Summary
Detta protokoll använder en sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), en sulforodamin B (SRB) assay, 3 ' oöversatta regioner (3 ' utr) kloning, och en luciferas analys för att kontrollera målgener av en Mirna av intresse och att förstå funktionerna i mirnas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) är små reglerande RNAs som är erkända för att modulera många intracellulära signalvägar i flera sjukdomar inklusive cancer. Dessa små reglerande RNAs samverkar främst med 3 ' oöversatta regioner (3 ' UTR) av deras mål Messenger RNAs (mRNAs) i slutändan resulterar i hämning av avkodnings processer av mRNAs och förstärkning av Target mRNA degradations. Baserat på uttrycks nivåer och intracellulära funktioner, miRNAs kan fungera som reglerande faktorer för onkogena och tumör-suppressiv mRNAs. Identifiering av bona fide målgener av en miRNA bland hundratals eller till och med tusentals beräkningsmässigt förutspådda mål är ett viktigt steg för att urskilja rollerna och grundläggande molekylära mekanismer för en miRNA av intresse. Olika miRNA mål förutsägelse program finns tillgängliga för att söka möjliga miRNA-mRNA interaktioner. Men den mest utmanande frågan är hur man validerar direkta målgener av en miRNA av intresse. Detta protokoll beskriver en reproducerbar strategi av viktiga metoder för hur man identifierar miRNA mål relaterade till funktionen av en miRNA. Detta protokoll presenterar en praktisk vägledning om steg-för-steg-procedurer för att avslöja Mirna-nivåer, funktioner och relaterade mål-mrnas med hjälp av sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), sulforodamin B (SRB) assay efter en Mirna Mimic transfektion , dos-respons kurva generation, och luciferas assay tillsammans med kloning av 3 ' utr av en gen, vilket är nödvändigt för att korrekt förstå rollerna för enskilda mirnas.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) är de små reglerande RNAs som huvudsakligen modulera processen för översättning och nedbrytning av Messenger RNAs (mRNAs) genom att reagera på 3 ' oöversatta regioner (3 ' UTR) i bona fide målgener1. Uttryck för miRNAs kan regleras genom transkriptionella och posttranskriptionella mekanismer. Obalansen i sådana regleringsmekanismer ger okontrollerade och distinkta miRNAs-uttrycksnivåer i många sjukdomar, inklusive cancer2. En enda miRNA kan ha flera interaktioner med olika mRNAs. På motsvarande sätt kan en individuell mRNA styras av olika miRNAs. Därför är intracellulära signal nätverk intrikat influerade av tydligt uttryckt mirnas genom vilka fysiologiska störningar och sjukdomar kan initieras och försämras2,3,4, ,5 , 6. även om det förändrade uttrycket av mirnas har observerats i olika typer av cancer, de molekylära mekanismer som modulera sätt cancerceller i samband med mirnas är fortfarande till stor del okända.
Ackumulerande bevis har visat att de onkogena eller tumör-suppressiva roller miRNAs beror på vilka typer av cancer. Till exempel, genom att rikta forkhead Box O3 (FOXO3), Mir-155 främjar cellproliferation, metastaser, och kemoresistens av kolorektal cancer7,8. Däremot är begränsningen av gliom cell invasion induceras av Mir-107 via regleringen av neurogena Locus notch homolog protein 2 (NOTCH2) uttryck9. Bedömningen av miRNA-målinteraktioner i samband med miRNA-funktioner är en oumbärlig del för att bättre förstå hur miRNAs reglerar olika biologiska processer i både friska och sjuka stater10. Dessutom kan upptäckten av bona fide Target (s) av miRNAs ytterligare ge en finjusterad strategi för en miRNA-baserad behandling med olika läkemedel mot cancer. Den största utmaningen inom området miRNAs är dock att identifiera de direkta målen för miRNAs. Här presenteras detaljerade metoder som reproducerbara experimentella metoder för att fastställa miRNA-målgen. Framgångsrik experimentell design för miRNA Target identifiering omfattar olika steg och överväganden (figur 1). Jämförelse av mogna miRNA nivåer i tumörceller och normala celler kan vara en av de vanligaste förfarandena för att välja en miRNA av intresse (figur 1a). Den funktionella studie av en utvald miRNA att upptäcka effekterna av en miRNA på cellproliferation är viktigt att begränsa listan över bästa potentiella kandidat mål av en miRNA av intresse (figur 1b). Baserat på miRNAs experimentellt validerade funktioner krävs en systematisk genomgång av litteratur och databas i sällskap med ett miRNA-målprediktionsprogram för att söka den mest relevanta informationen om gen funktioner (figur 1c). Identifieringen av verkliga målgener av en Mirna av intresse kan uppnås genom att genomföra experiment som luciferas analysen tillsammans med kloning av 3 ' utr av en gen, realtid PCR, och Western blotting (figur 1d). Målet med det nuvarande protokollet är att tillhandahålla omfattande metoder för viktiga experiment, den sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), sulforodamin B (SRB) assay efter en Mirna Mimic transfektion, dos-respons kurva generation, och luciferas-analysen tillsammans med kloningen av 3 ' utr av en gen. Det nuvarande protokollet kan vara användbart för en bättre förståelse av funktionerna hos enskilda miRNAs och implikationen av en miRNA i cancerterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mogna MicroRNA (miRNA) uttrycks analys
-
Mogen miRNA komplementär DNA (cDNA) syntes
- Tillsätt 254 ng av totalt RNA och 4,5 μl deoxyribonuclease i (DNase i) blandningar, och tillsätt sedan ultrarent vatten i PCR-bandrör för att göra upp till 18 μl (figur 2A). Bered reaktionen för varje totalt RNA-prov som renas från flera cellinjer med tillräckligt mycket DNase I-blandningar baserat på det totala antalet reaktioner.
Anmärkning: DNase i-blandningar består av DNase i (1,8 μl), ribonukleas-hämmare (0,3 μl) och 25 mm mgcl2 (2,4 μl). För att reproducerbart upphandla totalt RNA, en kolumn-baserade extraktionsmetod var pulveriserare istället för att använda en fenol-kloroform baserad extraktion metod. Det rapporterades att utvinning avkastningen av vissa mirnas kan varieras beroende på antalet celler när du använder en fenol-kloroform baserad extraktion metod11,12. - Inkubera rören i en termisk Cycler. Kör rören i 10 min vid 37 ° c och värm-inaktivera DNase I med 5 min inkubation vid 90 ° c. Lägg genast rören på isen efter inkubering.
- Överför 7,1 μL av DNase jag behandlade totalt RNA i 2 uppsättningar nya tuber och tillsätt sedan 1,5 μL antisense primers för genen glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) (figur 2b).
Anmärkning: Mängden totalt RNA för cDNA-syntes blir 100 ng i detta steg. Lager koncentrationen av GAPDH antisense primers är 10 μM. lägga till GAPDH antisense primers är för generering av GAPDH cDNAs med hjälp av en gen-specifik primer metod. - Inkubera rören med en termisk Cycler. Börja vid 80 ° c i 5 min följt av reaktionen vid 60 ° c i 5 min. Placera omedelbart rören på isen efter inkubering.
- Tillsätt 3,4 μL omvänd Transkription (RT)-enzym blandningar i varje reaktion (figur 2b). RT-enzymblandningar består av 100 mm deoxyribonukleotidtrifosfater (0,15 μl), 10X RT-buffert (1,5 μl), ribonukleas-hämmare (0,75 μl) och omvänt transkriptionsenzym (1 μl). Förbered tillräckligt mycket av blandningar baserat på det totala antalet reaktioner.
- Tillsätt 3 μL 5x RT primers för en specifik miRNA i varje reaktion (figur 2b).
Anmärkning: Total volym är 15 μL för varje reaktion. - Kör rören med en termisk Cycler. Börja vid 16 ° c i 30 min följt av reaktionen vid 42 ° c i 30 min, och slutligen vid 85 ° c i 5 min. Håll vid 4 ° c under återstående tid (figur 2b). Enkelsträngade cDNAs genereras i detta steg för både en specifik miRNA-och GAPDH-gen i samma tub.
- Tillsätt 254 ng av totalt RNA och 4,5 μl deoxyribonuclease i (DNase i) blandningar, och tillsätt sedan ultrarent vatten i PCR-bandrör för att göra upp till 18 μl (figur 2A). Bered reaktionen för varje totalt RNA-prov som renas från flera cellinjer med tillräckligt mycket DNase I-blandningar baserat på det totala antalet reaktioner.
-
Real tid polymeras kedjereaktion (PCR) och dataanalys
- Späd varje cDNA med ultrarent vatten vid 1:49 förhållande.
- Förbered reaktions blandningarna för en specifik miRNA och GAPDH (tabell 1). För detektion av en specifik Mirna och GAPDH, Ställ in tre exemplar reaktioner för varje cDNA prov.
- Utför PCR-och dataanalys i realtid (figur 2C). Analysera data med hjälp av den jämförande CT -metoden13,14.
2. MicroRNA (miRNA) Mimictransfektion
Obs: Mirna-107 väljs från steg 1. Eftersom miRNA-107 är Down-reglerat i tumörceller jämfört med normala celler, kan det spekuleras att miRNA-107 är en tumör suppressiv miRNA. I fallet med en miRNA som är upp-reglerad i tumörceller jämfört med normala celler (t. ex., mirna-301), antisense oligonukleotides mot mirna-301 kan tillämpas för steg 2, 3, och 4.
- Räkna cellerna med en Counting-kammare enhet och platta cellerna i en 96-brunn plattan. Cell tätheten är 2 x 103 celler/100 μl för varje brunn. Använd inte cellkultur medier som innehåller penicillin-streptomycin (P/S) eftersom P/S kan minska transfektionseffektiviteten.
-
Förbered en uppsättning transfektion blandningar för att transfect cellerna vid flera slutliga koncentrationer av miRNA kontroll härma och miRNA-107 härma på nästa dag (figur 3).
- Från beståndet (koncentration av 25 μM) av miRNA-kontroll härma eller miRNA-107 härma, späd och tillsätt motsvarande mängd kontroll härma eller miRNA-107 härma i reducerade serum medier tillsammans med en transfektionsreagens med mikrocentrifugrör (figur 3a). Blanda försiktigt oligo-innehållande blandningar med en mikropipett. Den totala mängden oligos (miRNA Mimic kontroll + miRNA-107 härma) bör vara densamma i varje brunn. Tomma brunnar omfattar 100 μL cellodlingsmedium och reducerat serum som innehåller en transfektionsreagens utan celler.
- Efter en 10 min inkubation i en cellkultur huva, blanda försiktigt oligo innehållande blandningar igen och tillsätt sedan 50 μL av blandningarna i varje brunn. Behåll de transfekterade cellerna i en cellkultur inkubator. Byt ut det transfektionsreagens som innehåller Media med de färska cell odlings medierna som innehåller både fetalt bovint serum (FBS) och P/S efter 6-12 h-inkubering. Ytterligare Inkubera cellerna för 72 h. Den totala behandlingstiden för miRNA Mimic är 96 h.
3. analys av sulforhodamin B (SRB)
-
Cellfixering
- Ta bort cell odlingsmediet i varje brunn på plattan och fyll snabbt 100 μL av 10% triklorättiksyra (TCA) i varje brunn. Försiktigt aspirera cellkulturen media från varje brunn för att undvika cellskador och avlossning från botten.
Anmärkning: Bered 40% TCA genom att tillsätta 20 g TCA-pulver i 50 mL destillerat vatten. Från 40% TCA, gör 10% TCA genom att späda 40% TCA med destillerat vatten vid en 1:3 utspädnings kvot. - Förvara plattan som innehåller 10% TCA i kylskåp (4 ° c) i 1 h.
- Tvätta plattan flera gånger genom att dränka i vattenbad karet och torka den. Ta bort överflödigt vatten från insidan av brunnar genom att knacka på plattan tills det inte finns något vatten kvar i brunnar. Lämna plattan på en laboratorie bänk för att torka den innan du går till nästa steg.
- Ta bort cell odlingsmediet i varje brunn på plattan och fyll snabbt 100 μL av 10% triklorättiksyra (TCA) i varje brunn. Försiktigt aspirera cellkulturen media från varje brunn för att undvika cellskador och avlossning från botten.
-
Cell färgning
- Pipettera 50 μL av 0,4% SRB-lösning i varje brunn inklusive tomma brunnar. Skaka försiktigt plattan tills 0,4% SRB lösning konsekvent täcker botten av brunnar.
Anmärkning: Förbered och Använd 0,4% SRB lösning genom att tillsätta 0,4 g SRB pulver till 100 mL 1% ättiksyra. Skaka lösningen noga för att blanda den. Wrap flaskan med 0,4% SRB lösning i ett lätt skyddande material som aluminiumfolie. Förvara 0,4% SRB-lösning i kylskåp. - Efter inkubering för 40 min till 60 min, tvätta plattan genom att skölja den med 1% ättiksyra. Tvätta plattan tills det obundna färgämnet har spolats bort helt (figur 3b).
- Lämna plattan på en laboratorie bänk för att torka den innan du går till nästa steg.
Anmärkning: Plattan bör torkas helt innan du går till steg 3,3.
- Pipettera 50 μL av 0,4% SRB-lösning i varje brunn inklusive tomma brunnar. Skaka försiktigt plattan tills 0,4% SRB lösning konsekvent täcker botten av brunnar.
-
Absorbansmätning
- Pipettera 100 μL baslösning av tris (10 mM) till motsvarande brunnar, inklusive blanka brunnar. Håll plattan på en shaker i 10 min. Mät absorbansen vid 492 nm.
4. generering av en dos-responskurva
- Analysera SRB-analysdata i ett kalkylblad. Subtrahera den tomma absorbansen från absorbansvärdena för varje grupp och beräkna absorbansvärdena för varje grupp i genomsnitt (AVE) och standardavvikelse (STD).
- Beräkna procentsatsen för genomsnittlig absorbans (AVE%) och standardavvikelsen (STD%) varje grupp med absorbansvärden för SRB-analysen.
Anmärkning: AVE% av miRNA Control härma behandlade gruppen är 100%. Beräkna STD% med hjälp av följande formel: STD% = (STD för varje grupp/AVE absorbans av kontroll härma behandlade grupp) x 100. - Importera rådata inklusive behandlingskoncentrationer, AVE% och STD% i programvaran genom att justera dessa data vertikalt. Eftersom log 0 inte är definierad, ange den första koncentrationen av X-axeln till ett värde som är nära 0 (t. ex.0,01).
- Klicka på fliken skapa graf och välj enkla fält för scatter-fel. Välj kalkylbladskolumner som symbolvärden och klicka på Nästa. Välj XY-par i panelen dataformat och klicka på Nästa. Välj motsvarande datakolumner i panelen Välj data. Klicka finish knappen för att skapa tomten.
Anmärkning: X-axeln representerar koncentrationerna, Y-axeln anger procentandelen av genomsnittlig absorbans för varje koncentration (AVE%), och felstaplar pekar ut procentandelen standardavvikelse för varje koncentration (STD%). - Dubbelklicka på X-axeln för att ändra typ av skala och skalning av axeln. Ändra typ av skala från linjär till logg. Ändra start-och områdesnumret till 0,01 respektive 200.
-
Högerklicka på ett spridningsdiagram, Välj kurvpassning och gå till den underkategori som användaren har definierat. Välj dos-responskurva, klicka på nästa knappar, och klicka sedan på finish knapp. Dos-responskurvan genereras nu tillsammans med en rapportflik (figur 4a).
- Om du vill ange ekvation 1 i programvaran för generering av en dos-responskurva klickar du på fliken analys och väljer Regressions guiden. Gå till användardefinierad i kategorin ekvation och klicka sedan på knappen ny . Infoga ekvation 1, variabler, initiala parametrar och begränsningar i motsvarande tomma rutor (figur 4b, C). Klicka på Lägg till som knappen och ange namnet på ekvationen som dos-responskurva. Ekvationens namn genereras nu i den underkategori som användaren definierat i kategorin ekvation. f anger procentandelen av cellernas lönsamhet (% cellviabilitet) i ekvation 1.
Ekvation 1
- Gå till fliken rapport och kontrollera värdena n, k och R.
Obs: y0 indikerar 100% cell livskraftig av Mirna kontroll härma behandlade grupp, n indikerar kullen-typ koefficient (lutningen på en tomt), k indikerar koncentrationen av mirna-107 härma som ger en 50% av mirna-107 härma maximala effekt (den halva maximal inhibitorisk koncentration, IC50), och R indikerar resterande opåverkade fraktion (motstånds fraktionen)15. Ekvationen som används för att generera en dos-responskurva känner igen intervallet från y0 till R-värde (om sådant finns) som 100% (figur 4a). Därför är det nödvändigt att förvärva den justerade k (IC50) värde som beräknas baserat på intervallet från y0 till ett värde av noll (figur 4a). Justerat k (IC50) tillsammans med andra ICX-värden (t. ex.ic10 till IC90) kan erhållas med hjälp av ekvation 2, som härleds från ekvation 1. Härledningen av ekvation 2 från ekvation 1 anges i kompletterande figur 1.
Ekvation 2
- Dubbelklicka på den vänstra musknappen i cellen där ekvation 2 används. Med hjälp av ekvation 2 och parametrar från den genererade dos-responskurvan, är den tillgänglig för att beräkna de justerade värdena för ICx, allt från IC10 till IC90 (figur 4D).
- Ange likhetstecknet följt av formeln som börjar med en hakparentes i cellen. När du anger formeln, korrigera värdet för n, k och R som absoluta cellreferenser genom att lägga till dollartecknet till motsvarande kolumn och rad, så att dessa fasta värden inte kommer att ändras när du fyller i formeln automatiskt ner till raderna (figur 4D). Alternativt kan justerade värden beräknas manuellt med hjälp av ekvation 2.
Anmärkning: IC90 värde bestäms inte eftersom R-värdet är större än 10. Dessutom, om R-värdet är över 20, är värdet på IC80 inte heller fastställt (figur 4D).
5. verifiering av den direkta målgenen i en mikroRNA av intresse
Anmärkning: Efter att ha utfört funktionella experiment som SRB-analysen, miRNA-107 bekräftas som en tumör suppressiv miRNA och det är mycket möjligt att miRNA-107 riktar direkt oncogenes. Kontrollera listan över alla förväntade målgener med hjälp av ett miRNA mål förutsägelse program som TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), och sedan begränsa till potentiella kandidat mål baserat på funktionen av en gen i databaser inklusive PubMed och GeneCards.
- Primer design för kloning av 3 "icke översatt region (UTR)
- Sätt namnet på en gen i GeneCards (https://www.genecards.org/) och klicka på symbolen för en gen. Bedöm till Ensembl genom webbläsare genom att klicka på ENSEMBL ID för en gen och klicka sedan på Transcripts ID i tabellen avskrift. Efter det, klicka på Exons fanns i listan avskrift-baserade bildskärmar till vänster.
- Kopiera nukleotidsekvenser av 3 ' UTR och klistra in den i primer designprogram. Kopiera sekvenser igen från det här programmet och klistra in den i en ordbehandlare. Kontrollera närvaron av miRNA bindande sekvenser samt förekomst av restriktionsenzymer platser som används för kloning.
Anmärkning: Om det inte finns några restriktioner enzym erkännande platser inom 3 ' UTR, kan de restriktionsenzymer som valts för kloning användas för nästa steg. - I primer designprogram, acceptera 3 ' UTR sekvenser och börja designa framåt och bakåt primers med följande villkor. Längd: 20-30 nukleotider, TM: 45-58 ° c, GC%: 40-60%. Skillnaden mellan TM-värdena för de två primers bör vara mindre än 5 ° c. De primer-sekvenser som används i denna studie finns i kompletterande figur 2. Lägg till begränsnings enzym igenkännings sekvenser samt 4 slumpmässiga nukleotider till de designade primers.
- Gradient PCR
- Bered 25 μL av PCR-reaktionsblandningar inklusive konstruerade primrar per en glödgningstemperatur (tabell 2). Förbered tillräckligt mycket av blandningar baserat på det totala antalet reaktioner. Blanda lösningen genom att Pipettera och tillsätt 25 μL reaktionsblandningar i varje tub. Centrifugera rören i några sekunder.
- Utför 35-40 PCR-cykler från denatureringssteg till förlängnings steg. Ställ in PCR-cykeln som följande steg: 98 ° c för 1 min (1 cykel, polymeras aktiverings steg), 95 ° c för 10 s (denatureringssteg), 45 ° c-68 ° c för 30 s (glödgning steg), 68 ° c (förlängnings steg, 10 s-1 min per 1000 BP), 68 ° c för 3 min och slutligen svalna till 4 ° c.
- Kör PCR-produkterna och kontrollera banden på en 1% agaros gel med DNA-stegar. Hitta den bästa glödgnings temperaturen (figur 5a). Amplify 3 ' UTR av en gen igen med den bästa glödgningstemperaturen för nästa steg.
- Dubbel matsmältning
- Gör reaktions blandningarna inklusive två restriktionsenzymer, XhoI (eller AsiSI) och e, i ett rör (tabell 3). Inkubera blandningarna för 3-4 h med hjälp av ett vattenbad (37 ° c).
- Kör dubbla smält produkter på en 1% aguppstod gel och sedan klippa banden under UV-ljus. I fallet med luciferas vektorer, innan du kör på en gel, reagera dubbla smält vektorer med 10 U alkaliska fosfataser för ytterligare 1 h för att förhindra en recircularization under ligering steg.
- Rena de dubbelsmält PCR-produkterna och luciferas-vektorerna från de exciderade banden.
- Ligering av PCR-produkter i luciferas vektorer
- Gör 20 μL av ligationreaktionsblandningar inklusive DNA-ligasen (tabell 4).
Anmärkning: Molar förhållandet av PCR-produkten (insatsen) till luciferas vektor kan vara 3:1. 1:1 eller 2:1. - Kort Centrifugera röret för 10-15 s och inkubera vid 16 ° c över natten med hjälp av en termisk Cycler.
Anmärkning: Alternativt kan röret inkuberas vid 4 ° c i 2-3 dagar för ligering. I detta steg kommer PCR-insatsen att klonas i den region som är placerad nedströms från en Renilla reporter-gen (Figur 5b). Bindning av miRNAs till den klonade 3 ' UTR av en gen kan minska i Renilla aktivitet. Firefly luciferas är för normalisering av Renilla Expression nivåer.
- Gör 20 μL av ligationreaktionsblandningar inklusive DNA-ligasen (tabell 4).
- Omformning och koloni PCR
- Tillsätt ligationsblandningar (3-5 μL) i röret som innehåller kompetenta celler. Knacka försiktigt på röret och hålla den på is (20 min).
Obs: Lossa de behöriga cellerna på isen innan du lägger till ligationsblandningar. - Överför röret snabbt och försiktigt till ett värmeblock. Efter en värme chock (42 ° c i 30 s-1 min), placera röret på is i 20 min.
- Sprida kompetenta celler på Luria-Bertani (LB) agar plattan. Odla kompetenta celler i en inkubator (37 ° c) över natten.
Anmärkning: Ampicillin (50-100 μg/mL) ingår i agarplattan. - Välj en individuell koloni och Omsuspendera E. coli i en av de 8-Strip rör som innehåller ultrarent vatten. Upprepa detta steg för att Omsuspendera E. coli från slumpmässigt utvalda 4-8 kolonier (figur 5c).
- Överför 25 μL E. coli -suspension till en annan uppsättning 8-bandrör. Nu, det finns 2 uppsättningar av rör av E. coli suspension.
Anmärkning: En rör är för kolonin PCR och another en är för inympning. E. coli -suspension för inympning kan tillfälligt förvaras vid 4 ° c (figur 5c). - Utför kolonin PCR med E. coli suspension. Detta steg är att avgöra om kolonierna innehåller ett skär. Välj de bästa kolonierna att Inokulera och isolera luciferas vektorer hartråkig 3 ' utr av en gen (figur 5c).
Anmärkning: Upprepa steg 5.1-5.5 för varje 3 ' UTR av valda gener. Följ villkoret för PCR-reaktionen som visas i tabell 2 genom att ersätta GENOMISKT DNA med E. coli -suspension.
- Tillsätt ligationsblandningar (3-5 μL) i röret som innehåller kompetenta celler. Knacka försiktigt på röret och hålla den på is (20 min).
- Luciferase-analys
- Förbered en 24-brunn tallrik. Använd 1-2 x 104 celler i 500 μl cellkultur media för varje brunn. Använd inte cellkultur medier som innehåller P/S för transfektion eftersom användning av P/S kan minska transfektionseffektiviteten.
- Transfect 50 ng av luciferas vektorer i cellerna med kontroll härma eller en specifik Mirna härma med hjälp av en transfektion reagens (figur 5D). Om screening av effekterna av en specifik miRNA härma vid mer än en koncentration, hålla den totala mängden oligos samma i varje brunn (se steg 2).
- Tvätta insidan av brunnar två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) nästa dag.
- Applicera 200 μL lysis reagens i brunnarna och utför cell lysis tillräckligt innan du mäter luciferasaktiviteten.
Anmärkning: Håll plattan på en skakplatta minst 15 min. - Överför 5-10 μl celllysat till det nya röret och tillsätt 100 μl reagens i. Blanda omedelbart lösningen genom att Pipettera och läsa Firefly luciferas aktivitet med hjälp av en luminometer.
Anmärkning: Läs Firefly luciferas aktivitet för 10-15 s. - Tillsätt 100 μL reagens II i samma tub och blanda sedan med pipettering två gånger. Läs Renilla luciferas aktivitet för 10-15 s med hjälp av en luminometer. Upprepa steg 5.6.5 och 5.6.6 för varje prov.
- Beräkna förhållandet mellan Renilla och Firefly (figur 5e).
Anmärkning: Aktiviteten av Firefly representerar transfektion effektivitet luciferas konstruktioner i cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik och korrekt bekräftelse av miRNA-nivåer är viktigt för tolkningen av data genom vilka klassificeringen av miRNAs är möjlig baserat på de förväntade rollerna av miRNAs i utvecklingen och utvecklingen av en sjukdom. Nivåerna av miRNA-107 och miRNA-301 mättes i tre bukspottskörteln cellinjer med hjälp av sond-baserade kvantitativa PCR. Syntesen av cDNAs av både en specifik miRNA och en referens gen i samma reaktion kan öka reproducerbarheten av data. Panc-1 och Capan-1 är mänskliga bukspottskörteln duktal adenocarcinom cellinjer, medan hpne är en förevigade bukspottkörteln kanal cell linje sensorik med en antiretrovirala uttryck vektor härbärge den mänskliga telomeras omvänd transkriptase (hTERT) genen. miRNA-107 reducerades signifikant i PANC-1-och CAPAN-1-celler jämfört med HPNE-celler (figur 2C). Nivåerna av miRNA-301 var signifikant upp-reglerade i PANC-1 och CAPAN-1 celler jämfört med HPNE celler. Dessa resultat är förenliga med tidigare rapporter som Mirna-107 är epigenetiskt inaktiverat i pankreascancer celler och att Mirna-301 nivåer är högre i bukspottskörteln duktal adenocarcinom celler än normala bukspottskörteln duktal celler16, 17.
Den 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analysen återspeglar cell metaboliska aktiviteter. Den här funktionen har en betydligt högre möjlighet att förvärva bristen på korrelation mellan MTT-analysen och det totala cellnumret eftersom testförhållanden inklusive en typ av behandling reagenser kan allvarligt påverka enzymatisk reduktion av tetrazolium 18,19. För att övervinna denna begränsning tillämpades sulforodamin B (SRB)-analysen för att mäta effekterna av Mirna-107 på cellproliferation för att identifiera de potentiella biologiska funktionerna i Mirna-107. Mängden bundet SRB färgämne i de fasta cellerna kan användas som ett surrogat av förändringen i det totala antalet celler. SRB-analysen i denna studie visar tydligt att spridningen av PANC-1-celler minskade efter en miRNA-107 härma transfektion (figur 3). Den miRNA-107 koncentration som orsakade en hämning av 50% cellviabilitet (IC50) bestämdes genom generering av en dos-responskurva. Dessutom är tillämpningen av ekvation 2 fördelaktig för att beräkna alla möjliga inhibitoriska koncentrationer (ICx) för att exakt utvärdera effekterna av miRNA-107 (figur 4).
En undersökning av sambandet mellan mirnas och mrnas-nivåer är ett effektivt sätt att identifiera Mirna-målet eftersom mirnas kan reglera mål gen nivåer via nedbrytningen av mrnas2,20. Men eftersom mirnas också agerar på translationell nivå utan att påverka processerna för mRNA-nedbrytning, är den experimentella valideringen av Mirna-målgeninteraktioner med hjälp av luciferas-analysen ett viktigt steg. Den största fördelen med en luciferas analys är att denna analys kan utesluta förändringar av mRNA nivåer regleras av nedbrytningen av mrnas21. Därför är kloning av 3 ' UTR av förväntade målgener ett viktigt steg för att identifiera verkliga målgener av en miRNA av intresse i samband med realtid PCR och västerländska blot-experiment. Ett effektivt utnyttjande av dubbla reporter vektorer gör det möjligt att förvärva entydiga experimentella data eftersom mätningen av kontroll reporter nivåer kan minska experimentella variationer såsom antalet celler. Normaliseringsprocesser av luciferas-analysdata som erhållits från vektorer som innehåller 3 ' utr av en Synuclein gamma (sncg)-gen visas i figur 5e. Dessutom visar screening av 11 potentiella förväntade mål för Mirna-107 tydligt att endast sncg, en positiv regulator av tumörcelltillväxt22,23, direkt interagerar med Mirna-107 i Panc-1 celler (figur 6). Detta konstaterande indikerar att miRNA-107 kan negativt reglera spridningen av PANC-1-celler genom att modulera SNCG-uttrycket.
Figur 1: experimentell design för miRNA-målidentifiering. Detta diagram visar flödet av en experimentell design som hjälper till att identifiera målet för en miRNA. (A) analys av mogna Mirna-uttrycksnivåer och urvalet av en Mirna av intresse. (B) tre experiment, såsom Mirna Mimic transfektion, SRB-analys, och generering av en dos-responskurva kan utföras för funktionell studie av utvalda mirnas. (C) för att begränsa kandidat målgener av en Mirna av intresse, det är fördelaktigt att kontrollera information och funktion av förväntade målgener i mål förutsägelse program, PubMed, och genecard. (D) efter att ha upptäckt några potentiella kandidat mål gener av en Mirna av intresse, är det möjligt att genomföra praktiska experiment som kloning av 3 ' utr av mrnas, luciferas assay, Real-time PCR, och Western blot att slutligen bevisa det direkta målet gener av en miRNA av intresserar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mogen Mirna-uttrycksanalys. (A) tillsätt totalt RNA från varje cellinje (Panc-1, Capan-1, och hpne), DNase i blandningar och ultrarent vatten i märkta band rör. Total volym i varje tub är 18 μL (PANC-1 och CAPAN-1 är pankreascancer cellinjer, medan HPNE är en normal bukspottskörteln kanal cellinje). B) överföra 7,1 μl av DNase i behandlade blandningar till två uppsättningar nya band rör, och 1,5 μl antisense-primers för en GAPDH-gen tillsätts också i varje tub. Inkubera PCR-bandrör vid indikerade reaktions förhållanden. Lägg sedan till RT-enzymblandningar och 5x RT primers för en specifik miRNA (miRNA-107 eller miRNA-301) i dess avsedda rör och återinkubera rören vid de angivna förhållandena. Enkelsträngad cDNAs för en specifik miRNA och GAPDH genereras. (C) mogna mirna-107 och mirna-301 nivåer bestämdes av sond-baserade realtids PCR med totalt RNA isolerat från Panc-1, Capan-1, och hpne celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: imitera transfektion och SRB-analysen. (A) översta panelen visar utspädning av Mirna kontroll härma och Mirna-107 härma för att förbereda transfektion blandningar. Utbudet av slutliga koncentrationer av miRNA-107 härma är 0 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM och 100 nM. Sammanlagd volym i varje kolonn är för transfektion av celler i en brunn av en 96-brunn pläterar. Nedre panelen visar ett exempel på att skala upp transfektion blandningar för att förbereda tillräckligt mycket av blandningar för transfektion av cellerna i 4 brunnar vid en angiven koncentration. Nästa, tillsätt 50 μL av blandningar i varje brunn genom att följa det föreslagna formatet för transfecting miRNA kontroll härma med miRNA-107 härma. Denna platta användes för SRB-analysen, som inkluderar cellfixering, cell färgning och absorbansmätning. (B) den faktiska bilden av 96-brunnen plattan som visar SRB färgade celler. Denna bild visar tydligt att antalet PANC-1-celler minskar när koncentrationen av miRNA-107 härma ökar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: generering av en dos-responskurva. (A) representativ dos-responskurva för Mirna-107 imitera transfekterade Panc-1-celler. Transfected celler inkuberas kontinuerligt för 96 h. parametrar som upphandlats från dos-responskurvan visas också. (B) ekvationen, variablerna, initial parametrarna och begränsningarna, tillsammans med beskrivningarna av definitioner och värden. (C) infoga definitionerna och värdena i motsvarande paneler i programvaran. "F" indikerar att% cellernas lönsamhet (till exempel värdet "f" är "90" och "10" vid IC10 respektive IC90). Den y0 värde är 100 och visar den 100% cell livskraftig av Mirna kontroll efterlikna transfekterade celler. "N" indikerar koefficient för Kulltyp (lutningen på en tomt). Den "k" indikerar koncentrationen av miRNA-107 härma som ger en 50% av miRNA-107 härma maximala effekt (IC50). "R" indikerar resterande opåverkade fraktion (motstånds fraktionen). (D) denna panel visar hur man beräknar justerade ICX-värden baserat på parametrarna (n, k och R) förvärvade från ekvation 1. Procentsatsen (%) cellernas lönsamhet i panelen representerar "f" i ekvation 1 och beräknas genom att x-värdet för varje ICx subtrahera från y0 (100). Ekvation 2 i formelfältet i kalkylbladet indikeras som "= ((100-D3)/(D3-$B $5)) ^ (1/$B $3) * $B $4)" för beräkning av justerat IC10 -värde. Tillämpa ekvation 2 på andra celler för att beräkna andra ICx-värden genom att trycka på vänster musknapp på den markerade cellen (röd färg) och dra ned till cellen av IC90 -värde. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: verifiering av den direkta målgenen av en miRNA av intresse. Experiment börjar med att designa primers för kloning av 3 ' UTR. Primers används för gradienten PCR. (A) den bästa glödgnings temperaturen kan väljas bland de sex angivna glödgningstemperaturen för att förstärka 3 ' utr av en gen. Därefter utförs dubbel uppslutning med restriktionsenzymer och PCR-produkter är och ligaturer i luciferas vektorer. (B) luciferase vektorer som innehåller 2 reporter gener, Firefly och Renilla luciferase, kan användas för att avskärma interaktioner mirnas med 3 ' utr av mrnas. PCR-insatser klonas i en region som placeras nedströms från Renilla reporter genen. Ligerade produkter förvandlades till kompetenta celler och växte celler på LB-agarplattan. C) enskilda kolonier (#1 till #6) plockades upp och återsuspenderas i 50 μl ultrarent vatten. E. coli suspensionen användes för kolonin PCR och inympning. Colony PCR är ett praktiskt verktyg för att välja de bästa kolonierna för inympning och isolering av luciferas vektorer hartråkig 3 ' utr av en gen. (D) för luciferas analys, Mirna kontroll härma eller Mirna-107 härma var transfekterade till Panc-1 celler med luciferas konstruktioner med hjälp av en 24-brunn tallrik. (E) denna panel visar representativa rådata och beräkning av förhållandet mellan Renilla och Firefly efter att ha utfört luciferas-analysen för validering av en sncg-gen som ett Mirna-107-mål. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Screening av förväntade målgener i miRNA-107. Screening av interaktioner mellan Mirna-107 och 3 ' utr av förväntade mål utfördes i Panc-1 celler med hjälp av luciferas konstruktioner. Baserat på de negativa effekterna av miRNA-107 på cellproliferation, bestämdes potentiella kandidatgener för kloning och screening analyser. Mirna kontroll Mimic eller Mirna-107 härma var transfekterade till Panc-1 celler med luciferas konstruktioner som innehåller 3 ' utr av varje vald gen för 24 h. Förhållandet mellan Renilla till Firefly beräknades och normaliserades baserat på de uppmätta nivåerna av både luciferaser i PANC-1 celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Upptäckt | Mirna | GAPDH |
| Komponenter | ||
| Master Mix för sond-baserade Real-time PCR (2x) | 10 μL | – |
| Mastermix för Dye-baserad realtids PCR (2x) | – | 10 μL |
| Sond blandning (5x) | 4 μL | – |
| GAPDH primers (1 μM vardera) | – | 4 μL |
| Utspädd cDNA (1:49) | 6 μL | 6 μL |
| Total volym | 20 μL | 20 μL |
Tabell 1: villkor som används för en specifik detektion av miRNA och GAPDH i realtids PCR i denna studie.
| Komponenter | 1x reaktion | 7X reaktion |
| 5x buffert | 5 μL | 35 μL |
| dNTP-blandning (2,5 mM vardera) | 2 μL | 14 μL |
| Primers (10 μM vardera) | 1 μL | 7 μL |
| Genomiskt DNA (2 ng/μL) | 16,5 μL | 115,5 μL |
| Polymeras | 0,5 μL | 3,5 μL |
| Total volym | 25 μL | 175 μL |
Tabell 2: sammansättning av PCR-reaktionsblandningar för amplifiering av 3 ' UTR i denna studie.
| Komponenter | 1x reaktion |
| 10X buffert | 5 μL |
| PCR-produkter eller vektorer | PCR-produkter: 25 μL vektorer: 1-2 μg |
| XhoI (eller AsiSI) begränsning enzym | 2 μL |
| För att begränsa | 2 μL |
| Ultrapure vatten | x μL |
| Total volym | 50 μL |
Tabell 3: villkor för dubbel nedbrytning av PCR-produkter och luciferasvektorer med hjälp av XhoI (eller AsiSI) och e-enzymer i denna studie.
| Komponenter | 1x reaktion |
| 10X buffert | 2 μL |
| Vektorer (dubbelt smält) | 50 ng |
| PCR-produkter (Insert) | x μL |
| Ligase | 200 U |
| Ultrapure vatten | y μL |
| Total volym | 20 μL |
Tabell 4: Ligeringreaktioner av DUBBELSMÄLT PCR-produkter och luciferas vektorer med DNA ligasen i denna studie.
Kompletterande figur 1: härledning av ekvation 2 från ekvation 1. Ekvation 2 härleds från ekvation 1 för beräkning av justerade ICx-värden. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 2: primer information. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strategier för bestämning av bona fide miRNA mål med funktioner av en miRNA av intresse är oumbärliga för förståelsen av flera roller miRNAs. Identifiering av miRNA-målgener kan vara en riktlinje för tolkning av cellsignalering-händelser som modulateras av miRNAs i en cell. En avtäckningen av funktionellt viktiga målgener av miRNAs kan ge grundläggande kunskaper för att utveckla en miRNA-baserad terapi i cancer.
Flera metoder såsom Microarrays, små RNA-bibliotek sekvensering, djupsekvensering, omvänd transkriptase in situ PCR, och Northern blotting kan tillämpas för att utforska miRNA uttrycks nivåer med hjälp av totalt RNA isolerat från cellinjer och vävnader24, 25,26. Hög genomströmning profilering av mirnas kan ge värdefull insikt i den genetiska underbyggnad av cancerutveckling. Den sond-baserade miRNA analysen används ofta för att validera profileringsdata och är också lämplig för att skärmen några miRNAs av intresse. Men mätningen av mogna miRNA nivåer med hjälp av sond-baserade realtid PCR är begränsad för att avgöra om mogna miRNAs regleras vid transkription steg eller genom regleringen av mognad. Dye-baserade realtids PCR och Northern blotting har införts för att mäta Mirna föregångare nivåer27,28. Mätning av miRNA prekursorer tillsammans med mogna miRNA nivåer kan ytterligare ge information om hur mogna miRNA nivåer regleras. Vidare, en omfattande förståelse av regleringen av miRNA nivåer är oumbärlig för utvecklingen av miRNA-baserade terapeutiska metoder.
Cell proliferation analyser såsom tetrazolium-baserade MTT-analysen är tillämpliga på skärmen effekterna av behandling reagenser såsom miRNA härmar. Eftersom MTT-analysen återspeglar cellernas metaboliska aktiviteter baserat på tetrazolium-reduktion genom cellulära oxidoreduktaser, är det möjligt att observera bristen på korrelation mellan MTT-analysen och det totala cellnumret19. Alternativt är SRB-analysen tillgänglig som den mest reproducerbara cell uppräknings analysen18,19. Mätning av mängden SRB färgämne bundet till triklorättiksyra fasta proteiner kan representera det totala cellnumret29. Dessutom kan SRB-analysen i detta protokoll tillämpas på skärmen flera Mirna härmar samt anti-cancerläkemedel med 384-bra tallrikar. SRB-analysen har dock begränsningar såsom manuell screening. Dessutom, denna analys är inte tillgänglig för icke-adherenta celler. Eftersom miRNAs också spelar en avgörande roll i hematologisk malignitet såsom lymfom och myelom30, krävs en effektiv övervakning av cellproliferation för att riva upp mirnas funktioner. Karboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) kan intracellulärt märka de icke-adherenta cellerna. CFSE används för att övervaka generering av prolifererande celler med flödescytometri31. Dessutom kan miRNAs påverka invasionen, metastaser och programmerad celldöd. Därför, andra experimentella tekniker som kombinerar med detta protokoll kommer att vara mer praktiskt för en korrekt förståelse av Mirna funktioner, som i slutändan bidrar till att identifiera mångfaldiga biologiskt relevanta mål av mirnas.
Beräkning av den halva maximala inhibitoriska koncentrationen (IC50) är en viktig metod inte bara för Mirna studier utan också för utvärdering av effekten av andra läkemedel mot cancer. IC50 värden kan användas för att jämföra de potentiella effekterna av flera mirnas eller läkemedel mot cancer på cellproliferation. Det har visats att kombinationen av en miRNA-baserad behandling med läkemedel mot cancer kan ge en exceptionell möjlighet att förbättra anti-cancerläkemedlets effekt. Dessutom kan kombinationen av mirnas med läkemedel mot cancer vara en ny metod för att övervinna chemoresistance32,33. För utvärdering av kombinations effektivitet är det fördelaktigt att beräkna justerade ICx-värden baserat på vårt protokoll för bedömning av kombinations index (CI) som möjliggör kvantitativ uppskattning av synergism eller antagonism33 . 34.
Intracellulära signalering nätverk kan vara allmänt oorganiserad av anomalously uttryckt miRNAs i många sjukdomar inklusive cancer. Dock är signal nätverk som påverkas av miRNAs fortfarande mest okända eftersom den lilla andelen av målgener har testats experimentellt och målgener regleras även via icke-kanotiskt reagerande med miRNAs35. Icke desto mindre är vår strategi och protokoll pålitliga metoder för att dechiffrera de cellulära mekanismerna i miRNAs. Dessutom kan vårt protokoll utökas ytterligare för att implementera och utvärdera kombinationen av miRNAs och andra läkemedel mot cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Basic Science Research program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av undervisningsministeriet (2017R1D1A3B03035662); och Hallym universitetets forskningsfond, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
