Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

doi: 10.3791/59628 Published: May 21, 2019

Summary

Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine regelgevende Rna's die worden erkend voor het moduleren van talrijke intracellulaire signalering trajecten in verschillende ziekten, waaronder kankers. Deze kleine regelgevende Rna's communiceren voornamelijk met de 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) van hun doel Messenger RNAs (Mrna's), wat uiteindelijk resulteert in de remming van decoderings processen van Mrna's en de augmentatie van doel mRNA-degraderingen. Op basis van de uitdrukkings niveaus en intracellulaire functies zijn miRNAs in staat om te dienen als regelgevende factoren van oncogene en tumor suppressieve Mrna's. Identificatie van bonafide doel genen van een miRNA tussen honderden of zelfs duizenden computationeel voorspelde doelen is een cruciale stap om de rollen en elementaire moleculaire mechanismen van een miRNA van belang te onderscheiden. Verschillende miRNA target Voorspellings Programma's zijn beschikbaar om te zoeken naar mogelijke interacties van miRNA-mRNA. De meest uitdagende vraag is echter hoe je directe doel genen van een miRNA van belang moet valideren. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare strategie van belangrijke methoden om miRNA-doelen te identificeren die verband houden met de functie van een miRNA. Dit protocol presenteert een praktische gids over stapsgewijze procedures om miRNA-niveaus,-functies en gerelateerde doel-Mrna's te achterhalen met behulp van de sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB)-assay na een miRNA-nabootsen transfectie , dosis-responscurve generatie, en plaats assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen, die nodig is voor een goed begrip van de rollen van individuele miRNAs.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) zijn de kleine regelgevende Rna's die voornamelijk het proces van vertaling en afbraak van boodschapper Rna's (Mrna's) moduleren door te reageren op de 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) in bonafide doel genen1. De expressie van miRNAs kan worden gereguleerd door transcriptionele en post-transcriptionele mechanismen. De onevenwichtigheid van dergelijke regelgevende mechanismen brengt ongecontroleerde en onderscheidende miRNAs-uitdrukkings niveaus in tal van ziekten, waaronder kanker2. Eén enkele miRNA kan meerdere interacties met diverse Mrna's hebben. Dienovereenkomstig kan een individuele mRNA worden bestuurd door verschillende Mirna's. Daarom, intracellulaire signalering netwerken worden ingewikkeld beïnvloed door duidelijk uitgedrukt miRNAs waardoor fysiologische aandoeningen en ziekten kunnen worden geïnitieerd en verslechterd2,3,4, 5 , 6. Hoewel de veranderde expressie van miRNAs is waargenomen in verschillende soorten kankers, zijn de moleculaire mechanismen die de manieren van kankercellen in combinatie met miRNAs moduleren nog steeds grotendeels onbekend.

Accumulerend bewijsmateriaal toont aan dat de oncogene of tumor suppressieve rollen van miRNAs afhangen van de soorten kanker. Door bijvoorbeeld te richten op Forkhead Box O3 (FOXO3) bevordert miR-155 de celproliferatie, metastase en chemoresistance van colorectale kanker7,8. Daarentegen wordt de beperking van glioom celinvasie geïnduceerd door miR-107 via de regulatie van neurogene Locus notch homo Protein 2 (NOTCH2) expressie9. De beoordeling van miRNA-target interacties in verband met miRNA-functies is een onmisbaar onderdeel om beter te begrijpen hoe miRNAs verschillende biologische processen regelt in zowel gezonde als zieke Staten10. Bovendien kan de ontdekking van het bonafide doelwit (en) van miRNAs verder een nauwkeurig afgestemde strategie bieden voor een op miRNA gebaseerde therapie met verschillende anti-kankergeneesmiddelen. De belangrijkste uitdaging op het gebied van miRNAs is echter de identificatie van directe targets van miRNAs. Hier worden gedetailleerde methoden gepresenteerd als reproduceerbare experimentele benaderingen voor de doelbepaling van het miRNA-doelwit. Succesvol experimenteel ontwerp voor de doel identificatie miRNA omvat verschillende stappen en overwegingen (Figuur 1). Vergelijking van volwassen miRNA-niveaus in tumorcellen en normale cellen kan een van de gebruikelijke procedures zijn om een miRNA van belang te selecteren (Figuur 1a). De functionele studie van een geselecteerde miRNA om de effecten van een miRNA op celproliferatie op te sporen is belangrijk om de lijst van de beste potentiële kandidaatdoelen van een miRNA van belang te verfijnen (Figuur 1b). Op basis van de experimenteel gevalideerde functies van miRNAs is een systematische beoordeling van literatuur en database in bedrijf met een miRNA target Voorspellings programma vereist om de meest relevante informatie over genfuncties te doorzoeken (figuur 1c). De identificatie van reële doel genen van een Mirna van belang kan worden bereikt door het uitvoeren van experimenten zoals de plaats-assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen, real-time PCR en Western blotting (figuur 1d). Het doel van het huidige protocol is om uitgebreide methoden te bieden voor belangrijke experimenten, de op sonde gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay na een nabootsen van de miRNA-transactie, het genereren van dosis-responscurve, en plaats assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen. Het huidige protocol kan nuttig zijn voor een beter begrip van de functies van individuele miRNAs en de implicatie van een miRNA bij kankertherapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. volwassen MicroRNA (miRNA) expressie analyse

  1. Volwassen miRNA complementaire DNA (cDNA) synthese
    1. Voeg 254 ng totaal RNA en 4,5 μL deoxyribonuclease I (DNase I)-mengsels toe en voeg vervolgens ultrapuur water toe aan PCR-strip buizen om tot 18 μL (Figuur 2a) te maken. Bereid de reactie voor elk totaal RNA-monster gezuiverd uit verschillende cellijnen met voldoende hoeveelheid DNase I-mengsels op basis van het totale aantal reacties.
      Opmerking: DNase I-mengsels zijn samengesteld uit DNase I (1,8 μL), ribonuclease-remmer (0,3 μL) en 25 mM MgCl2 (2,4 μl). Om totaal RNA reproduceerd te verkrijgen, werd een op kolom gebaseerde extractiemethode gebruikt in plaats van een fenol-chloroform gebaseerde extractiemethode. Er werd gemeld dat de extractieopbrengst van sommige mirna's kan worden gevarieerd afhankelijk van het aantal cellen bij het gebruik van een fenol-chloroform gebaseerde extractiemethode11,12.
    2. Inincuberen van de buizen in een thermische cycler. Voer de buizen gedurende 10 min bij 37 °C en verwarm de DNase I door 5 minuten incubatie bij 90 °C. Leg de buisjes na incubatie onmiddellijk op het ijs.
    3. Breng 7,1 μL DNase I behandeld totaal RNA over in 2 sets nieuwe buisjes en voeg vervolgens 1,5 μL antisense primers toe voor het Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) gen (Figuur 2b).
      Opmerking: De hoeveelheid totaal RNA voor cDNA synthese wordt 100 ng bij deze stap. De voorraad concentratie van GAPDH antisense primers is 10 μM. het toevoegen van GAPDH antisense primers is voor het genereren van GAPDH cDNAs met behulp van een genspecifieke primer methode.
    4. Inincuberen van de buizen met behulp van een thermische cycler. Begin bij 80 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door de reactie bij 60 °C gedurende 5 min. plaats de buisjes onmiddellijk na incubatie op ijs.
    5. Voeg in elke reactie (Figuur 2b) 3,4 μL omgekeerde transcriptie (RT)-enzym mengsels toe. RT-enzym mengsels zijn samengesteld uit 100 mM deoxyribonucleotide-trifosfaten (0,15 μL), 10x RT-buffer (1,5 μL), ribonuclease-remmer (0,75 μL) en reverse transcriptie-enzym (1 μL). Bereid voldoende hoeveelheid mengsels op basis van het totale aantal reacties.
    6. Voeg 3 μL 5x RT primers toe voor een specifieke miRNA in elke reactie (Figuur 2b).
      Opmerking: Het totale volume is 15 μL voor elke reactie.
    7. Voer de buizen met behulp van een thermische cycler. Start bij 16 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door de reactie bij 42 °C gedurende 30 minuten, en tot slot bij 85 °C gedurende 5 min. Houd bij 4 °C gedurende de resterende tijd (Figuur 2b). Enkel gestrande Cdna's worden in deze stap gegenereerd voor zowel een specifiek miRNA-als een GAPDH-gen in dezelfde buis.
  2. Real-time polymerase kettingreactie (PCR) en data-analyse
    1. Verdun elke cDNA met ultrapuur water bij een verhouding van 1:49.
    2. Bereid de reactie mengsels voor op een specifieke miRNA en GAPDH (tabel 1). Voor de detectie van een specifieke Mirna en gapdh, instellen van drievoud reacties voor elk cDNA monster.
    3. Voer de real-time PCR en data-analyse uit (figuur 2c). Analyseer gegevens met behulp van de vergelijkende CT methode13,14.

2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfection

Opmerking: Mirna-107 is geselecteerd uit stap 1. Aangezien miRNA-107 is down-gereguleerd in tumorcellen in vergelijking met normale cellen, het kan worden gespecbeerd dat miRNA-107 is een tumor suppressieve miRNA. In het geval van een miRNA die up-gereguleerd is in tumorcellen in vergelijking met normale cellen (bijv.mirna-301), kan antisense oligonucleotiden tegen mirna-301 worden toegepast voor de stappen 2, 3 en 4.

  1. Tel de cellen met een telkamer apparaat en plaat de cellen in een 96-goed plaat. Celdichtheid is 2 x 103 cellen/100 μL voor elke put. Gebruik geen celkweek media die penicillaire-streptomycine (P/S) bevatten omdat P/S de transfectie-efficiëntie kan verminderen.
  2. Bereid een set transfectie mengsels om de cellen te transfect bij verschillende eindconcentraties miRNA Control nabootsen en miRNA-107 na te bootsen op de volgende dag (Figuur 3).
    1. Van de voorraad (25 μM-concentratie) miRNA-controle nabootsen of miRNA-107 nabootsen, verdunnen en toevoegen van overeenkomstige hoeveelheid controle nabootsen of miRNA-107 nabootsen in de gereduceerde serum Media samen met een transfectiereagens met behulp van microcentrifuge buizen (Figuur 3a). Meng de oligo bevattende mengsels zachtjes met behulp van een micro pipet. De totale hoeveelheid oligos (miRNA nabootsen Control + miRNA-107 nabootsen) moet in elk goed hetzelfde zijn. Lege putten omvatten 100 μL celkweek media en gereduceerde serum media die een transfectie-reagens zonder cellen bevatten.
  3. Meng na een incubatie van 10 minuten in een celcultuurkap zachtjes de oligo die mengsels bevat en voeg vervolgens 50 μL van de mengsels toe aan elk goed. Bewaar de cellen in een celkweek incubator. Vervang het transfectiereagens met media met de verse celkweek media die zowel foetaal runderserum (FBS) als P/S na 6-12 h incubatie bevatten. Verdere incuberen de cellen voor 72 h. De totale behandelingsduur van miRNA nabootsen is 96 uur.

3. sulforhodamine B (SRB) test

  1. Celfixatie
    1. Verwijder de celkweek media in elke put van de plaat en vul snel 100 μL van 10% Trichloorazijnzuur (TCA) in elke put. Aspiraat de celkweek media van elk goed om celbeschadiging en loslating van de bodem te voorkomen.
      Opmerking: Bereid 40% TCA voor door 20 g TCA poeder toe te voegen aan 50 mL gedistilleerd water. Van 40% TCA, maken 10% TCA door verdunning 40% TCA met gedestilleerd water met een 1:3 verdunningsverhouding.
    2. Bewaar de plaat met 10% TCA in een koelkast (4 °C) gedurende 1 uur.
    3. Was de plaat meerdere malen door in het water bad te smelten en te drogen. Verwijder overtollig water uit de putjes door op de plaat te tikken totdat er geen water meer in de putjes zit. Laat de plaat op een laboratorium Bank drogen voordat u naar de volgende stap gaat.
  2. Celkleuring
    1. Pipetteer 50 μL van 0,4% SRB-oplossing in elk putje inclusief lege putten. Schud de plaat zachtjes tot 0,4% SRB-oplossing de bodem van putten consequent bedekt.
      Opmerking: Bereid en gebruik 0,4% SRB-oplossing door 0,4 g SRB-poeder toe te voegen aan 100 mL van 1% azijnzuur. Schud de oplossing voorzichtig om deze te mengen. Wikkel de fles van 0,4% SRB-oplossing in een licht beschermend materiaal zoals aluminiumfolie. Bewaar 0,4% SRB-oplossing in een koelkast.
    2. Na incubatie 40 min tot 60 min, was de plaat door het spoelen met 1% azijnzuur. Was de plaat totdat de ongebonden kleurstof volledig is weggewassen (Figuur 3b).
    3. Laat de plaat op een laboratorium Bank drogen voordat u naar de volgende stap gaat.
      Opmerking: De plaat moet volledig worden gedroogd voordat u naar stap 3,3 gaat.
  3. Extinctie meting
    1. Pipetteer 100 μL tris-basisoplossing (10 mM) in de bijbehorende putten, inclusief lege putten. Houd de plaat 10 min op een shaker. meet de extinctie op 492 nm.

4. genereren van een dosis-respons curve

  1. Analyseer de SRB-testgegevens in een spreadsheet. Trek de blanco extinctie af van de extinctiewaarden van elke groep en bereken het gemiddelde (AVE) en de standaarddeviatie (STD) van de extinctiewaarden van elke groep.
  2. Bereken het percentage van de gemiddelde extinctie (AVE%) en die van de standaarddeviatie (STD%) van elke groep met absorptie waarden van de SRB-test.
    Opmerking: De AVE% van miRNA Control nabootsen behandelde groep is 100%. Bereken de STD% met behulp van de volgende formule: STD% = (STD van elke groep/AVE-absorptie van besturingselement nabootsen behandelde groep) x 100.
  3. Importeer de onbewerkte gegevens inclusief behandelings concentraties, AVE% en STD% in de software door deze gegevens verticaal te uitlijnen. Aangezien log 0 niet is gedefinieerd, stelt u de eerste concentratie van de X-as in op een waarde die dicht bij0 ligt (bijvoorbeeld 0,01).
  4. Klik op het tabblad grafiek maken en kies eenvoudige Scatter-Error bars. Selecteer werkblad kolommen als symbool waarden en klik op volgende. Selecteer in het deelvenster gegevensindeling XY-paren en klik op volgende. Selecteer corresponderende gegevenskolommen in het deelvenster gegevens selecteren. Klik op de knop Voltooien om het plot te maken.
    Opmerking: De X-as vertegenwoordigt de concentraties, de Y-as geeft het percentage van de gemiddelde extinctie van elke concentratie aan (AVE%), en de foutbalken wijzen op het percentage van de standaarddeviatie van elke concentratie (STD%).
  5. Dubbelklik op de X-as om het type schaal en het schalen van de as te wijzigen. Wijzig het type schaal van lineair in logboek. Wijzig het begin-en eindbereik nummer in respectievelijk 0,01 en 200.
  6. Klik met de rechtermuisknop op een spreidings plot, kies curve fit en ga naar de door de gebruiker gedefinieerde subcategorie. Selecteer dosis-responscurve, klik op volgende knoppen en klik vervolgens op afwerking knop. De dosis-responscurve wordt nu samen met een rapporttabblad gegenereerd (figuur 4a).
    1. Als u vergelijking 1 in de software wilt invoeren voor het genereren van een dosis-responscurve, klikt u op het tabblad analyse en selecteert u regressie wizard. Ga naar door de gebruiker gedefinieerde in de vergelijkings categorie en klik vervolgens op de knop Nieuw . Voeg vergelijking 1, variabelen, initiële parameters en beperkingen in de corresponderende lege vakken in (figuur 4b, C). Klik op toevoegen als knop en stel de naam van de vergelijking in als dosis-responscurve. De vergelijkings naam wordt nu gegenereerd in de subcategorie die door de gebruiker is gedefinieerd in de vergelijkings categorie. f geeft het percentage van de levensvatbaarheid van de cel (% levensvatbaarheid van de cel) aan in vergelijking 1.

Vergelijking 1
Equation 1

  1. Ga naar het tabblad rapport en controleer de n-, k-en R-waarden.
    Opmerking: y0 geeft 100% cellevens vatbaarheid van Mirna Control nabootsen behandelde groep, n geeft de Hill-type coëfficiënt aan (de helling van een perceel), k geeft de concentratie aan van mirna-107 nabootsen die een 50% van het maximale effect van de mirna-107 nabootsen (de helft de maximale remmende concentratie, IC50) en R geeft de residuele onaangetast fractie (de weerstands Fractie)15aan. De vergelijking die wordt gebruikt om een dosis-responscurve te genereren, herkent het bereik van y0 tot R-waarde (indien van belang) als 100% (figuur 4a). Daarom is het noodzakelijk om de aangepaste waarde k (IC50) te verwerven die wordt berekend op basis van het bereik van y0 tot een waarde van nul (figuur 4a). Aangepaste k (IC50) samen met andere ICX-waarden (bijv.IC10 tot en met IC90) kan worden verkregen met behulp van vergelijking 2, die is afgeleid van vergelijking 1. De afleiding van vergelijking 2 van vergelijking 1 is aangegeven in aanvullend figuur 1.

Vergelijking 2
Equation 2

  1. Dubbelklik op de linkermuisknop in de cel waarin vergelijking 2 wordt toegepast. Met behulp van vergelijking 2 en parameters van de gegenereerde dosis-responscurve, is het beschikbaar voor het berekenen van de gecorrigeerde waarden van ICx, variërend van IC10 tot IC90 (figuur 4D).
  2. Voer het gelijkteken in, gevolgd door de formule die begint met een haakje in de cel. Wanneer u de formule invoert, repareert u de waarde van n, k en R als absolute celverwijzingen door het dollarteken toe te voegen aan de corresponderende kolom en rij, zodat deze vaste waarden niet worden gewijzigd wanneer de formule automatisch wordt gevuld tot de rijen (figuur 4D). Als alternatief kunnen aangepaste waarden handmatig worden berekend met behulp van vergelijking 2.
    Opmerking: IC90 -waarde wordt niet bepaald omdat de R-waarde groter dan 10 is. Bovendien, als R-waarde hoger is dan 20, wordt de waarde van IC80 ook niet bepaald (figuur 4D).

5. verificatie van het directe doel gen van een MicroRNA van belang

Opmerking: Na het uitvoeren van het functionele experiment, zoals de SRB-test, wordt miRNA-107 bevestigd als een tumor suppressieve miRNA en is het zeer mogelijk dat miRNA-107 zich rechtstreeks richt op oncogenen. Controleer de lijst met alle voorspelde doel genen met een miRNA target Voorspellings programma zoals Target scan (http://www.targetscan.org/vert_71/) en Verfijn vervolgens de potentiële kandidaatdoelen op basis van de functie van een gen in databases, waaronder PubMed en GeneCards.

  1. Primer ontwerp voor het klonen van 3 ' onvertaalde regio (UTR)
    1. Zet de naam van een gen in GeneCards (https://www.genecards.org/) en klik op het symbool van een gen. Beoordeel ENSEMBL genoome browser door op ENSEMBL id van een gen te klikken en klik vervolgens op transcriptsid in de transcript tabel. Klik daarna op Exonen bestonden in de lijst op transcript gebaseerde weergaven aan de linkerkant.
    2. Kopieer de nucleotide sequenties van de 3 ' UTR en plak deze in het primer ontwerpprogramma. Kopieer de reeksen opnieuw vanuit dit programma en plak deze in een tekstverwerker. Controleer de aanwezigheid van miRNA bindende sequenties evenals de aanwezigheid van restrictie enzymen sites gebruikt voor het klonen.
      Opmerking: Als er geen restrictie-enzym herkennings locaties binnen de 3 ' UTR zijn, kunnen de voor het klonen geselecteerde beperkings enzymen worden gebruikt voor de volgende stap.
    3. In de primer ontwerpprogramma, accepteer de 3 ' UTR sequenties en beginnen met het ontwerpen van de voorwaartse en omgekeerde primers met de volgende voorwaarde. Lengte: 20-30 nucleotiden, TM: 45-58 °C, GC%: 40-60%. Het verschil tussen de TM-waarden van de twee primers moet lager zijn dan 5 °C. De primer sequenties die in deze studie worden gebruikt, zijn beschikbaar in aanvullende figuur 2. Voeg restrictie-enzym herkennings sequenties en 4 willekeurige nucleotiden toe aan de ontworpen primers.
  2. Verloop PCR
    1. Bereid 25 μL PCR-reactie mengsels, inclusief ontworpen primers per één gloeien temperatuur (tabel 2). Bereid voldoende hoeveelheid mengsels op basis van het totale aantal reacties. Meng de oplossing door Pipetteer en voeg 25 μL reactie mengsels toe aan elke buis. Centrifugeer de buizen enkele seconden.
    2. Voer 35-40 PCR-cycli uit van denaturatie stap tot uitbreidings stap. Stel de PCR-cyclus in als de volgende stappen: 98 °C gedurende 1 minuut (1 cyclus, polymerase activatie stap), 95 °C gedurende 10 sec. (denaturatie stap), 45 °C-68 °C gedurende 30 sec. (gloei stap), 68 °C (uitbreidings stap, 10 s-1 min per 1000 BP), 68 °C gedurende 3 min (beëindigings stap) en afkoelen tot 4 °C.
    3. Voer de PCR-producten uit en controleer de banden op een 1% agarose-gel met DNA-ladders. Zoek de beste gloeien temperatuur (figuur 5a). Versterk 3 ' UTR van een gen opnieuw met de beste gloeien temperatuur voor de volgende stap.
  3. Dubbele spijsvertering
    1. Maak de reactie mengsels met inbegrip van twee restrictie enzymen, XhoI (of AsiSI) en NotI, in een buis (tabel 3). Inbroed de mengsels voor 3-4 uur met behulp van een waterbad (37 °C).
    2. Voer de dubbel verteerde producten uit op een 1% agarose gel en snijd de banden vervolgens onder UV-licht. In het geval van plaats vectoren, voordat u op een gel draait, reageren dubbele verteerde vectoren met 10 U alkalische fosfatasen voor nog eens 1 h om een recirculatie tijdens de ligatie stap te voorkomen.
    3. Reinig de dubbel verteerde PCR-producten en plaats-vectoren uit de bekrachtigd bands.
  4. Ligatie van PCR-producten in de plaats-vectoren
    1. Breng 20 μL ligatie-reactie mengsels met inbegrip van de DNA-ligase (tabel 4).
      Opmerking: De molaire verhouding van PCR-product (insert) tot plaats vector kan 3:1 zijn. 1:1 of 2:1.
    2. Centrifugeer de buis kort voor 10-15 s en incuberen bij 16 °C 's nachts met behulp van een thermische cycler.
      Opmerking: Als alternatief kan de buis gedurende 2-3 dagen bij 4 °C worden geïnineerd voor de ligatie. In deze stap wordt de PCR-insert gekloond in de regio die stroomafwaarts van een renilla reporter-gen (Figuur 5b) wordt geplaatst. De binding van miRNAs aan de gekloonde 3 ' UTR van een gen kan afnemen in de renilla-activiteit. Firefly plaats is voor de normalisering van renilla expressieniveaus.
  5. Transformatie en kolonie PCR
    1. Voeg de ligatie mengsels (3-5 μL) toe aan de buis die de bevoegde cellen bevat. Tik zachtjes op de buis en houd deze op ijs (20 min).
      Opmerking: Ontvries bevoegde cellen op ijs voordat u de ligatie mengsels toevoegt.
    2. Breng de buis snel en voorzichtig over naar een warmte blok. Na een hitteschok (42 °C gedurende 30 s-1 min), plaatst u de buis op ijs gedurende 20 minuten.
    3. Verdeel de competente cellen op de Luria-Bertani (LB) agar plaat. Kweek de competente cellen in een incubator (37 °C) 's nachts.
      Opmerking: Ampicillaire (50-100 μg/mL) is opgenomen in de agar-plaat.
    4. Kies een individuele kolonie en resubreng E. coli in een van de 8-stroken buizen met ultrapuur water. Herhaal deze stap om E. coli te hervatten uit willekeurig geselecteerde 4-8 kolonies (figuur 5c).
    5. Breng 25 μL E. coli suspensie over in een andere set van 8-stroken buizen. Nu, er zijn 2 sets van buizen van E. coli schorsing.
      Opmerking: Eén buis is voor kolonie PCR en een andere is voor inoculatie. E. coli suspensie voor inoculatie kan tijdelijk worden bewaard bij 4 °C (figuur 5c).
    6. Voer de kolonie PCR uit met behulp van E. coli suspensie. Deze stap is om te bepalen of de kolonies een insert bevatten. Selecteer de beste kolonies voor het inoculeren en isoleren van plaats vectoren harkotteren 3 ' UTR van een gen (figuur 5c).
      Opmerking: Herhaal stap 5.1-5.5 voor elke 3 ' UTR van geselecteerde genen. Volg de toestand van de PCR-reactie in tabel 2 door het GENOMISCHE DNA te vervangen door E. coli suspensie.
  6. Luciferase-test
    1. Bereid een 24-goed bord. Gebruik 1-2 x 104 cellen in 500 μL celkweek media voor elke put. Gebruik geen celkweek media die P/S voor de transfectie bevatten, omdat het gebruik van P/S de transfectie-efficiëntie kan verminderen.
    2. Transfect 50 ng van plaats vectoren in de cellen met controle nabootsen of een specifieke Mirna nabootsen met behulp van een transfectie reagens (figuur 5d). Als het screenen van de effecten van een specifieke miRNA bij meer dan één concentratie, de totale hoeveelheid oligos dezelfde in elk goed te houden (zie stap 2).
    3. Was de binnenkant van putjes tweemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op de volgende dag.
    4. Breng 200 μL lysisreagens in de putjes aan en voer cellysis voldoende uit voordat u de plaats-activiteit meet.
      Opmerking: Houd de plaat minstens 15 min op een schud plaat.
    5. Breng 5-10 μl cellysaat over in de nieuwe buis en voeg 100 μL reagens I. Meng de oplossing onmiddellijk door Pipetteer en lees de Firefly plaats-activiteit met behulp van een luminometer.
      Opmerking: Lees de Firefly plaats activiteit voor 10-15 s.
    6. Voeg 100 μL reagens II toe in dezelfde buis en meng door tweemaal te pipetteren. Lees de renilla plaats-activiteit voor 10-15 s met een luminometer. Herhaal stap 5.6.5 en 5.6.6 voor elk voorbeeld.
    7. Bereken de verhouding van renilla met Firefly (figuur 5e).
      Opmerking: De activiteit van Firefly vertegenwoordigt de transfectie efficiëntie van plaats constructies in de cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een geslaagde en nauwkeurige bevestiging van miRNA-niveaus is belangrijk voor de interpretatie van gegevens waarmee de classificatie van miRNAs mogelijk is op basis van de verwachte rollen van miRNAs in de ontwikkeling en progressie van een ziekte. De niveaus van miRNA-107 en miRNA-301 werden gemeten in drie pancreas cellijnen met behulp van de op sonde gebaseerde kwantitatieve PCR. De synthese van Cdna's van zowel een specifieke miRNA als een referentie-gen in dezelfde reactie kan de reproduceerbaarheid van gegevens vergroten. PANC-1 en CAPAN-1 zijn menselijke pancreas ductale adenocarcinoom cellijnen, terwijl HPNE is een vereeuwigd alvleesklier duct cellijn getransduceerde met een retrovirale expressie vector harkotteren de menselijke telomerase reverse transcriptase (hTERT) gen. miRNA-107 werd significant verlaagd in PANC-1-en CAPAN-1-cellen in vergelijking met HPNE-cellen (figuur 2c). De niveaus van miRNA-301 waren significant up-gereguleerd in PANC-1-en CAPAN-1-cellen in vergelijking met HPNE-cellen. Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere rapporten dat Mirna-107 epigenetisch geïnactiveerd in pancreaskanker cellen en dat Mirna-301 niveaus hoger in alvleesklier ductale adenocarcinoom cellen zijn dan normale alvleesklier ductale cellen16, 17.

De 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromide (MTT) test weerspiegelt cel metabole activiteiten. Deze functie heeft een aanzienlijk hogere kans om het gebrek aan correlatie tussen de MTT-test en het totale celnummer te verwerven, aangezien de testomstandigheden, waaronder een soort behandelings reagentia, ernstige gevolgen kunnen hebben voor de enzymatische reductie van Tetrazolium 18,19. Om deze beperking te overwinnen, werd de sulforhodamine B (SRB) test toegepast om de effecten van miRNA-107 op celproliferatie te meten om de mogelijke biologische functies van miRNA-107 te identificeren. De hoeveelheid gebonden SRB-kleurstof in de vaste cellen kan worden gebruikt als surrogaat van de verandering in het totale aantal cellen. De SRB-test in deze studie toont duidelijk aan dat de proliferatie van PANC-1-cellen daalde na een miRNA-107-nabootsing van transfectie (Figuur 3). De miRNA-107-concentratie die een remming van de levensvatbaarheid van 50% cel veroorzaakte (IC50) werd bepaald door de aanmaak van een dosis-responscurve. Bovendien is de toepassing van vergelijking 2 nuttig voor het berekenen van alle mogelijke remmende concentraties (ICx) voor het nauwkeurig evalueren van de effecten van miRNA-107 (Figuur 4).

Onderzoek van de correlatie tussen miRNAs en mRNAs-niveaus is een effectieve manier voor de identificatie van de Mirna-doelstelling, omdat miRNAs doel genniveaus kan reguleren via de afbraak van mRNAs2,20. Echter, omdat miRNAs ook op het translationeel niveau handelt zonder de processen van mRNA-degradatie te beïnvloeden, is de experimentele validering van Mirna-target-geninteracties met behulp van de plaats-test een essentiële stap. Het belangrijkste voordeel van een plaats-test is dat deze test de veranderingen van mRNA-niveaus kan uitbuiten die worden gereguleerd door de afbraak van mRNAs21. Daarom is het klonen van 3 ' UTR van voorspelde doel genen een belangrijke stap om echte doel genen van een miRNA van belang te identificeren in combinatie met real-time PCR-en Western Blot-experimenten. Een efficiënt gebruik van de Dual reporter vectoren maakt het mogelijk om ondubbelzinnige experimentele gegevens te verwerven, omdat de meting van Control reporter niveaus de experimentele variaties zoals het aantal cellen kan verminderen. Normalisatieprocessen van de plaats-testgegevens verkregen uit vectoren die 3 ' UTR van een synucleine gamma (sncg) gen bevatten, worden weergegeven in figuur 5e. Bovendien blijkt uit de screening van 11 potentiële voorspelde targets van Mirna-107 duidelijk dat alleen sncg, een positieve regulator van tumor celgroei22,23, rechtstreeks samenwerkt met Mirna-107 in panc-1 cellen (Figuur 6). Deze bevinding geeft aan dat miRNA-107 de proliferatie van PANC-1-cellen negatief kan reguleren door de SNCG-uitdrukking te moduleren.

Figure 1
Figuur 1: experimenteel ontwerp voor de identificatie van de miRNA-target. Dit diagram toont de stroming van een experimenteel ontwerp dat helpt om het doelwit van een miRNA te identificeren. A) de analyse van de uitdrukkings niveaus van volwassen Mirna en de selectie van een belang van Mirna. B) Er kunnen drie experimenten worden uitgevoerd, zoals de Mirna-nabootser transfectie, de SRB-test en de aanmaak van een dosis-responscurve voor de functionele studie van geselecteerde miRNAs. (C) het is nuttig om de informatie en functie van voorspelde doel genen in doel Voorspellings Programma's, pubmed en genecard te controleren om de kandidaatdoel genen van een van belang zijnde Mirna te beperken. D) na het opsporen van enkele potentiële kandidaatdoel genen van een Mirna van belang, is het haalbaar om praktische experimenten uit te voeren, zoals het klonen van 3 ' UTR van mrna's, plaats-Assay, real-time PCR en Western Blot om eindelijk het directe doelwit te bewijzen genen van een miRNA van belang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: volwassen miRNA-expressie analyse. A) Voeg totaal RNA toe van elke CELLIJN (panc-1, capan-1 en hpne), DNase I-mengsels en ultrapuur water in gelabelde strip buizen. Het totale volume in elke buis is 18 μL (panc-1 en capan-1 zijn pancreaskanker cellijnen, terwijl hpne een normale alvleesklier duct cellijn is). B) Breng 7,1 μl DNase I behandelde mengsels over in 2 sets nieuwe strip buizen en in elke buis wordt ook 1,5 μL antisense primers voor een gapdh-gen toegevoegd. Incubate PCR-buizen bij aangegeven reactieomstandigheden. Voeg vervolgens RT-enzym mengsels en 5x RT-primers toe voor een specifieke miRNA (miRNA-107 of miRNA-301) in de aangewezen buisjes en voer de buisjes vervolgens opnieuw uit onder de aangegeven omstandigheden. Enkel gestrande Cdna's voor een specifieke miRNA en GAPDH worden gegenereerd. (C) volwassen mirna-107 en mirna-301 niveaus werden bepaald door de sonde-gebaseerde real-time PCR met behulp van totaal RNA geïsoleerd van panc-1, capan-1, en hpne cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: nabootsen van transfectie en de SRB-test. (A) bovenste paneel toont de verdunning van Mirna Control nabootsen en Mirna-107 nabootsen om transfectie mengsels voor te bereiden. Het bereik van de eindconcentraties van miRNA-107 nabootsen is 0 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM en 100 nM. Totale volume in elke kolom is voor de transfectie van cellen in een put van een 96-goed plaat. Onderste paneel toont een voorbeeld van het opschalen van de transfectie mengsels om voldoende hoeveelheid mengsels voor de transfectie van de cellen in te bereiden in 4 putjes bij een aangegeven concentratie. Voeg vervolgens 50 μL mengsels toe aan elk goed door het voorgestelde formaat voor het transfecteren van miRNA Control na te bootsen met miRNA-107 nabootsen. Deze plaat werd gebruikt voor de SRB-test, die celfixatie, celkleuring en absorptie meting omvat. (B) werkelijke afbeelding van de 96-goed plaat die de SRB bevlekte cellen toont. Dit beeld toont duidelijk aan dat het aantal PANC-1 cellen afneemt naarmate de concentratie van miRNA-107 nabootsen toeneemt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: aanmaak van een dosis-responscurve. A) eenrepresentatieve dosis-responscurve van Mirna-107 die GETRANSSINFECTEERDE panc-1-cellen nabootsen. De cellen werden continu geïnventariseerd voor 96 h. parameters die zijn verkregen uit de dosis-responscurve worden ook weergegeven. B) de vergelijking, variabelen, initiële parameters en beperkingen, samen met de beschrijvingen van definities en waarden. C) de definities en waarden in de overeenkomstige deelvensters van de software invoegen. De "f" geeft de% levensvatbaarheid van de cel aan (de waarde van "f" is bijvoorbeeld "90" en "10" bij IC10 en IC90). De y0-waarde is 100 en geeft de levensvatbaarheid van de cel 100% van de miRNA Control nabootsen van getransfunde cellen. De "n" geeft de Hill-type coëfficiënt aan (de helling van een plot). De "k" geeft de concentratie aan van miRNA-107 nabootsen die een 50% van het maximale effect van de miRNA-107 nabootsen (IC50). De "R" geeft de resterende onaangetast breuk aan (de weerstands Fractie). (D) dit panel laat zien hoe aangepaste ICX-waarden worden berekend op basis van de parameters (n, k en R) die zijn verkregen uit vergelijking 1. Het percentage (%) de levensvatbaarheid van de cel in het deelvenster vertegenwoordigt "f" in vergelijking 1 en wordt berekend door de x-waarde van elke ICx af te trekken van y0 (100). Vergelijking 2 in de formulebalk van het werkblad wordt aangeduid als "= ((100-D3)/(D3-$B $5)) ^ (1/$B $3) * $B $4)" voor de berekening van aangepaste IC10 -waarde. Pas vergelijking 2 toe op andere cellen voor het berekenen van andere ICx-waarden door op de linker muisknop op de geselecteerde cel (rode kleur) te drukken en omlaag te slepen naar de cel van de IC90 -waarde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: verificatie van het directe doel gen van een belang van miRNA. Experimenten beginnen met het ontwerpen van primers voor het klonen van 3 ' UTR. Primers worden gebruikt voor de verloop PCR. A) de beste gloeien temperatuur kan worden gekozen uit de zes aangegeven gloeien temperaturen om 3 ' UTR van een gen te versterken. Volgende, dubbele spijsvertering wordt uitgevoerd met restrictie enzymen en PCR-producten worden gekoppeld in plaats vectoren. (B) Luciferase vectoren met 2 reporter genen, Firefly en renilla Luciferase, kunnen worden gebruikt om de interacties van miRNAs met 3 ' UTR van mrna's te schermen. PCR-inserts worden gekloond in een gebied dat stroomafwaarts van het renilla reporter gen wordt geplaatst. Ligated producten werden omgezet in competente cellen en groeiden cellen op de LB agar plaat. C) individuele kolonies (#1 tot #6) werden opgepikt en gehersuspendeerd in 50 μL ultrapuur water. De E. coli suspensie werd gebruikt voor de kolonie PCR en inoculatie. Colony PCR is een handig hulpmiddel om de beste kolonies te selecteren voor de inoculatie en isolatie van plaats vectoren harkotteren 3 ' UTR van een gen. D) voor de plaats-test werd MiRNA-Control nabootsen of Mirna-107-nabootsen omgezet in panc-1-cellen met plaats-constructies met behulp van een 24-put-plaat. E) dit panel demonstreert de representatieve ruwe gegevens en de berekening van de ratio van renilla aan Firefly na het uitvoeren van de plaats-test voor de validering van een sncg-gen als een Mirna-107-doel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Screening van voorspelde doel genen van miRNA-107. Screening van interacties tussen miRNA-107 en 3 ' UTR van voorspelde doelen werd uitgevoerd in panc-1 cellen met behulp van de plaats constructs. Op basis van de negatieve effecten van miRNA-107 op celproliferatie werden potentiële kandidaatgenen bepaald voor het klonen en screenen van testen. Mirna-controle nabootsen of Mirna-107-nabootsen werd omgezet in panc-1-cellen met plaats-constructies die 3 ' UTR van elk geselecteerd gen voor 24 uur bevatten. De verhouding van renilla tot Firefly werd berekend en genormaliseerd op basis van de gemeten niveaus van beide luciferasen in PANC-1 cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Detectie Mirna GAPDH
Onderdelen
Master mix voor sonde-based Real-time PCR (2x) 10 μL
Master mix voor Dye-based Real-time PCR (2x) 10 μL
Sonde mengsel (5x) 4 μL
GAPDH primers (1 μM per stuk) 4 μL
Verdund cDNA (1:49) 6 μL 6 μL
Totaal volume 20 μL 20 μL

Tabel 1: voorwaarden die worden gebruikt voor een specifieke detectie van miRNA en GAPDH door de real-time PCR in deze studie.

Onderdelen 1x reactie 7X-reactie
5x buffer 5 μL 35 μL
dNTP mengsel (2,5 mM elk) 2 μL 14 μL
Primers (10 μM per stuk) 1 μL 7 μL
Genomisch DNA (2 ng/μL) 16,5 μL 115,5 μL
Polymerase 0,5 μL 3,5 μL
Totaal volume 25 μL 175 μL

Tabel 2: samenstelling van PCR-reactie mengsels voor de versterking van 3 ' UTR in deze studie.

Onderdelen 1x reactie
10x buffer 5 μL
PCR-producten of vectoren PCR-producten: 25 μL vectoren: 1-2 μg
XhoI (of AsiSI) restrictie-enzym 2 μL
NotI restrictie-enzym 2 μL
Ultrapuur water x μL
Totaal volume 50 μL

Tabel 3: voorwaarden voor de dubbele vertering van PCR-producten en plaats-vectoren met behulp van xhoi (of asisi) en noti-enzymen in deze studie.

Onderdelen 1x reactie
10x buffer 2 μL
Vectoren (dubbel verteerd) 50 ng
PCR-producten (insert) x μL
Ligase 200 U
Ultrapuur water y μL
Totaal volume 20 μL

Tabel 4: Ligatie reacties van dubbel verteerde PCR-producten en plaats vectoren met de DNA-ligase in deze studie.

Aanvullend figuur 1: de afleiding van vergelijking 2 van vergelijking 1. Vergelijking 2 is afgeleid van vergelijking 1 voor de berekening van aangepaste ICx-waarden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend figuur 2: primer informatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strategieën voor de bepaling van bonafide miRNA-doelen met de functies van een miRNA van belang zijn onmisbaar voor het begrijpen van meerdere rollen van miRNAs. Identificatie van de doel genen van miRNA kan een leid waarde zijn voor het interpreteren van de cel signalering van gebeurtenissen die door miRNAs in een cel worden gemoduleerd. Een ontveiling van functioneel belangrijke doel genen van miRNAs kan de fundamentele kennis bieden om een op miRNA gebaseerde therapie in kanker te ontwikkelen.

Verschillende methoden zoals micro arrays, Small RNA Library sequencing, Deep sequencing, reverse transcriptase in situ PCR en Northern blotting kunnen worden toegepast om miRNA-uitdrukkings niveaus te verkennen met behulp van totaal RNA geïsoleerd uit cellijnen en weefsels24, 25,26. Hoge doorvoer profilering van miRNAs kan waardevol inzicht bieden in de genetische onderbouwing van de ontwikkeling van kanker. De sonde-gebaseerde miRNA test wordt vaak gebruikt om profileringsgegevens te valideren en is ook geschikt om een paar miRNAs van belang te schermen. De meting van volwassen miRNA-niveaus met behulp van de op sonde gebaseerde real-time PCR is echter beperkt om te bepalen of volwassen Mirna's worden gereguleerd bij de transcriptie stappen of door de regulering van rijping. Op kleurstof gebaseerde real-time PCR en Northern blotting zijn geïntroduceerd om Mirna precursor niveaus27,28te meten. Meting van de miRNA-precursoren samen met volwassen miRNA-niveaus kunnen verder de informatie verschaffen over hoe volwassen miRNA-niveaus worden gereguleerd. Bovendien is een uitgebreid begrip van de regulering van de miRNA-niveaus onontbeerlijk voor de ontwikkeling van therapeutische benaderingen op basis van miRNA.

Celproliferatie testen zoals de tetrazolium-gebaseerde MTT-test zijn van toepassing op het scherm van de effecten van behandelings reagentia zoals miRNA Mimics. Aangezien de MTT-test de metabolische activiteiten van de cel weerspiegelt op basis van de tetrazolium-reductie door cellulaire oxidoreductases, is het mogelijk om het gebrek aan correlatie tussen de MTT-test en het totale celnummer19te observeren. Als alternatief is de SRB-test beschikbaar als de meest reproduceerbare celopsomming bepaling18,19. Meting van de hoeveelheid SRB Dye gebonden aan trichloorazijnzuur vaste eiwitten kan het totale aantal cellen29. Bovendien, de SRB assay in dit protocol kan worden toegepast op het scherm meerdere Mirna bootst, evenals anti-kanker drugs met behulp van 384-well platen. De SRB-test heeft echter beperkingen zoals handmatige screening. Bovendien is deze test niet beschikbaar voor niet-aanhandige cellen. Aangezien miRNAs ook een cruciale rol speelt bij hematologische maligniteiten zoals lymfoom en myeloom30, is een efficiënte monitoring van celproliferatie vereist om de functies van miRNAs te ontrafelen. Carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) kan intracellulaire etikettering van de niet-aanhandige cellen. CFSE wordt gebruikt voor het bewaken van de generatie van prolifererende cellen door flow flowcytometrieonderzoeken31. Daarnaast kan miRNAs de invasie, metastase en geprogrammeerde celdood beïnvloeden. Daarom zullen andere experimentele technieken die met dit protocol worden gecombineerd praktischer zijn voor een goed begrip van de miRNA-functies, die uiteindelijk bijdragen aan het identificeren van multitudineuze biologisch relevante doelen van miRNAs.

Berekening van de halve maximale remmende concentratie (IC50) is een belangrijke methode, niet alleen voor de Mirna-studies, maar ook voor de werkzaamheids evaluatie van andere anti-kankergeneesmiddelen. IC50 -waarden kunnen worden gebruikt om de potentiële effecten van verschillende miRNAs of anti-kanker drugs op celproliferatie te vergelijken. Het is aangetoond dat de combinatie van een miRNA-gebaseerde therapie met anti-kanker medicijnen een uitzonderlijke kans kan bieden om de werkzaamheid van de anti-kanker drug te verbeteren. Bovendien kan de combinatie van miRNAs met anti-kanker drugs een nieuwe aanpak zijn om chemoresistance32,33te overwinnen. Voor de evaluatie van de combinatie-efficiëntie is het voordelig om aangepaste ICx-waarden te berekenen op basis van ons protocol voor de beoordeling van de combinatie index (CI), waarmee de kwantitatieve schatting van synergie of antagonisme33mogelijk is, 34.

Intracellulaire signalering netwerken kunnen op grote schaal worden ongeorganiseerd door afwijkend uitgedrukt miRNAs in tal van ziekten, waaronder kankers. De signalerings netwerken die door miRNAs worden aangetast, zijn echter nog grotendeels onbekend omdat het kleine deel van de doel genen experimenteel is gevalideerd, en doel genen worden ook gereguleerd via niet-canoniek reageren met miRNAs35. Niettemin, onze strategie en protocol zijn betrouwbare methoden voor het ontcijferen van de cellulaire mechanismen van miRNAs. Daarnaast kan ons Protocol verder worden uitgebreid om de combinatie van miRNAs en andere anti-kankergeneesmiddelen te implementeren en te evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door het basisprogramma voor wetenschappelijk onderzoek via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2017R1D1A3B03035662); en Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6x DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8x Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1,000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5, (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19, (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215, (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403, (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217, (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35, (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15, (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18, (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27, (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18, (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46, (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26, (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9, (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9, (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5, (4), e10202 (2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29, (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37, (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277, (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2, (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120, (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4, (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6, (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27, (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46, (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38, (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70, (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45, (12), 7212-7225 (2017).
Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).More

Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter