Aqui nós apresentamos um protocolo para induzir o TBI severo com o modelo fluido lateral da lesão de percussão (FPI) em ratos adultos, machos de Wistar. Também demonstramos o uso de um sistema de telemetria sem fio para coletar gravações contínuas de vídeo-EEG e monitorar as descargas epileptiformes consistentes com a epileptogênese pós-traumática.
O modelo de lesão de percussão de fluido lateral (FPI) está bem estabelecido e tem sido utilizado para estudar TBI e epilepsia pós-traumática (tep). No entanto, tem sido relatada uma variabilidade considerável para os parâmetros específicos utilizados em diferentes estudos que empregam esse modelo, dificultando a harmonização e a interpretação dos resultados entre os laboratórios. Por exemplo, a variabilidade tem sido relatada quanto ao tamanho e localização da craniectomia, como o cubo de bloqueio de Luer é colocado em relação à craniectomia, a pressão atmosférica aplicada à dura e a duração do pulso de pressão. Cada um desses parâmetros pode impactar a severidade da lesão, que se correlaciona diretamente com a incidência de tep. Isso tem se manifestado como uma ampla gama de taxas de mortalidade, endireitando os tempos de reflexo e a incidência de convulsões convulsivas relatadas. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o método que temos usado para ajudar a facilitar a harmonização entre os estudos. Utilizamos o FPI em combinação com um sistema de telemetria EEG sem fio para monitorar continuamente as alterações eletrográficas e detectar a atividade convulsiva. FPI é induzido criando uma craniectomia de 5 milímetros sobre o hemisfério esquerdo, entre o Bregma e o lambda e adjacente ao cume lateral. Um cubo do fechamento de Luer é fixado no crânio sobre a craniectomia. Este Hub é conectado ao dispositivo FPI, e um pulso de pressão de 20 milissegundos é entregado diretamente à dura intacta através da tubulação da pressão conectada ao cubo através de um conector do fechamento da torção. Após a recuperação, os ratos são re-anestesiados para remover o cubo. Cinco 0,5 mm, aço inoxidável EEG eletrodo parafusos são colocados em contato com a dura através do crânio e servem como quatro eletrodos de gravação e um eletrodo de referência. Os fios do elétrodo são recolhidos em um conector do suporte que seja fixado no lugar com cimento de osso. Gravações contínuas de vídeo/EEG são coletadas por até 4 semanas após o TBI.
Em um relatório 2015 ao Congress, os centros para o controle de doença relataram que aproximadamente 2,5 milhões povos por o ano sofrem ferimento de cérebro traumático (TBI) nos E.U.1. Estima-se que a TBI cause 20% de Epilepsias sintomáticas e 5% de todas as Epilepsias2,3,4. Além disso, cerca de 20% dos pacientes com TCE desenvolvem epilepsia pós-traumática5. Importante, as apreensões crônicas, periódicas que ocorrem em conseqüência de TBI são frequentemente Pharmacoresistant, aumentando a carga da doença6. Os mecanismos exatos que conduzem à epilepsia borne-traumático (PTE) permanecem obscuros. Entretanto, vários estudos-chave de epidemiologia examinaram a incidência e o risco potencial de desenvolver epilepsia pós-traumática (tep) 2,4,7,8,9 ,10,11. Esses estudos epidemiológicos reforçaram a correlação da severidade da lesão com o risco de epileptogênese.
Métodos atuais que têm sido amplamente utilizados para identificar novas terapias antiepilépticas têm confiado fortemente em modelos que usam quimio-convulsivo ou acenar elétrico para induzir a epilepsia12. Dada a alta incidência de farmacoresistência a fármacos desenvolvidos nesses modelos por pacientes com TCE, podemos supor que as convulsões induzidas por TCE podem ser diferentes das crises de quimioconvulsão ou induzidas por Kindling e podem envolver diferentes vias ou processos de epileptogênese. Portanto, um modelo de TBI pode ser mais adequado para o desenvolvimento de tratamentos que são mais eficazes para prevenir a epileptogênese pós-traumática.
