كقيم رموز وانقر فوق التالي. في لوحة تنسيق البيانات، حدد أزواج XY وانقر فوق التالي. حدد أعمدة البيانات المقابلة في لوحة البيانات المحددة. انقر فوق الزر إنهاء لإنشاء المؤامرة.
ملاحظة: يمثل المحور س التركيزات، ويشير محور ص إلى النسبة المئوية لمتوسط امتصاص كل تركيز (AVE)، وتشير أشرطة الخطأ إلى النسبة المئوية للانحراف المعياري لكل تركيز (STD%).. - انقر نقراً مزدوجاً فوق المحور X لتعديل نوع المقياس وتحجيم المحور. تغيير نوع المقياس من خطي إلى سجل. تعديل رقم نطاق البدء والنهاية إلى 0.01 و 200 على التوالي.
-
انقر بزر الماوس الأيمن على أي مؤامرة مبعثر، واختيار منحنى صالح، انتقل إلى الفئة الفرعية المعرفة من قبل المستخدم. حدد منحنى استجابة الجرعة، انقر فوق الأزرار التالية، ثم انقر فوق الزر إنهاء. يتم الآن إنشاء منحنى الجرعة استجابة جنبا إلى جنب مع علامة التبويب تقرير (الشكل4A).
- لإدخال المعادلة 1 في البرنامج لإنشاء منحنى استجابة الجرعة، انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد معالج الانحدار. انتقل إلى معرفة المستخدم في فئة المعادلة ثم انقر فوق الزر جديد. إدراج المعادلة 1 والمتغيرات والمعلمات الأولية والقيود في مربعات فارغة المقابلة (الشكل4B،C). انقر فوق إضافة كزر وتعيين اسم المعادلة كمنحنى استجابة الجرعة. يتم الآن إنشاء اسم المعادلة في الفئة الفرعية المعرفة من قبل المستخدم في فئة المعادلة. (و) يشير إلى النسبة المئوية لصلاحية الخلية (% من صلاحية الخلية) في المعادلة 1.
المعادلة 1
- انتقل إلى علامة التبويب التقرير ثم تحقق من قيم n و k و R.
ملاحظة: يشير y0 إلى قدرة الخلية على البقاء بنسبة 100% من مجموعة محاكاة التحكم في ميرنا، n تشير إلى معامل من نوع التل (منحدر قطعة الأرض)، ك يشير إلى تركيز محاكاة ميرنا-107 التي تنتج 50٪ من تأثير تقليد ميرنا-107 الأقصى (النصف التركيز المثبط القصوى، IC50)،وR يشير إلى الكسر المتبقية غير المتأثرة (كسر المقاومة)15. المعادلة المستخدمة لتوليد منحنى الجرعة استجابة تعترف النطاق من قيمة y0 إلى R (إن وجدت) كما 100٪ (الشكل4A). لذلك، من الضروري الحصول على قيمة k المعدلة (IC50)التي يتم حسابها على أساس النطاق من y0 إلى قيمة صفر (الشكل4A). يمكن الحصول على k المعدلة (IC50)جنبا إلى جنب مع قيم ICx الأخرى (على سبيل المثال، IC10 إلى IC90)باستخدام المعادلة 2، المستمدة من المعادلة 1. وترد اشتقاق المعادلة 2 من المعادلة 1 في الشكل التكميلي1.
المعادلة 2
- انقر نقراً مزدوجاً فوق زر الماوس الأيسر على الخلية التي يتم تطبيق المعادلة 2. باستخدام المعادلة 2 والمعلمات من منحنى الجرعة استجابة ولدت، فإنه متاح لحساب القيم المعدلة من ICx، تتراوح بين IC10 إلى IC90 (الشكل4D).
- أدخل علامة المساواة متبوعة بالصيغة التي تبدأ بقوس في الخلية. عند إدخال الصيغة، قم بإصلاح قيمة n و k و R كمراجع مطلقة للخلايا عن طريق إضافة علامة الدولار إلى العمود والصف المقابلين، بحيث لا يتم تغيير هذه القيم الثابتة عند ملء الصيغة تلقائيًا إلى الصفوف (الشكل 4D). بدلاً من ذلك، يمكن حساب القيم المعدلة يدوياً باستخدام المعادلة 2.
ملاحظة: لم يتم تحديد قيمة IC90 لأن قيمة R أكبر من 10. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت قيمة R أعلى من 20، لا يتم تحديد قيمة IC80 (الشكل4D).
5. التحقق من الجين المستهدف المباشر لـ MicroRNA ذات الأهمية
ملاحظة: بعد إجراء التجربة الوظيفية مثل اختبار SRB، يتم تأكيد ميرنا-107 كميرنا قمعية الورم وأنه من الممكن للغاية أن miRNA-107 تستهدف مباشرة oncogenes. تحقق من قائمة جميع الجينات المستهدفة المتوقعة باستخدام برنامج التنبؤ المستهدف miRNA مثل TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/)، ثم تضييق إلى أهداف المرشحين المحتملة استناداً إلى وظيفة الجين في قواعد البيانات بما في ذلك PubMed و بطاقات الجينات.
- التصميم التمهيدي لاستنساخ 3 'المنطقة غير المترجمة (UTR)
- ضع اسم الجين في بطاقات الجينات (https://www.genecards.org/) وانقر على رمز الجين. تقييم لمتصفح الجينوم Ensembl عن طريق النقر على معرف Ensembl من الجين ثم انقر فوق معرف النصوص في جدول النسخ. بعد ذلك، انقر فوق Exons موجود في قائمة الشاشات المستندة إلى النص على اليسار.
- نسخ تسلسل النيوكليوتيد من UTR 3 'ولصقه في برنامج التصميم التمهيدي. نسخ التسلسلات مرة أخرى من هذا البرنامج ولصقه في معالج النصوص. تحقق من وجود تسلسلات ربط ميرنا وكذلك وجود مواقع إنزيمات تقييدية تستخدم للاستنساخ.
ملاحظة: إذا لم تكن هناك مواقع التعرف على الإنزيمات المقيدة داخل UTR 3'، يمكن استخدام الإنزيمات المقيدة المحددة للاستنساخ للخطوة التالية. - في برنامج التصميم التمهيدي، قبول تسلسل UTR 3 'والبدء في تصميم التمهيديات إلى الأمام وعكس مع الشرط التالي. طول: 20-30 النيوكليوتيدات، Tm: 45-58 درجة مئوية، GC٪: 40-60٪. يجب أن يكون الفرق بين قيم Tm من التمهيديين أقل من 5 درجة مئوية. وترد التسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذه الدراسة في الشكل التكميلي2. إضافة تسلسل التعرف على الإنزيم تقييد فضلا عن 4 النيوكليوتيدات عشوائية إلى التمهيديات المصممة.
- PCR متدرجة
- إعداد 25 ميكرولتر من مخاليط تفاعل PCR بما فيذلك المواد التمهيدية المصممة لكل درجة حرارة صلب واحدة (الجدول 2). إعداد كمية كافية من الخلائط على أساس العدد الإجمالي من ردود الفعل. خلط الحل عن طريق الأنابيب وإضافة 25 درجة مئوية من مخاليط رد الفعل في كل أنبوب. طرد مركزي الأنابيب لبضع ثوان.
- تنفيذ 35-40 دورات PCR من خطوة denaturation إلى خطوة التمديد. إعداد دورة PCR على النحو التالي الخطوات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (1 دورة، خطوة تنشيط البوليمرات)، 95 درجة مئوية لمدة 10 ق (خطوة إزالة النقان)، 45 درجة مئوية-68 درجة مئوية لمدة 30 ق (خطوة الصلب)، 68 درجة مئوية (خطوة التمديد، 10 ق-1 دقيقة لكل 1000 نقطة أساس)، 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (خطوة إنهاء) ، وأخيراً تبرد إلى 4 درجة مئوية.
- تشغيل منتجات PCR والتحقق من العصابات على هلام أجاروز 1٪ مع سلالم الحمض النووي. العثور على أفضل درجة حرارة الصلب (الشكل5A). تضخيم 3 'UTR من الجين مرة أخرى باستخدام أفضل درجة حرارة الصلب للخطوة التالية.
- الهضم المزدوج
- جعل خليط رد الفعل بما في ذلك اثنين من الإنزيمات تقييد، XhoI (أو AsiSI) ونوتى، في أنبوب (الجدول3). احتضان المخاليط لمدة 3-4 ساعة باستخدام حمام مائي (37 درجة مئوية).
- تشغيل المنتجات هضم مزدوجة على هلام أجاروز 1٪ ومن ثم قطع العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في حالة ناقلات لوسيفيراز، قبل تشغيل على هلام، تتفاعل ناقلات هضم مزدوج ة مع 10 U من الفوسفاتات القلوية لمدة ساعة أخرى لمنع recircularization أثناء خطوة الربط.
- تنقية منتجات PCR مزدوجة هضمها وناقلات لوسيفيراز من العصابات المقتطعة.
- ربط منتجات PCR في ناقلات لوسيفيراز
- جعل 20 درجة مئوية من خلطات رد الفعلالربط بما في ذلك ligase الحمض النووي (الجدول 4).
ملاحظة: يمكن أن تكون نسبة الأضراس من المنتج PCR (إدراج) إلى متجه لوسيفيراز 3:1. 1:1 أو 2:1. - بإيجاز طرد مركزي الأنبوب ل 10-15 s وحضانة في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام دورة الحرارية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن احتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للربط. في هذه الخطوة، سيتم استنساخ إدراج PCR في المنطقة المتمركزة في المصب من الجينات مراسل رينيلا (الشكل5B). ربط miRNAs في UTR المستنسخة 3 'من الجينات يمكن أن تنخفض في نشاط رينيلا. اليراعة لوسيفيراز هو لتطبيع مستويات التعبير رينيلا.
- جعل 20 درجة مئوية من خلطات رد الفعلالربط بما في ذلك ligase الحمض النووي (الجدول 4).
- تحويل ومستعمرة [بّر]
- إضافة مخاليط الربط (3-5 درجة مئوية) في الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المختصة. اضغط بلطف على الأنبوب ويبقيه على الجليد (20 دقيقة).
ملاحظة: قم بإلغاء تجميد الخلايا المختصة على الجليد قبل إضافة خلائط الربط. - بسرعة وبلطف نقل الأنبوب إلى كتلة الحرارة. بعد صدمة الحرارة (42 درجة مئوية لمدة 30 ق-1 دقيقة)، وضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- نشر الخلايا المختصة على لوحة أجار لوريا-بيرتاني (LB). زراعة الخلايا المختصة في حاضنة (37 درجة مئوية) بين عشية وضحاها.
ملاحظة: Ampicillin (50-100 ميكروغرام / مل) موجود في لوحة أجار. - اختيار مستعمرة فردية وإعادة تعليق E. القولونية في واحدة من أنابيب 8-قطاع تحتوي على المياه فائقة النقية. كرر هذه الخطوة لإعادة تعليق E. القولونية من المستعمرات 4-8 مختارة عشوائيا (الشكل5C).
- نقل 25 ميكرولتر من تعليق القولونية E. في مجموعة أخرى من أنابيب 8-قطاع. الآن، هناك 2 مجموعات من أنابيب تعليق القولونية E.
ملاحظة: أنبوب واحد هو لPCR مستعمرة وآخر هو للتلقيح. E. تعليق القولونية للتلقيح يمكن تخزينها مؤقتا في 4 درجة مئوية (الشكل5C). - إجراء PCR المستعمرة باستخدام تعليق القولونية E. هذه الخطوة هي لتحديد ما إذا كانت المستعمرات تحتوي على إدراج. حدد أفضل المستعمرات لتلقيح وعزل ناقلات لوسيفيراز التي تأوي 3 ' UTR من جين (الشكل5C).
ملاحظة: كرر الخطوة 5.1-5.5 لكل 3 'UTR من الجينات المحددة. اتبع حالة تفاعل PCR الموضحة في الجدول 2 عن طريق استبدال الحمض النووي الجينومي بتعليق E. coli.
- إضافة مخاليط الربط (3-5 درجة مئوية) في الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المختصة. اضغط بلطف على الأنبوب ويبقيه على الجليد (20 دقيقة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن المهم أن يكون التأكيد الناجح والدقيق لمستويات ميرنا مهماً لتفسير البيانات التي يمكن من خلالها تصنيف الميرنا على أساس الأدوار المتوقعة لـ miRNAs في تطور المرض وتطوره. تم قياس مستويات ميرنا-107 وميرنا-301 في ثلاثة خطوط خلايا البنكرياس باستخدام PCR الكمي القائم على التحقيق. يمكن أن يزيد تركيب cDNAs لكل من ميرنا محددة وجين مرجعي في نفس التفاعل من إمكانية استنساخ البيانات. PANC-1 وCAPAN-1 هي خطوط الخلايا الانسدادي البنكرياسي البشري، في حين HPNE هو خط خلية قناة البنكرياس الخالدة الناجمة عن ناقلات التعبير الرجعية التي تأوي الجين النسخ العكسي (hTERT) التيلوميراز البشري(hTERT). تم تخفيض miRNA-107 بشكل كبير في PANC-1 وCAPAN-1 الخلايا مقارنة مع خلايا HPNE (الشكل2C). وكانت مستويات ميرنا-301 منظمة بشكل كبير في خلايا PANC-1 وCAPAN-1 مقارنة بخلايا HPNE. هذه النتائج هي وفقا للتقارير السابقة أن ميرنا-107 هو غير نشط جينيا في خلايا سرطان البنكرياس وأن مستويات ميرنا-301 هي أعلى في خلايا سرطان الغدة القناة البنكرياسية من الخلايا القنواتالبنكرياسية العادية16، 17.
إن التبيّاق 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl)-2,5-ثنائي الفينيل بروميد (MTT) يعكس أنشطة التمثيل الغذائي للخلايا. هذه الميزة لديها فرصة أعلى بكثير للحصول على عدم وجود ارتباط بين فحص MTT وإجمالي عدد الخلايا منذ ظروف الفحص بما في ذلك نوع من الكواشف العلاج يمكن أن تؤثر بشدة على الحد الأنزيمي من tetrazolium 18،19. وللتغلب على هذا القيد، طُبق تحليل سولفورهوامين باء (SRB) لقياس آثار ميرنا-107 على انتشار الخلايا لتحديد الوظائف البيولوجية المحتملة لـ miRNA-107. يمكن استخدام كمية صبغة SRB المقيدة في الخلايا الثابتة كبديل للتغيير في العدد الإجمالي للخلايا. ويبين هذا البحث في هذه الدراسة بوضوح أن انتشار خلايا PANC-1 انخفض بعد أنتحاكي ميرنا-107 التغوط (الشكل 3). تم تحديد تركيز ميرنا-107 الذي تسبب في تثبيط بقاء الخلايا بنسبة 50٪ (IC50) من خلال توليد منحنى الجرعة والاستجابة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطبيق المعادلة 2 مفيد لحساب جميع التركيزات المثبطة الممكنة (ICx) لتقييم آثار ميرنا-107 (الشكل4)بدقة .
فحص العلاقة بين مستويات miRNAs وmRNAs هو وسيلة فعالة لتحديد الهدف ميرنا لأن miRNAs يمكن أن تنظم مستويات الجينات المستهدفة عن طريق تدهور mRNAs2،20. ومع ذلك، بما أن miRNAs تعمل أيضا ً على مستوى الترجمة دون التأثير على عمليات تدهور الحمض النووي الريبي، فإن التحقق التجريبي من تفاعلات الجينات التي تستهدف ميرنا باستخدام اختبار لوسيفيراز هو خطوة أساسية. الميزة الرئيسية لفحص لوسيفيراز هو أن هذا الفحص يمكن أن يستبعد التغييرات في مستويات mRNA التي ينظمها تدهور mRNAs21. ولذلك، فإن استنساخ 3'UTR من الجينات المستهدفة المتوقعة هو خطوة هامة لتحديد الجينات المستهدفة الحقيقية من ميرنا ذات الأهمية جنبا إلى جنب مع التجارب PCR في الوقت الحقيقي ووصمة عار الغربية. يسمح الاستخدام الفعال لمتجهات المراسل المزدوج بالحصول على بيانات تجريبية لا لبس فيها لأن قياس مستويات مراسل التحكم يمكن أن يقلل من الاختلافات التجريبية مثل عدد الخلايا. وترد في الشكل 5Eعمليات تطبيع بيانات اختبار لوسيفيراز التي تم الحصول عليها من المتجهات التي تحتوي على 3'UTR من جين غاما سينوكلين (SNCG). وبالإضافة إلى ذلك، فإن فحص 11 الأهداف المتوقعة المحتملة من ميرنا-107 يبين بوضوح أن SNCG فقط، وهو منظم إيجابي لنمو الخلايا السرطانية22،23، يتفاعل مباشرة مع ميرنا-107 في خلايا PANC-1 (الشكل 6). وتشير هذه النتيجة إلى أن ميرنا-107 يمكن أن تنظم سلبا انتشار خلايا PANC-1 عن طريق تعديل تعبير SNCG.
الشكل 1: التصميم التجريبي لتحديد هدف ميرنا. يُظهر هذا الرسم التخطيطي تدفق تصميم تجريبي يساعد على تحديد هدف miRNA. (أ) تحليل مستويات التعبير ميرنا ناضجة واختيار ميرنا من الفائدة. (B) يمكن إجراء ثلاث تجارب، مثل ميرنا تقليد التغوط، والفحص SRB، وتوليد منحنى الجرعة استجابة للدراسة الوظيفية لmiRNAs مختارة. (C) لتضييق الجينات المستهدفة المرشح من ميرنا من الفائدة، فمن المفيد للتحقق من المعلومات وظيفة الجينات المستهدفة المتوقعة في برامج التنبؤ المستهدفة، Pubmed، وGeneCard. (د) بعد الكشف عن بعض الجينات المستهدفة المحتملة المرشح ة من ميرنا ذات الأهمية، فمن الممكن إجراء تجارب عملية مثل استنساخ 3 'UTR من mRNAs، لوسيفيراز اختبار، PCR في الوقت الحقيقي، ووصمة عار الغربية لإثبات الهدف المباشر في نهاية المطاف جينات ميرنا من الفائدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل تعبير ميرنا ناضجة. (أ) إضافة الجيش الملكي النيبالي من كل خط الخلية (PANC-1، CAPAN-1، وHPNE)، خليط DNase I، والمياه النقية للغاية في أنابيب الشريط المسمى. الحجم الإجمالي في كل أنبوب هو 18 درجة مئوية (PANC-1 وCAPAN-1 هي خطوط خلايا سرطان البنكرياس، في حين HPNE هو خط خلية قناة البنكرياس العادي). (ب) نقل 7.1 ميكرولتر من DNase أنا عالجت الخلائط في 2 مجموعات من أنابيب الشريط الجديدة، و 1.5 ميكرولتر من التمهيديات المضادة للتحسس لجين GAPDH يضاف أيضا في كل أنبوب. حضانة PCR قطاع أنابيب في ظروف رد الفعل المشار إليها. بعد ذلك، أضف مخاليط إنزيم RT و5x RT التمهيديات لميرنا محددة (ميرنا-107 أو ميرنا-301) في أنابيبها المعينة، ومن ثم إعادة احتضان الأنابيب في الظروف المشار إليها. يتم إنشاء cDNAs واحد الذين تقطعت بهم السبل لميرنا محددة وGAPDH. (C) تم تحديد مستويات ميرنا-107 وميرنا-301 الناضجة من قبل PCR في الوقت الحقيقي القائم على التحقيق باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي المعزول من PANC-1، CAPAN-1، وخلايا HPNE. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقليد الانف وSRB Asay. (أ) تظهر اللوحة العليا تمييع محاكاة التحكم في ميرنا ومحاكاة ميرنا-107 لإعداد خلائط التغوط. نطاق التركيزات النهائية من ميرنا-107 تقليد هي 0 nM، 1 nM، 5 nM، 10 nM، 25 nM، 50 nM، و 100 nM. الحجم الإجمالي في كل عمود هو لتبديل الخلايا في بئر واحد من لوحة 96 جيدا. وتظهر اللوحة السفلية مثالاً على توسيع نطاق خلائط التغوط العابر لإعداد كمية كافية من المخاليط لتصريف الخلايا في 4 آبار بتركيز مبين. بعد ذلك، إضافة 50 درجة مئوية من المخاليط في كل بئر باتباع الشكل المقترح للتحكم ميرنا transfecting تقليد مع ميرنا-107 تقليد. تم استخدام هذه اللوحة لاختبار SRB، والتي تشمل تثبيت الخلايا، وتلطيخ الخلايا، وقياس الامتصاص. (B) صورة فعلية للوحة 96 جيدا تظهر الخلايا الملونة SRB. تظهر هذه الصورة بوضوح أن عدد خلايا PANC-1 ينخفض مع زيادة تركيز miRNA-107. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توليد منحنى الاستجابة للجرعة. (أ) منحنى الجرعة والاستجابة التمثيلية لخلايا PANC-1 المنكرة. كما تم احتضان الخلايا المنقولة باستمرار لمدة 96 ح. كما تظهر المعلمات التي تم شراؤها من منحنى الجرعة والاستجابة. (ب) المعادلة والمتغيرات والمعلمات الأولية والقيود، إلى جانب وصف التعاريف والقيم. (C) إدراج التعاريف والقيم في اللوحات المقابلة في البرنامج. تشير "f" إلى نسبة صلاحية الخلية (على سبيل المثال، قيمة "f" هي "90" و"10" في IC10 وIC90على التوالي). قيمة y0 هي 100 ويشير إلى صلاحية الخلية 100٪ من التحكم ميرنا تقليد الخلايا المنقولة. يشير "n" إلى معامل من نوع التل (ميل قطعة الأرض). يشير "k" إلى تركيز ميرنا-107 تقليد التي تنتج 50٪ من تأثير تقليد ميرنا-107 الأقصى (IC50). يشير "R" إلى الكسر المتبقي غير المتأثر (كسر المقاومة). (D) توضح هذه اللوحة كيفية حساب قيم ICx المعدلة استنادًا إلى المعلمات (n وk وR) المكتسبة من المعادلة 1. النسبة المئوية (بالنسبة المئوية) تمثل صلاحية الخلية في اللوحة "f" في المعادلة 1 ويتم حسابها عن طريق طرح قيمة x لكل ICx من y0 (100). يتم الإشارة إلى المعادلة 2 في شريط الصيغة لجدول البيانات على أنها "=((100-D3)/(D3-$B$5))^(1/$B$3)*$B$4)" لحساب قيمة IC10 المعدلة. تطبيق المعادلة 2 على خلايا أخرى لحساب قيم ICx أخرى عن طريق الضغط على زر الماوس الأيسر على الخلية المحددة (اللون الأحمر) وسحب لأسفل إلى الخلية من قيمة IC90. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحقق من الجين المستهدف المباشر لميرنا ذات الأهمية. تبدأ التجارب بتصميم مواد أولية لاستنساخ 3'UTR. وتستخدم التمهيديات لPCR التدرج. (أ) يمكن اختيار أفضل درجة حرارة الصلب من بين درجات الحرارة الست المشار إليها لتضخيم 3' UTR من الجين. بعد ذلك، يتم تنفيذ الهضم المزدوج مع الإنزيمات المقيدة ويتم ربط منتجات PCR في ناقلات لوسيفيراز. (B)ناقلات لوسيفيراز التي تحتوي على 2 الجينات مراسل, اليراعة وrenilla لوسيفيراز, يمكن استخدامها لفحص تفاعلات miRNAs مع 3 'UTR من mRNAs. يتم استنساخ إدراج PCR في منطقة وضعت المصب من الجينات مراسل رينيلا. تم تحويل المنتجات الأربطة إلى خلايا مختصة ونمت الخلايا على لوحة أجار LB. (C) تم التقاط المستعمرات الفردية (#1 إلى #6) وإعادة تعليقها في 50 ميكرولتر من المياه النقية جدا. تم استخدام تعليق القولونية E. للمستعمرة PCR والتلقيح. مستعمرة PCR هو أداة مريحة لتحديد أفضل المستعمرات لتلقيح وعزل ناقلات لوسيفيراز التي تأوي 3 ' UTR من الجينات. (D) لفحص لوسيفيراز، تم نقل محاكاة التحكم ميرنا أو ميرنا-107 تقليد في خلايا PANC-1 مع المنشآت لوسيفيراز باستخدام لوحة 24 جيدا. (E) يوضح هذا الفريق البيانات الخام التمثيلية وحساب نسبة الرينيلا إلى اليراعة بعد تنفيذ اختبار لوسيفيراز للتحقق من وجود جين SNCG كهدف miRNA-107. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: فحص الجينات المستهدفة المتوقعة من ميرنا-107. وأجري فحص للتفاعلات بين ميرنا-107 و3'UTR للأهداف المتوقعة في خلايا PANC-1 باستخدام البنى لوسيفيراز. واستنادا إلى الآثار السلبية للميرنا-107 على انتشار الخلايا، تم تحديد الجينات المرشحة المحتملة لتجارب الاستنساخ والفرز. تم نقل محاكاة التحكم ميرنا أو ميرنا-107 تقليد في خلايا PANC-1 مع المنشآت لوسيفيراز التي تحتوي على 3 'UTR من كل جين مختارة لمدة 24 ساعة. وقد تم حساب نسبة الرينيلا إلى اليراعة وتطبيعها على أساس المستويات المقاسة لكل من اللوسيفيراز في خلايا PANC-1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكشف عن | ميرنا | في هذا الـ41 |
| مكونات | ||
| مزيج رئيسي لPCR في الوقت الحقيقي المستندة إلى التحقيق (2X) | 10 ميكرولتر | – |
| مزيج رئيسي لصبغ القائم على PCR في الوقت الحقيقي (2X) | – | 10 ميكرولتر |
| خليط مسبار (5x) | 4 ميكرولتر | – |
| التمهيديات GAPDH (1 ميكرومتر لكل منهما) | – | 4 ميكرولتر |
| الكنادة المخففة (1:49) | 6 ميكرولتر | 6 ميكرولتر |
| مجموع حجم | 20 ميكرولتر | 20 ميكرولتر |
الجدول 1: الشروط المستخدمة للكشف عن الحمض النووي الريبي وGAPDH من قبل PCR في الوقت الحقيقي في هذه الدراسة.
| مكونات | 1x رد فعل | 7x رد فعل |
| 5x المخزن المؤقت | 5 ميكرولتر | 35 ميكرولتر |
| خليط dNTP (2.5 مليون متر لكل منهما) | 2 ميكرولتر | 14 ميكرولتر |
| مواد أولية (10 ميكرومتر لكل منها) | 1 ميكرولتر | 7 ميكرولتر |
| الحمض النووي الجينومي (2 نانوغرام/ميكرولتر) | 16.5 ميكرولتر | 115.5 ميكرولتر |
| بوليميراز | 0.5 ميكرولتر | 3.5 ميكرولتر |
| مجموع حجم | 25 ميكرولتر | 175 ميكرولتر |
الجدول 2: تكوين خلائط تفاعل تفاعل الـ PCR من أجل تضخيم تفاعل التفاضل مخلفات الأوتري 3 في هذه الدراسة.
| مكونات | 1x رد فعل |
| 10x المخزن المؤقت | 5 ميكرولتر |
| منتجات PCR أو المتجهات | منتجات PCR: 25 درجة مئوية ناقلات: 1-2 ميكروغرام |
| XhoI (أو AsiSI) تقييد الإنزيم | 2 ميكرولتر |
| إنزيم تقييد NotI | 2 ميكرولتر |
| ماء فائق النقاء | x ميكرولتر |
| مجموع حجم | 50 ميكرولتر |
الجدول 3: شروط الهضم المزدوج لمنتجات PCR وناقلات لوسيفيراز باستخدام إنزيمات XhoI (أو AsiSI) وNotI في هذه الدراسة.
| مكونات | 1x رد فعل |
| 10x المخزن المؤقت | 2 ميكرولتر |
| المتجهات (هضم مزدوج) | 50 نانوغرام |
| منتجات PCR (إدراج) | x ميكرولتر |
| ليسي | 200 U |
| ماء فائق النقاء | y μL |
| مجموع حجم | 20 ميكرولتر |
الجدول 4: ردود فعل الربط من منتجات PCR المهضومة المزدوجة و متجهات لوسيفيراز مع ال [دنا] [لليج] في هذا دراسة.
الشكل التكميلي 1: اشتقاق المعادلة 2 من المعادلة 1. المعادلة 2 مشتقة من المعادلة 1 لحساب قيم ICx المعدلة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: معلومات تمهيدية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استراتيجيات لتحديد أهداف ميرنا حسن النية مع وظائف ميرنا ذات الأهمية لا غنى عنها لفهم الأدوار المتعددة للميرنا. يمكن أن يكون تحديد الجينات المستهدفة ميرنا مبدأ ً توجيهياً لتفسير أحداث إشارات الخلية التي تم تضمينها بواسطة miRNAs في الخلية. الكشف عن الجينات المستهدفة الهامة وظيفيا من miRNAs يمكن أن توفر المعرفة الأساسية لتطوير العلاج القائم على ميرنا في السرطان.
ويمكن تطبيق عدة طرق مثل microarrays، تسلسل مكتبة RNA الصغيرة، التسلسل العميق، النسخ العكسي في PCR الموقع، والنشاف الشمالية لاستكشاف مستويات التعبير ميرنا باستخدام RNA الكلي معزولة من خطوط الخلايا والأنسجة24، 25،26. يمكن أن يوفر تحديد ملامح الإنتاجية العالية للmiRNAs رؤية قيمة للأسس الوراثية لتطوير السرطان. غالباً ما يستخدم اختبار ميرنا المستندة إلى التحقيق للتحقق من صحة بيانات التنميط وهو مناسب أيضًا لفحص عدد قليل من miRNAs ذات الأهمية. ومع ذلك، فإن قياس مستويات ميرنا الناضجة باستخدام PCR في الوقت الحقيقي القائم على التحقيق يقتصر على تحديد ما إذا كانت يتم تنظيم miRNAs ناضجة في خطوات النسخ أو من خلال تنظيم النضج. وقد تم إدخال الصبغ القائم على PCR في الوقت الحقيقي والنشاف الشمالية لقياس مستويات السلائف ميرنا27،28. قياس السلائف ميرنا جنبا إلى جنب مع مستويات ميرنا ناضجة يمكن أن توفر كذلك معلومات عن كيفية تنظيم مستويات ميرنا ناضجة. وعلاوة على ذلك، لا غنى عن فهم شامل لتنظيم مستويات ميرنا لتطوير النهج العلاجية القائمة على ميرنا.
وتنطبق تجارب انتشار الخلايا مثل اختبار MTT القائم على رباعي الزوليوم على فحص آثار الكواشف العلاجية مثل يحاكي ميرنا. منذ أن كان التبيّد MTT يعكس الأنشطة الأيضية للخلايا استنادًا إلى تقليل رباعي الزوليوم بواسطة الأكسدة الخلوية، فمن الممكن ملاحظة عدم وجود ارتباط بين مستوى MTT ورقم الخلية الإجمالي19. بدلا من ذلك، يتوفر SRB التصاق كأكثر تعدادالخلايا قابل للاستنساخ 18،19. قياس كمية صبغة SRB ملزمة لحمض ثلاثي الكلور والبروتينات الثابتة يمكن أن تمثل مجموع عدد الخلايا29. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق اختبار SRB في هذا البروتوكول لفحص محاكاة ميرنا متعددة، فضلا عن الأدوية المضادة للسرطان باستخدام لوحات 384 جيدا. ومع ذلك، فإن فحص SRB له قيود مثل الفرز اليدوي. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتوفر هذا الاختبار للخلايا غير الملتصقة. منذ miRNAs تلعب أيضا دورا حاسما في الخبيثة الدموية مثل سرطان الغدد الليمفاوية والمايلوما30، مطلوب رصد فعال لانتشار الخلايا لكشف وظائف miRNAs. كاربوكسيفلوريسين succinimidyl استر (CFSE) يمكن تسمية داخل الخلايا الخلايا غير الملتصقة. يتم استخدام CFSE لمراقبة توليد الخلايا المنتشرة عن طريق قياس التدفق السيتومي31. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر miRNAs على الغزو، وورم خبيث، وموت الخلايا المبرمج. ولذلك، فإن التقنيات التجريبية الأخرى التي تجمع مع هذا البروتوكول ستكون أكثر عملية لفهم وظائف ميرنا على نحو سليم، مما يسهم في نهاية المطاف في تحديد الأهداف المتعددة الصلة بيولوجيا ً من miRNAs.
حساب تركيز نصف المثبطة القصوى (IC50) هو وسيلة هامة ليس فقط لدراسات ميرنا ولكن أيضا لتقييم فعالية الأدوية الأخرى المضادة للسرطان. يمكن استخدام قيم IC50 لمقارنة الآثار المحتملة للعديد من miRNAs أو الأدوية المضادة للسرطان على انتشار الخلايا. وقد ثبت أن الجمع بين العلاج القائم على ميرنا مع الأدوية المضادة للسرطان يمكن أن توفر فرصة استثنائية لتحسين فعالية المخدرات المضادة للسرطان. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين miRNAs مع الأدوية المضادة للسرطان يمكن أن يكون نهجا جديدا للتغلب على المقاومة الكيميائية32،33. لتقييم كفاءة الجمع، فمن المفيد لحساب القيم ICx المعدلة على أساس بروتوكولنا لتقييم مؤشر الجمع (CI) الذي يسمح التقدير الكمي للتآزر أو العداء33، 34.
يمكن أن تكون شبكات الإشارات داخل الخلايا غير منظمة على نطاق واسع من قبل miRNAs أعرب عن هاومالا في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطانات. ومع ذلك، فإن شبكات الإشارة المتأثرة بشكل ملتوي بالميتنالاز لا تزال غير معروفة في معظمها حيث تم التحقق من صحة النسبة الصغيرة من الجينات المستهدفة تجريبياً، كما يتم تنظيم الجينات المستهدفة من خلال التفاعل غير الكنسي مع miRNAs35. ومع ذلك، فإن استراتيجيتنا وبروتوكولنا هما طريقتان موثوقتان لفك رموز الآليات الخلوية للجمهورية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع بروتوكولنا لتنفيذ وتقييم مزيج من miRNAs وغيرها من الأدوية المضادة للسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من وزارة التعليم (2017R1D1A3B03035662)؛ وصندوق بحوث جامعة هاليم، 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
