Her presenterer vi en protokoll for å indusere alvorlig TBI med lateral væske perkusjon skade (FPI) modell i voksen, mannlig Wistar rotter. Vi viser også bruken av et trådløst telemetri system for å samle kontinuerlige video-EEG innspillinger og skjerm for epileptiform utslipp i samsvar med post-traumatisk epileptogenesis.
Den laterale Fluid perkusjon skade (FPI) modellen er godt etablert og har blitt brukt til å studere TBI og post-traumatisk epilepsi (PTE). Det er imidlertid rapportert om betydelig variasjon for de spesifikke parametrene som brukes i ulike studier som har brukt denne modellen, noe som gjør det vanskelig å harmonisere og tolke resultatene mellom laboratorier. For eksempel er variasjon rapportert om størrelsen og plasseringen av craniectomy, hvordan luer lås navet plasseres i forhold til craniectomy, det atmosfæriske trykket som påføres Dura og varigheten av trykk pulsen. Hver av disse parametrene kan påvirke skade alvorlighetsgrad, som direkte samsvarer med forekomsten av PTE. Dette har blitt manifestert som et bredt spekter av dødelighet, rettende refleks ganger og forekomst av convulsive beslag rapportert. Her gir vi en detaljert protokoll for metoden vi har brukt for å bidra til å lette harmonisering mellom studiene. Vi brukte FPI i kombinasjon med et trådløst EEG telemetri system for kontinuerlig overvåking for electrographic endringer og oppdage beslag aktivitet. FPI er indusert ved å skape en 5 mm craniectomy over venstre halvkule, mellom Bregma og lambda og tilstøtende til lateral ryggen. En luer lås navet er sikret på skallen over craniectomy. Denne huben er koblet til FPI-enheten, og en trykk puls på 20 millisekunder leveres direkte til intakt Dura gjennom trykkslangen som er koblet til huben via en Twist Lock-kontakt. Etter gjenoppretting er rottene re-anesthetized for å fjerne huben. Fem 0,5 mm, rustfritt stål EEG elektrode skruer er plassert i kontakt med Dura gjennom skallen og tjene som fire opptaks elektroder og en referanse elektrode. Elektrode ledningene samles inn i en pidestall-kontakt som er festet på plass med beinsement. Kontinuerlige video/EEG-opptak samles i opptil 4 uker etter TBI.
I en 2015 rapport til Kongressen, Centers for sykdom Control rapportert at ca 2 500 000 personer per år lider traumatisk hjerneskade (TBI) i USA1. Det anslås at TBI forårsaker 20% av symptomatisk epilepsies og 5% av alle epilepsies2,3,4. I tillegg utvikler omtrent 20% av TBI-pasientene post traumatisk epilepsi5. Viktigere, kroniske, tilbakevendende beslag som oppstår som en konsekvens av TBI er ofte pharmacoresistant, øke byrden av sykdommen6. De nøyaktige mekanismene som fører til post traumatisk epilepsi (PTE) er fortsatt uklart. Imidlertid har flere viktige epidemiologi studier undersøkt forekomsten og potensiell risiko for å utvikle post traumatisk epilepsi (PTE)2,4,7,8,9 ,10,11. Disse epidemiologi studerer hver forsterket sammenhengen av skade alvorlighetsgrad med risiko for epileptogenesis.
Nåværende metoder som har blitt mye brukt til å identifisere romanen anti-epilepsi terapier har støttet seg tungt på modeller som bruker kjemoterapi-convulsants eller elektrisk veden å indusere epilepsi12. Gitt den høye forekomsten av farmako til legemidler utviklet i disse modellene av TBI pasienter, hypothesize vi at TBI-indusert beslag kan være forskjellig fra chemoconvulsant eller veden-indusert beslag og kan innebære ulike veier eller prosesser av epileptogenesis. Derfor kan en TBI-modell være bedre egnet for utvikling av behandlinger som er mer effektive for å forhindre post-traumatisk epileptogenesis.
Den flytende perkusjon skade (FPI) modell av TBI har blitt brukt i flere ti år og er en veletablert metode for å undersøke både TBI og Pte13,14,15,16,17, 18. men som vi nylig har gjennomgått, er det en høy grad av variasjon i FPI metodene rapportert på tvers av laboratorier19,20. Denne mangelen på konsistens mellom laboratorier forhindrer reproduserbarhet av prekliniske funn og gjør tolkningen av resultatene en utfordring. Som en konsekvens har økt interesse og innsats blitt anvendt mot å etablere en større harmonisering for disse typer studier21,22,23,24.
I et forsøk på å ytterligere øke konsistens og harmonisering mellom laboratorier fokusert på å studere post-traumatisk epileptogenesis, gir vi her en detaljert metodikk for vår tilnærming. Vi har tidligere rapportert en 60% forekomst av convulsive beslag innen seks uker etter alvorlig TBI20. Vi nå bruk denne adgang å dataskjerm rotter begynnelse dagen av skaden og kontinuerlig følge etter etter seg 24 timene om dagen for til 4 ukens. Vi har valgt å bruke et trådløst telemetri system som gir flere fordeler. For det første, rotter er kjøpedyktig fritt bevege om deres bur, og således reduserer trykk. Andre en reduksjon i signal støy som rotte fungerer som bakken. I tillegg bruker vårt nåværende system en akselerometer som oppdager rask bevegelse i alle tre flyene (X, Y og Z) og kan være nyttig å identifisere convulsive anfall hendelser. Til slutt gir det trådløse telemetri systemet for enklere styring av rotter som supplerende saltvann injeksjoner, veiing og gjennomføre nevrologiske alvorlighetsgrader, noe som er komplisert når rotter er festet til en snor. Denne tilnærmingen har imidlertid også flere begrensninger. For det første, det Initial bekostning av en system å fortegnelse fra til åtte rotter samtidig kan inne området av $60 000. For det andre er strøm begrenset av en batterikilde. Dette krever daglig overvåkning og utskifting av batterier. Tiden som kreves mellom batteri endringer kan påvirkes av samplingsfrekvensen. Men for en 1000 Hz samplingsfrekvens, skiftes vanligvis batteriene en gang i uken. Den begrensede strømforsyningen begrenser også systemet til opptak fra bare fire EEG signaler. Endelig, signal drop out er begrenset, men forekommer av og til. Imidlertid gir denne tilnærmingen en konsistent og pålitelig metode for å overvåke post-traumatisk epileptogenesis og kan hjelpe til med identifisering av romanen terapeutiske behandlinger.
Det er rapportert om betydelig variasjon mellom laboratorier for de spesifikke parametrene og metodene som brukes for FPI TBI Model 14,26,27,28. Disse inkonsekvenser har resultert i motstridende resultater og gjøre det vanskelig å harmonisere innsats og utfall mellom laboratorier. Her har vi presentert en detaljert metodikk som beskriver vår tilnærming til langsiktig, kontinuerlig innspilling av video/EEG å overvåke for post-traumatisk epileptiform aktivitet. En rekke trinn er avgjørende for å generere reproduserbar resultater med den beskrevne metoden.
For det første, gitt at forekomsten av post traumatisk epilepsi samsvarer med skade alvorlighetsgrad, gjelder forhold som resulterer i de mest alvorlige TBI. Nærmere bestemt, bruk en 5 mm craniectomy for å sikre at et tilstrekkelig stort område av Dura er eksponert. I tillegg sikre en kvinnelig-kvinnelig luer lås enhet på overflaten av skallen, med åpningen plassert rett over craniectomy. Dette er forskjellig fra andre laboratorier som har brukt en mindre craniectomy (3 mm) og/eller plassert en modifisert nål hub inne i craniectomy, som effektivt reduserer åpningen størrelse. Ved å plassere luer-låsen utenfor craniectomy, opprettholdes 5 mm åpningen. Disse spesifikke parametrene påvirker den samlede kraften som brukes på Dura. Den atmosfæriske trykket påføres Dura har også en stor innvirkning på alvorlighetsgraden av skaden observert. Dessverre er atmosfærisk trykk svært variabel og ser ut til å være enheten avhengig. Noen laboratorier har rapportert å bruke en trykk puls på 8-10 MS18. I kontrast, metoden beskrevet her resulterer i en 20 MS trykk puls. Dette er forenlig med andre laboratorier som ser ut til å generere mer alvorlig skade 14,28. Det er klart at skaden-inducing trykk puls er en parameter som viser betydelig variasjon mellom laboratorier og må være empirisk definert. Imidlertid kan skade alvorlighetsgrad fastsettes basert på en kombinasjon av dødelighet (40-50%), rettende refleks ganger (> 30 min)26. Det er også viktig at bare dyr med en intakt Dura bli inkludert i studien. I tillegg, hvis craniectomy er okkludert av noen lim eller sement slik at en del av Dura under craniectomy ikke utsettes for full kraft av væsken trykk puls, så dyret bør elimineres fra studien. Også overflødig lim under luer låsen kan følge Dura og fjerne den med sement cap selv etter en vellykket skade. Til slutt gir den glatte formen på trykk puls kurven på oscilloskop-sporet indikasjonen på at det ikke er noen luftbobler i væskekammeret og indikerer at stempelet beveger seg uten impedans.
Anestesi er en annen kritisk faktor som må kontrolleres. Isoflurane eksponering bør holdes på de laveste nivåene mulig å opprettholde et kirurgisk fly av anestesi. Rotter utsatt for høyere nivåer av isoflurane eller for lang varighet er mer sannsynlig å utvikle neurogenic-indusert lungeødem. Utarbeidelse av skallen representerer en annen kritisk aspekt av metoden. Spesielt, tørker skallen og fjerner alle Ben støv hjelper å forhindre rottene fra fjerner senderen for tidlig.
Plassering av skruer og tilkobling av EEG ledningene er åpenbart avgjørende for å produsere konsekvent reproduserbar innspillinger. Det er viktig at skruene ikke er plassert for dypt som å indusere en lesjon på hjernen. Benet klaff utvinnes fra craniectomy av voksne (12 uker gammel) mannlig Wistar rotter er gjennomgående 2 mm tykk. Bruk EEG elektrode skruer med en 2,5 mm aksel. Det er nyttig å bruke tipsene til buet mygg hemostatic tang som en spacer for å sikre at skruene bare strekker seg til bunnen av benet og ikke stikker inn i hjernen.
Tilnærmingen som presenteres her har noen begrensninger. Batterier må skiftes med jevne mellomrom. Hyppigheten av batteri endringer avhenger av samplingsfrekvensen. Batterier skiftes vanligvis en gang i uken for en samplingsfrekvens på 1000 Hz. Denne tidsrammen kan utvides ved å redusere samplingsfrekvensen. Systemet er også begrenset til opptak fra fire monopolar EEG-elektroder. Men dette gir to kanaler per halvkule og kan skille mellom fokal og generalisert hendelser og kan skille mellom fremre og bakre endringer. Til tross for disse begrensningene, gir denne tilnærmingen en rimelig metode for å gjennomføre kontinuerlig video/EEG overvåking og påvisning av epileptiform endringer etter alvorlig TBI.
Metoden som beskrives her, resulterer i både electrographic og convulsive anfall innen en måned etter TBI. Derfor gir denne tilnærmingen en rimelig tidsramme for å studere potensielle legemiddel selskap for å forebygge epileptogenesis etter alvorlig TBI. Denne tilnærmingen gir også en metode for å undersøke de molekylære mekanismene forbundet med PTE og kan føre til identifisering av potensielle biomarkører som kan brukes til å identifisere pasienter som er mest utsatt for å utvikle PTE.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Paul Dressel for hans uvurderlig støtte i grafisk design og utarbeidelse av tall.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |