在这里,我们提出了一个协议,诱导严重的TBI与横向流体打击伤害(FPI)模型在成年,男性威斯塔大鼠。我们还演示了使用无线遥测系统来收集连续的视频-EEG记录,并监测与创伤后癫痫发作一致的癫痫体放电。
横向流体打击伤害(FPI)模型已经建立,并已用于研究TBI和创伤后癫痫(PTE)。然而,据报告,采用该模型的不同研究中使用的具体参数差异很大,因此难以在实验室之间协调和解释结果。例如,在颅骨切除术的大小和位置、Luer 锁轮毂相对于颅骨切除的放置方式、施加在 Dura 上的大气压力以及压力脉冲的持续时间等方面,都报告了可变性。每个参数都会影响损伤严重程度,这与 PTE 的发生率直接相关。这表现在广泛的死亡率,正确的反射时间和报告的惊厥发作的发生率。在这里,我们为用于帮助促进研究间协调的方法提供了详细的协议。我们将 FPI 与无线 EEG 遥测系统结合使用,以持续监控电图变化并检测癫痫发作活动。 FPI是通过在左半球、布雷格马和兰姆达之间和毗邻侧脊的左半球上建立5毫米颅切除术引起的。一个Luer锁轮毂被固定在颅骨切除术的头骨上。此集线器连接到 FPI 设备,通过扭锁连接器通过连接到集线器的压力管将 20 毫秒的压力脉冲直接传送到完整的 Dura。恢复后,对大鼠进行重新麻醉以移除集线器。五个 0.5 mm 的不锈钢 EEG 电极螺钉通过头骨与 Dura 接触,用作四个记录电极和一个参考电极。电极导线被收集到一个基座连接器中,用骨水泥固定到位。连续视频/EEG 录音在 TBI 后最多收集 4 周。
在2015年提交国会的一份报告中,疾病控制中心报告说,美国每年约有250万人遭受创伤性脑损伤(TBI)。据估计,TBI导致20%的症状性癫痫和5%的所有癫痫2,3,4。此外,约20%的TBI患者发展创伤后癫痫5。重要的是,由于TBI而发生的慢性、复发性发作通常具有药物耐药性,增加了疾病6的负担。导致创伤后癫痫(PTE)的确切机制仍不清楚。然而,一些关键的流行病学研究已经检查了发展创伤后癫痫(PTE)2、4、7、8、9的发生率和潜在风险,10,11.这些流行病学研究都加强了损伤严重程度与癫痫发生风险的相关性。
目前被广泛用于识别新型抗癫痫疗法的方法,在很大程度上依赖于使用化学抽搐或电点燃诱导癫痫的模型。鉴于TBI患者在这些模型中开发的药物耐药性发生率很高,我们假设TBI引起的癫痫发作可能与化疗性惊厥或点燃引起的癫痫发作不同,并且可能涉及不同的途径或过程。癫痫发生。因此,TBI模型可能更适合开发更有效的治疗,以防止创伤后癫痫发作。
TBI的流体打击伤害(FPI)模型已经使用了几十年,是研究TBI和PTE13、14、15、16、17的既定方法。18.然而,正如我们最近所检讨的,在实验室19、20中所报道的FPI方法有高度的变异性。实验室之间缺乏一致性,阻碍了临床前结果的可重复性,使结果的解释成为一项挑战。因此,对这类研究21、22、23、24的更大兴趣和努力进行了更大的协调。
为了进一步提高专注于研究创伤后癫痫发作的实验室之间的一致性和协调性,我们在此提供了我们的方法的详细方法。我们先前曾报告,在严重TBI20后六个星期内,抽搐发作的发生率为60%。现在,我们使用这种方法来监测开始受伤的大鼠,并持续跟踪它们,每天24小时长达4周。我们选择使用无线遥测系统,它具有多种优点。首先,老鼠能够自由移动他们的笼子,从而减少压力。第二,当老鼠充当地面时,信号噪声降低。此外,我们当前的系统采用加速度计,可检测所有三个平面(X、Y 和 Z)的快速运动,并有助于识别惊厥发作事件。最后,无线遥测系统允许更容易地管理大鼠,如补充盐水注射,称量和进行神经严重性评分,当大鼠被绑在系绳上时,这很复杂。但是,此方法也有几个限制。首先,一个同时记录多达8只大鼠的系统的初始成本可以在60,000美元左右。其次,电源受电池源的限制。这需要每天监控和更换电池。电池更换之间的所需时间可能受采样率的影响。但是,对于 1000 Hz 采样速率,电池通常每周更换一次。有限的电源还限制系统仅从四个 EEG 信号进行录制。最后,信号丢弃是有限的,但偶尔会发生。然而,这种方法提供了一个一致和可靠的方法来监测创伤后癫痫发作,并有助于确定新的治疗方法。
据报道,实验室之间在FPI TBI模型14、26、27、28的具体参数和方法方面差异很大。这些不一致的结果相互矛盾,使得实验室之间难以协调努力和结果。在这里,我们提出了一个详细的方法,描述了我们的方法,长期,连续记录视频/EEG,以监测创伤后癫痫形成活动。使用所述方法生成可重现结果需要执行许多步骤。
首先,鉴于创伤后癫痫的发生率与损伤严重程度相关,应用导致最严重TBI的条件。具体来说,使用5毫米颅切除术,以确保暴露足够大的杜拉面积。此外,将一个雌性Luer锁装置固定在颅骨表面,开口直接放在颅骨切除术上。这不同于其他实验室,它们使用了较小的颅骨切除术(3 mm)和/或将一个经过修改的针轮毂放在颅内切除,这有效地减小了开口尺寸。通过将 Luer 锁放在颅骨切除外,保持 5mm 开口。这些特定参数会影响应用于 dura 的整体力。施加在杜拉身上的大气压力对观察到的伤害严重程度也有重大影响。不幸的是,大气压力是高度可变的,并且似乎与设备相关。一些实验室已经报告应用了8-10毫秒的压力脉冲。相反,此处描述的方法会产生 20 ms 的压力脉冲。这与似乎产生更严重的伤害14,28的其他实验室一致。很显然,损伤诱导压力脉冲是一个参数,它显示了实验室之间的相当大的变异性,并且必须根据经验进行定义。然而,伤害的严重程度可以根据死亡率(40-50%),正确的反射时间(>30分钟)26的组合来确定。研究中只包括具有完整杜拉的动物,这一点也至关重要。此外,如果颅骨切除术被任何胶水或水泥遮挡,使颅内切除术下的杜拉部分没有暴露在流体压力脉冲的全部力下,那么动物就应该从研究中消除。 此外,Luer 锁下的多余胶水可以粘附在 Dura 上,并在成功受伤后用水泥盖将其取出。 最后,示波器曲线上压力脉冲曲线的平滑形状指示流体室中没有气泡,并指示柱塞在没有阻抗的情况下移动。
麻醉是另一个必须控制的关键因素。非二苯暴露应保持在尽可能低的水平,以保持麻醉的手术平面。暴露于较高浓度的异曲兰或持续时间长的老鼠更有可能出现神经原性肺水肿。头骨的制备是该方法的另一个关键方面。特别是,干燥头骨和去除任何骨尘有助于防止大鼠过早去除发射器。
螺钉的放置和 EEG 导线的连接显然对于生成一致可重现的录音至关重要。重要的是,螺丝不要放置得太深,以引起大脑的病变。从成年(12周大)雄性威斯塔大鼠的颅切除术中恢复的骨皮瓣一致厚2毫米。使用带 2.5 mm 轴的 EEG 电极螺钉。使用弯曲的蚊子止血钳的尖端作为垫片,以确保螺钉只延伸到骨骼底部,并且不突出到大脑,这很有帮助。
此处介绍的方法确实有一些限制。必须定期更换电池。电池更换频率取决于采样率。电池通常每周更换一次,采样速率为 1000 Hz。可以通过降低采样速率来延长此时间范围。该系统还仅限于从四个单极 EEG 电极进行录制。但是,这提供了每个半球的两个通道,可以区分焦点和广义事件,并区分前变化和后变化。尽管存在这些限制,这种方法提供了一个合理的方法来进行连续的视频/EEG监测和检测严重TBI后的癫痫形成的变化。
此处描述的方法在 TBI 后一个月内导致电图和抽搐发作。因此,这种方法提供了一个合理的时间框架,在这项研究中研究潜在的治疗方法,以防止严重的TBI后发生癫痫。这种方法还提供了一种研究与PTE相关的分子机制的方法,并可能导致潜在的生物标志物的识别,这些生物标志物可用于识别最有可能开发PTE的患者。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢保罗·德雷塞尔在图形设计和数字准备方面的宝贵支持。
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |