Qui presentiamo un protocollo per indurre grave TBI con il modello di lesione a percussione fluida laterale (FPI) in adulti, ratti Wistar maschi. Dimostriamo anche l’uso di un sistema di telemetria wireless per raccogliere registrazioni video-EEG continue e monitorare le scariche epilettifori coerenti con l’epileptogenesi post-traumatica.
Il modello di lesione a percussione fluida laterale (FPI) è ben consolidato ed è stato utilizzato per studiare la TBI e l’epilessia post-traumatica (PTE). Tuttavia, è stata segnalata una notevole variabilità per i parametri specifici utilizzati nei diversi studi che hanno utilizzato questo modello, rendendo difficile l’armonizzazione e l’interpretazione dei risultati tra i laboratori. Ad esempio, è stata segnalata la variabilità per quanto riguarda le dimensioni e la posizione della craniectomia, come il mozzo di blocco Luer è posizionato rispetto alla craniectomia, la pressione atmosferica applicata alla dura e la durata dell’impulso di pressione. Ognuno di questi parametri può influire sulla gravità delle lesioni, che è direttamente correlata all’incidenza della PTE. Questo si è manifestato come un’ampia gamma di tassi di mortalità, tempi di riflesso correttivi e incidenza di convulsioni convulsive segnalate. Qui forniamo un protocollo dettagliato per il metodo che abbiamo usato per facilitare l’armonizzazione tra gli studi. Abbiamo usato l’FPI in combinazione con un sistema di telemetria EEG wireless per monitorare continuamente le modifiche elettrografiche e rilevare l’attività delle crisi epilettiche. L’IPF viene indotta creando una craniectomia di 5 mm sull’emisfero sinistro, tra il Bregma e la Lambda e adiacente alla cresta laterale. Un mozzo di chiusura Luer è fissato sul cranio sopra la craniectomia. Questo hub è collegato al dispositivo FPI e un impulso di pressione di 20 millisecondi viene consegnato direttamente alla dura intatta attraverso tubi a pressione collegati all’hub tramite un connettore di blocco di torsione. Dopo il recupero, i ratti vengono nuovamente anestesizzati per rimuovere l’hub. Cinque viti elettrodo EEG in acciaio inossidabile da 0,5 mm sono poste a contatto con la dura attraverso il cranio e fungono da quattro elettrodi di registrazione e un elettrodo di riferimento. I fili dell’elettrodo vengono raccolti in un connettore a piedistallo che viene fissato in posizione con cemento osseo. Le registrazioni video/EEG continue vengono raccolte per un massimo di 4 settimane dopo il TBI.
In un rapporto del 2015 al Congresso, i Centers for Disease Control hanno riferito che circa 2,5 milioni di persone all’anno subiscono lesioni cerebrali traumatiche (TBI) negli Stati Uniti1. Si stima che la TBI provochi il 20% delle epilessie sintomatiche e il 5% di tutte le epilessie2,3,4. Inoltre, circa il 20% dei pazienti affetti da TBI sviluppa l’epilessia post-traumatica5. È importante sottolineare che le crisi epilettiche croniche e ricorrenti che si verificano a seguito della TBI sono spesso farmacoresistenti, aumentando il peso della malattia6. I meccanismi esatti che portano all’epilessia post-traumatica (PTE) rimangono poco chiari. Tuttavia, diversi studi epidemiologici chiave hanno esaminato l’incidenza e il rischio potenziale di sviluppare epilessia post-traumatica (PTE)2,4,7,8,9 ,10,11. Questi studi di epidemiologia hanno rafforzato la correlazione della gravità delle lesioni con il rischio di epileptogenesi.
Gli attuali metodi che sono stati ampiamente utilizzati per identificare nuove terapie anti-epilessia si sono affidati molto a modelli che utilizzano chemio-convulsio o acceleratura elettrica per indurre epilessia12. Data l’elevata incidenza di farmaci farmaco-resistenza ai farmaci sviluppati in questi modelli dai pazienti affetti da TBI, ipotizziamo che le crisi epilettiche indotte da TBI possano essere diverse dalle crisi chemioconvulsivi o indotte da accesi e possono comportare percorsi o processi diversi di epilettica. Pertanto, un modello TBI può essere più adatto per lo sviluppo di trattamenti che sono più efficaci per prevenire l’epileptogenesi post-traumatica.
Il modello di lesione a percussione fluida (FPI) di TBI è stato utilizzato per decenni ed è un metodo consolidato per indagare sia TBI che PTE13,14,15,16,17, 18.Tuttavia, come abbiamo recentemente esaminato, vi è un alto grado di variabilità nei metodi dell’IPF segnalati nei laboratori19,20. Questa mancanza di coerenza tra i laboratori impedisce la riproducibilità dei risultati preclinici e rende l’interpretazione dei risultati una sfida. Di conseguenza, sono stati applicati maggiori interessi e sforzi per stabilire una maggiore armonizzazione per questi tipi di studi21,22,23,24.
Nel tentativo di aumentare ulteriormente la consistenza e l’armonizzazione tra laboratori focalizzati sullo studio dell’epileptogenesi post-traumatica, forniamo qui una metodologia dettagliata del nostro approccio. Abbiamo già segnalato un 60% di incidenza di convulsioni convulsive entro sei settimane dopo grave TBI20. Ora usiamo questo approccio per monitorare i ratti che iniziano il giorno della lesione e li seguiamo continuamente 24 ore al giorno per un massimo di 4 settimane. Abbiamo scelto di utilizzare un sistema di telemetria wireless che offre diversi vantaggi. In primo luogo, i ratti sono in grado di muoversi liberamente sulla loro gabbia, e quindi riduce lo stress. In secondo luogo una riduzione del rumore del segnale come il ratto serve come il terreno. Inoltre, il nostro sistema attuale utilizza un accelerometro che rileva un rapido movimento in tutti e tre i piani (X, Y e z) e può essere utile per identificare eventi di convulsione convulsiva. Infine, il sistema di telemetria wireless consente una gestione più semplice dei ratti come iniezioni saline supplementari, pesatura e condurre punteggi di gravità neurologica, che è complicato quando i ratti sono attaccati a un tether. Tuttavia, questo approccio presenta anche diverse limitazioni. In primo luogo, il costo iniziale di un sistema per registrare da un massimo di otto ratti contemporaneamente può essere nell’intervallo di 60.000 dollari. In secondo luogo, l’alimentazione è limitata da una fonte di batteria. Ciò richiede il monitoraggio e la sostituzione giornaliera delle batterie. Il tempo necessario tra i cambi della batteria può essere influenzato dalla frequenza di campionamento. Tuttavia, per una frequenza di campionamento di 1000 Hz, le batterie vengono in genere modificate una volta alla settimana. L’alimentatore limitato limita inoltre il sistema alla registrazione di soli quattro segnali EEG. Infine, l’uscita del segnale è limitata, ma occasionalmente si verifica. Tuttavia, questo approccio fornisce un metodo coerente e affidabile per monitorare l’epileptogenesi post-traumatica e può aiutare nell’identificazione di nuovi trattamenti terapeutici.
Tra laboratori per quanto riguarda i parametri e i metodi specifici utilizzati per il modello FPI TBI 14,26,27,28 . Queste incoerenze hanno portato a risultati contrastanti e rendono difficile armonizzare gli sforzi e i risultati tra i laboratori. Qui, abbiamo presentato una metodologia dettagliata che descrive il nostro approccio alla registrazione continua a lungo termine di video /EEG per monitorare l’attività epileptiforme post-traumatica. Un certo numero di passaggi sono fondamentali per generare risultati riproducibili con il metodo descritto.
In primo luogo, dato che l’incidenza dell’epilessia post-traumatica è correlata alla gravità delle lesioni, applicare condizioni che si traducono nel TBI più grave. In particolare, utilizzare una craniectomia di 5 mm per garantire che venga esposta un’area di dura sufficientemente ampia. Inoltre, fissare un dispositivo di blocco Luer femmina-femmina sulla superficie del cranio, con l’apertura posta direttamente sopra la craniectomia. Questo differisce da altri laboratori che hanno utilizzato una craniectomia più piccola (3 mm) e/o posizionato un mozzo ago modificato all’interno della craniectomia, che riduce efficacemente la dimensione di apertura. Posizionando la serratura Luer all’esterno della craniectomia, viene mantenuta l’apertura di 5 mm. Questi parametri specifici influenzano la forza complessiva applicata alla dura. La pressione atmosferica applicata alla dura ha anche un impatto importante sulla gravità delle lesioni osservate. Sfortunatamente, la pressione atmosferica è molto variabile e sembra dipendere dal dispositivo. Alcuni laboratori hanno segnalato l’applicazione di un impulso di pressione di 8 – 10 ms18. Al contrario, il metodo qui descritto genera un impulso di pressione di 20 ms. Questo è coerente con altri laboratori che sembrano generare lesioni più gravi 14,28. È chiaro che l’impulso di pressione che induce lesioni è un parametro che mostra una notevole variabilità tra i laboratori e deve essere definito empiricamente. Tuttavia, la gravità delle lesioni può essere determinata sulla base di una combinazione di tassi di mortalità (40-50%), tempi di riflesso corretti (>30 min)26. È inoltre fondamentale che nello studio vengano inclusi solo gli animali con una dura intatta. Inoltre, se la craniectomia è occlusa da qualsiasi colla o cemento in modo tale che parte della dura sotto la cranictomia non sia esposta alla piena forza dell’impulso di pressione fluida, allora l’animale dovrebbe essere eliminato dallo studio. Inoltre, la colla in eccesso sotto la serratura Luer può aderire alla dura e rimuoverla con il tappo di cemento anche dopo un infortunio di successo. Infine, la forma liscia della curva di impulso di pressione sulla traccia oscilloscopio dà l’indicazione che non ci sono bolle d’aria nella camera fluida e indica che lo stantuffo si muove senza impedimento.
L’anestesia è un altro fattore critico che deve essere controllato. L’esposizione all’Isoflurane deve essere mantenuta ai livelli più bassi possibili per mantenere un piano chirurgico di anestesia. I ratti esposti a livelli più elevati di isoflurane o per lunghe durate hanno maggiori probabilità di sviluppare edema polmonare indotto da neurogenici. La preparazione del cranio rappresenta un altro aspetto critico del metodo. In particolare, asciugare il cranio e rimuovere qualsiasi polvere ossea aiuta a prevenire la rimozione prematura del trasmettitore da parte dei ratti.
Il posizionamento delle viti e il collegamento dei fili EEG sono ovviamente fondamentali per produrre registrazioni costantemente riproducibili. È importante che le viti non siano posizionate troppo profondamente da indurre una lesione sul cervello. Il lembo osseo recuperato dalla craniectomia dei ratti Wistar maschi adulti (12 settimane) è costantemente di 2 mm di spessore. Utilizzare viti elettrodo EEG con un albero di 2,5 mm. È utile utilizzare le punte di zanzara curva pinza emostatiche come distanziale per garantire che le viti si estendano solo alla base dell’osso e non sporchino nel cervello.
L’approccio qui presentato presenta alcune limitazioni. Le batterie devono essere cambiate regolarmente. La frequenza delle variazioni della batteria dipende dalla frequenza di campionamento. Le batterie vengono in genere modificate una volta alla settimana per una frequenza di campionamento di 1000 Hz. Questo intervallo di tempo può essere esteso riducendo la frequenza di campionamento. Il sistema è anche limitato alla registrazione di quattro elettrodi EEG monopolari. Tuttavia, questo fornisce due canali per emisfero e può distinguere tra eventi focali e generalizzati e può distinguere tra cambiamenti anteriori e posteriori. Nonostante queste limitazioni, questo approccio fornisce un metodo ragionevole per condurre il monitoraggio continuo video/EEG e il rilevamento delle modifiche epilettiche a seguito di gravi TBI.
Il metodo qui descritto si traduce in crisi elettrografiche e convulsive entro un mese dalla TBI. Pertanto, questo approccio fornisce un ragionevole lasso di tempo in cui studiare potenziali terapie per prevenire l’epileptogenesi a seguito di grave TBI. Questo approccio fornisce anche un metodo per studiare i meccanismi molecolari associati alla PTE e può portare all’identificazione di potenziali biomarcatori che possono essere utilizzati per identificare i pazienti che sono più a rischio di sviluppare la PTE.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Paul Dressel per il suo inestimabile supporto nella progettazione grafica e nella preparazione delle figure.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |