종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜
Summary
이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3′ 번역되지 않은 영역(3′ UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs)는 암을 포함하여 몇몇 질병에 있는 수많은 세포내 신호 통로를 조절하기 위하여 인식되는 작은 규정하는 RNA입니다. 이 작은 조절 RNA는 주로 그들의 표적 메신저 RNA (mRNA)의 3′ 번역되지 않은 지구 (3′ UTR)와 궁극적으로 mRNA의 디코딩 프로세스의 억제 및 표적 mRNA 분해의 확대의 결과로 상호 작용합니다. 발현 수준 및 세포내 기능에 기초하여, miRNA는 종양발생 및 종양 억제 mRNA의 조절 인자로 작용할 수 있다. 수백 또는 수천 개의 계산 예측 표적 중에서 miRNA의 선의의 표적 유전자를 식별하는 것은 관심 있는 miRNA의 역할 및 기본 분자 메커니즘을 분별하는 중요한 단계이다. 다양한 miRNA 표적 예측 프로그램은 가능한 miRNA-mRNA 상호작용을 검색할 수 있다. 그러나, 가장 어려운 질문은 관심의 miRNA의 직접적인 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 이 프로토콜은 miRNA의 기능과 관련된 miRNA 표적을 식별하는 방법에 대한 주요 방법의 재현 가능한 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 miRNA 모방 형질감염에 따른 프로브 기반 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석사를 사용하여 miRNA 수준, 기능 및 관련 표적 mRNA를 밝히기 위한 단계별 절차에 대한 실용적인 가이드를 제시합니다. , 투여 량 -응답 곡선 생성, 및 루시 퍼래스 분석 유전자의 3’UTR의 복제와 함께, 이는 개별 miRNAs의 역할의 적절한 이해에 필요하다.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs)는 주로 선의의 표적 유전자에서 3’번역되지 않은 영역 (3′ UTR)에 반응하여 메신저 RNA (mRNAs)의 번역 및 분해 과정을조절하는 작은 조절 RNA이다 1. miRNAs의 발현은 전사 및 전사 후 메커니즘에 의해 조절될 수 있다. 이러한 규제 메커니즘의 불균형은 암을 포함한 수많은 질병에서 통제되지 않고독특한 miRNAs 발현 수준을 가져온다 2. 단일 miRNA는 다양한 mRNA와 다중 상호작용을 가질 수 있다. 그에 상응하여, 개별 mRNA는 다양한 miRNA에 의해 제어될 수 있다. 따라서 세포내 신호 네트워크는 생리적 장애 및 질병이 시작되고 악화될 수 있는 특유의 발현 된 miRNAs에 의해 복잡하게 영향을 받습니다2,3,4. 5개 , 6. miRNAs의 변경된 표현이 암의 각종 모형에서 관찰되었더라도, miRNAs와 함께 암세포의 매너를 조절하는 분자 기계장치는 아직도 크게 알려지지 않았습니다.
축적 된 증거는 miRNAs의 종양 억제 역할이 암의 유형에 달려 있음을 보여주고있다. 예를 들어, 지게차 상자 o3(FOXO3)를 표적화함으로써, miR-155는 대장암의 세포 증식, 전이 및 화학저항성을 촉진한다7,8. 대조적으로, 신경교종 세포 침입의 제한은 신경발생성 궤적 노치 호몰로그 단백질 2(NOTCH2) 발현9의 조절을 통해 miR-107에 의해 유도된다. miRNA 기능과 관련하여 miRNA 표적 상호 작용의 평가는 miRNAs가 건강하고 병들인 상태 둘 다에 있는 각종 생물학 프로세스를 통제하는 방법을 더 잘 이해하는 필수 불가결한 부분입니다10. 또한, miRNA의 선의의 표적(들)의 발견은 다양한 항암약물을 가진 miRNA 기반 치료에 대한 미세 조정 된 전략을 더욱 제공할 수 있다. 그러나 miRNA 분야의 주요 과제는 miRNA의 직접 표적을 식별하는 것입니다. 여기서, 상세한 방법은 miRNA 표적 유전자 측정을 위한 재현가능한 실험 접근법으로서 제시된다. miRNA 표적 식별을 위한 성공적인 실험 설계는다양한 단계 및 고려사항을 수반한다(도 1). 종양 세포 및 정상 세포에서 성숙한 miRNA 수준의 비교는 관심있는 miRNA를선택하는 일반적인 절차 중 하나일 수 있다(도 1A). 세포 증식에 대한 miRNA의 효과를 검출하기 위해 선택된 miRNA의 기능적 연구는 관심 있는 miRNA의가장 적합한 후보 표적의 목록을 좁히는 것이 중요하다(도 1B). miRNA의 실험적으로 검증된 기능에 기초하여, miRNA 표적 예측 프로그램과 함께 회사내 문헌 및 데이터베이스의 체계적인 검토가 유전자기능에 대한 가장 관련성이 있는 정보를 검색하는 데 요구된다(도 1C). 관심 있는 miRNA의 실제 표적 유전자의 식별은 유전자의 3′ UTR의 복제와 함께 루시퍼라아제 분석실험과 같은 실험을 구현함으로써 달성될 수있으며, 실시간 PCR 및 웨스턴 블로팅(도 1D). 현재 프로토콜의 목적은 miRNA 모방 형질감염, 투여량-반응 곡선 생성, 및 프로브 기반 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석법의 포괄적인 방법을 제공하는 것이다. 유전자의 3′ UTR의 복제와 함께 루시퍼라제 분석. 현재 프로토콜은 개별 miRNA의 기능 및 암 치료에서 miRNA의 의미를 더 잘 이해하는 데 유용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
관심있는 miRNA의 기능을 가진 선의의 miRNA 표적의 결정을 위한 전략은 miRNA의 다중 역할의 이해를 위해 필수적입니다. miRNA 표적 유전자의 식별은 세포에서 miRNAs에 의해 변조된 세포 신호 이벤트를 해석하기 위한 지침일 수 있다. miRNA의 기능적으로 중요한 표적 유전자의 공개는 암에 있는 miRNA 기지를 둔 치료를 개발하기 위하여 근본적인 지식을 제공할 수 있습니다.
마이크로어…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다(2017R1D1A3B03035662); 및 한림대학교 연구기금, 2017(HRF-201703-003)
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
