En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler
Summary
Denne protokollen bruker en sonde-basert sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), en sulforhodamine B (SRB)-analysen, 3 ‘ uoversatt regioner (3 ‘ UTR) kloning, og en luciferase analysen for å verifisere målet gener av en miRNA av interesse og å forstå funksjonene til miRNAs.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er små regulatoriske RNAs som er anerkjent for å modulere en rekke intracellulære signalering trasé i flere sykdommer, inkludert kreft. Disse små regulatoriske RNAs hovedsakelig samhandle med 3 ‘ uoversatt regioner (3 ‘ UTR) av deres mål Messenger RNAs (mRNAs) til slutt resulterer i Hemming av dekoding prosesser av mRNAs og styrking av målet mRNA degradations. Basert på uttrykks nivåer og intracellulære funksjoner, miRNAs er i stand til å tjene som regulatoriske faktorer av kreftfremkallende og tumor-undertrykkende mRNAs. Identifisering av bona fide mål gener av en miRNA blant hundrevis eller kanskje tusenvis av beregningsmessig spådd mål er et avgjørende skritt for å skjelne rollene og grunnleggende molekylære mekanismer av en miRNA av interesse. Ulike miRNA mål prediksjon programmer er tilgjengelig for å søke mulig miRNA-mRNA interaksjoner. Men det mest utfordrende spørsmålet er hvordan man skal validere direkte mål gener av en miRNA av interesse. Denne protokollen beskriver en reproduserbar strategi for viktige metoder for hvordan å identifisere miRNA mål knyttet til funksjonen til en miRNA. Denne protokollen presenterer en praktisk guide på trinn-for-trinn-prosedyrer for å avdekke miRNA nivåer, funksjoner og relaterte mål mRNAs ved hjelp av sonde-basert sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), sulforhodamine B (SRB) analysen etter en miRNA etterligne transfeksjoner , dose respons kurve generasjon, og luciferase analysen sammen med kloning av 3 ‘ UTR av et gen, som er nødvendig for riktig forståelse av rollene til individuelle miRNAs.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) er de små regulatoriske RNAs som i hovedsak modulere prosessen med oversettelse og degradering av Messenger RNAs (mRNAs) ved å reagere på de 3 ‘ uoversatt regioner (3 ‘ UTR) i bona fide mål gener1. Uttrykk for miRNAs kan reguleres av transcriptional og post-transcriptional mekanismer. Ubalansen av slike regulatoriske mekanismer bringer ukontrollert og karakteristiske miRNAs uttrykks nivåer i mange sykdommer, inkludert kreft2. En enkelt miRNA kan ha flere interaksjoner med ulike mRNAs. Tilsvarende kan en individuell mRNA styres av ulike miRNAs. Derfor er intracellulære signalering nettverk intrikat påvirket av utpreget uttrykt miRNAs der fysiologiske lidelser og sykdommer kan initieres og forverret2,3,4, 5 andre priser , 6. selv om den endrede uttrykk for miRNAs har blitt observert i ulike typer kreft, den molekylære mekanismer som modulere oppførsel av kreftceller i forbindelse med miRNAs er fortsatt i stor grad ukjent.
Akkumulere bevis har vist at kreftfremkallende eller tumor-undertrykkende roller miRNAs avhenge av hvilke typer kreft. For eksempel, ved å målrette stallgreip boksen O3 (FOXO3), miR-155 fremmer celle spredning, metastasering, og chemoresistance av tykktarmskreft7,8. I kontrast er begrensningen av glioma celle invasjon indusert av miR-107 via regulering av neurogenic geometriske hakk homologe protein 2 (NOTCH2) uttrykk9. Vurderingen av miRNA-Target interaksjoner i forbindelse med miRNA funksjoner er en uunnværlig del for å bedre forstå hvordan miRNAs regulere ulike biologiske prosesser i både sunne og syke stater10. I tillegg kan oppdagelsen av bona fide mål (er) av miRNAs ytterligere gi en finjustert strategi for en miRNA-basert terapi med ulike anti-kreft narkotika. Den største utfordringen innen miRNAs er imidlertid identifikasjonen av direkte mål for miRNAs. Her er detaljerte metoder presentert som reproduserbar eksperimentelle tilnærminger for miRNA målet genet besluttsomhet. Vellykket eksperimentell design for miRNA målet identifikasjon innebærer ulike trinn og betraktninger (figur 1). Sammenligning av modne miRNA nivåer i tumorceller og normale celler kan være en av de vanligste prosedyrene for å velge en miRNA av interesse (figur 1a). Den funksjonelle studien av en utvalgt miRNA å oppdage virkningene av en miRNA på celle spredning er viktig å innskrenke listen over beste potensielle kandidat mål av en miRNA av interesse (figur 1B). Basert på eksperimentelt validerte funksjoner av miRNAs, en systematisk gjennomgang av litteratur og database i selskap med en miRNA mål prediksjon programmet er nødvendig for å søke den mest relevante informasjonen om gen funksjoner (figur 1C). Identifisering av virkelige målet gener av en miRNA av interesse kan oppnås ved å implementere eksperimenter som luciferase analysen sammen med kloning av 3 ‘ UTR av et gen, sanntids PCR, og vestlige blotting (figur 1d). Målet med den nåværende protokollen er å gi omfattende metoder for viktige eksperimenter, sonden-baserte sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), sulforhodamine B (SRB) analysen etter en miRNA etterligne transfeksjoner, dose-respons kurve generasjon, og luciferase analysen sammen med kloning av 3 ‘ UTR av et gen. Den nåværende protokollen kan være nyttig for en bedre forståelse av funksjonene til individuelle miRNAs og konsekvensen av en miRNA i kreft terapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strategier for fastsettelse av bona fide miRNA mål med funksjonene til en miRNA av interesse er uunnværlig for forståelsen av flere roller miRNAs. Identifisering av miRNA mål gener kan være en retningslinje for å tolke celle signalering hendelsene modulert av miRNAs i en celle. En avsløring av funksjonelt viktige mål gener av miRNAs kan gi den grunnleggende kunnskapen til å utvikle en miRNA-basert terapi i kreft.
Flere metoder som Microarrays, små RNA biblioteket sekvensering, dype s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2017R1D1A3B03035662); og Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