O modelo de lesão por percussão (FPI) de TBI tem sido utilizado há décadas e é um método bem estabelecido para investigar TBI e PTE13,14,15,16,17, 18. no entanto, como revisamos recentemente, há um alto grau de variabilidade nos métodos do FPI relatados nos laboratórios19,20. Essa falta de consistência entre os laboratórios previne a reprodutibilidade dos achados pré-clínicos e torna a interpretação dos resultados um desafio. Consequentemente, foram aplicados maiores juros e esforços no sentido de estabelecer uma maior harmonização para esses tipos de estudos21,22,23,24.
Em um esforço para aumentar ainda mais a consistência e a harmonização entre os laboratórios focados no estudo da epileptogênese pós-traumática, fornecemos aqui uma metodologia detalhada de nossa abordagem. Nós temos relatado previamente uma incidência de 60% de apreensões convulsivas dentro de seis semanas após TBI severo20. Nós usamos agora esta aproximação para monitorar ratos que começam o dia da lesão e os seguimos continuamente 24 horas um o dia por até 4 semanas. Nós escolhemos usar um sistema de telemetria sem fio que ofereça diversas vantagens. Primeiro, os ratos são capazes de mover-se livremente sobre sua gaiola, e assim reduz o stress. Segundo uma redução no ruído do sinal como o rato serve como o chão. Além disso, o nosso sistema atual emprega um acelerômetro que detecta o movimento rápido em todos os três aviões (X, Y e Z) e pode ser útil para identificar eventos convulsivos apreensão. Finalmente, o sistema de telemetria sem fio permite um manejo mais fácil de ratos, como injeções Salinas complementares, pesando e conduzindo escores de severidade neurológica, o que é complicado quando os ratos estão presos a uma corda. No entanto, essa abordagem também tem várias limitações. Primeiro, o custo inicial de um sistema para gravar de até oito ratos simultaneamente pode estar na faixa de $60000. Em segundo lugar, a energia é limitada por uma fonte de bateria. Isto exige a monitoração e a recolocação diárias das baterias. O tempo necessário entre as alterações da bateria pode ser influenciado pela taxa de amostragem. No entanto, para uma taxa de amostragem de 1000 Hz, as baterias são normalmente alteradas uma vez por semana. A fonte de alimentação limitada igualmente restringe o sistema à gravação de somente quatro sinais de EEG. Finalmente, o sinal de abandono é limitado, mas ocasionalmente ocorre. Entretanto, esta aproximação fornece um método consistente e de confiança para monitorar o epileptogênese borne-traumático e pode ajudar na identificação de tratamentos terapêuticos novos.
Foi relatada uma variabilidade considerável entre os laboratórios quanto aos parâmetros e métodos específicos utilizados para o modelo FPI TBI 14,26,27,28. Essas inconsistências resultaram em resultados conflitantes e dificultam a harmonização dos esforços e dos resultados entre os laboratórios. Aqui, apresentamos uma metodologia detalhada descrevendo nossa abordagem de gravação contínua e de longo prazo de vídeo/EEG para monitorar a atividade epileptiforme pós-traumática. Várias etapas são críticas para gerar resultados reprodutíveis com o método descrito.
Primeiro, uma vez que a incidência de epilepsia pós-traumática se correlaciona com a severidade da lesão, aplicam-se condições que resultam na TBI mais grave. Especificamente, use uma craniectomia de 5 mm para garantir que uma área suficientemente grande de dura seja exposta. Além, prenda um dispositivo fêmea-fêmea do fechamento de Luer na superfície do crânio, com a abertura coloc diretamente sobre o craniectomy. Isto difere de outros laboratórios que usaram uma craniectomia menor (3 milímetros) e/ou coloc um cubo modificado da agulha dentro do craniectomy, que reduz eficazmente o tamanho da abertura. Ao colocar o bloqueio Luer fora da craniectomia, a abertura de 5mm é mantida. Estes parâmetros específicos impactam a força total aplicada à dura-máter. A pressão atmosférica aplicada à dura-máter também tem um grande impacto na gravidade da lesão observada. Infelizmente, a pressão atmosférica é altamente variável e parece ser dependente do dispositivo. Alguns laboratórios relataram a aplicação de um pulso de pressão de 8-10 ms18. Em contraste, o método descrito aqui resulta em um pulso de pressão de 20 ms. Isso é consistente com outros laboratórios que parecem gerar lesões mais graves 14,28. É evidente que o pulso de pressão de indução de lesão é um parâmetro que mostra uma variabilidade considerável entre os laboratórios e deve ser definido empiricamente. No entanto, a severidade da lesão pode ser determinada com base em uma combinação de taxas de mortalidade (40-50%), tempos reflexos de endireitando (> 30 min)26. Também é fundamental que apenas os animais com dura-máter intacta sejam incluídos no estudo. Além disso, se a craniectomia é oclusada por qualquer cola ou cimento de tal forma que parte da dura abaixo da craniectomia não está exposta à força total do pulso de pressão do fluido, então o animal deve ser eliminado do estudo. Além disso, o excesso de cola o bloqueio Luer pode aderir à dura e removê-lo com a tampa de cimento, mesmo após uma lesão bem sucedida. Finalmente, a forma lisa da curva do pulso da pressão no traço do osciloscópio dá a indicação que não há nenhuma bolhas de ar na câmara fluida e indica que o atuador está movendo-se sem impedância.
A anestesia é outro fator crítico que deve ser controlado. A exposição ao isoflurano deve ser mantida nos níveis mais baixos possíveis para manter um plano cirúrgico de anestesia. Ratos expostos a níveis mais elevados de isoflurano ou para longas durações são mais propensos a desenvolver edema pulmonar induzido por neurogenia. A preparação do crânio representa outro aspecto crítico do método. Particularmente, secar o crânio e remover qualquer poeira óssea ajuda a evitar que os ratos removem o transmissor prematuramente.
A colocação dos parafusos e a conexão dos fios de EEG são obviamente críticas a produzir gravações consistentemente reprodutíveis. É importante que os parafusos não são colocados muito profundamente como para induzir uma lesão no cérebro. O retalho ósseo recuperado da craniectomia de ratos Wistar machos adultos (12 semanas de idade) é consistentemente 2 mm de espessura. Use os parafusos do elétrodo de EEG com um eixo de 2,5 milímetros. É útil usar as pontas do fórceps hemostático do mosquito curvado como um espaçador para assegurar-se de que os parafusos se estendam somente à base do osso e não se projetem no cérebro.
A abordagem aqui apresentada tem algumas limitações. As baterias devem ser alteradas regularmente. A frequência das alterações da bateria depende da taxa de amostragem. As baterias são normalmente alteradas uma vez por semana para uma taxa de amostragem de 1000 Hz. Este período de tempo pode ser estendido reduzindo a taxa de amostragem. O sistema é limitado igualmente à gravação de quatro elétrodos monopolar de EEG. No entanto, isso fornece dois canais por hemisfério e pode diferenciar entre eventos focais e generalizados e pode diferenciar entre as alterações anteriores e posteriores. Apesar destas limitações, esta aproximação fornece um método razoável para conduzir a monitoração contínua do vídeo/EEG e a deteção de mudanças epileptiformes que seguem TBI severo.
O método descrito aqui resulta em apreensões eletrográficas e convulsivas dentro de um mês depois de TBI. Conseqüentemente, esta aproximação fornece um frame de tempo razoável em que para estudar a terapêutica potencial para impedir o epileptogênese que segue o TBI severo. Essa abordagem também fornece um método para investigar os mecanismos moleculares associados à TEP e pode levar à identificação de potenciais biomarcadores que podem ser utilizados para identificar pacientes que estão mais em risco de desenvolver tep.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Paul Dressel pelo seu inestimável apoio em design gráfico e preparação de figuras.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |