Hier presenteren we een protocol om ernstige TBI te induceren met de laterale vloeistof percussie blessure (FPI) model bij volwassen, mannelijke Wistar ratten. We tonen ook het gebruik van een draadloze telemetrie systeem om continu video-EEG-opnames en monitor voor epileptiform lozingen in overeenstemming met post-traumatische epileptogenese te verzamelen.
De laterale vloeistof percussie blessure (FPI) model is goed ingeburgerd en is gebruikt om TBI en post-traumatische epilepsie (PTE) studie. Er is echter aanzienlijke variabiliteit gemeld voor de specifieke parameters die worden gebruikt in verschillende studies die dit model hebben toegepast, waardoor het moeilijk is om de resultaten tussen laboratoria te harmoniseren en te interpreteren. Bij voorbeeld, variabiliteit is gerapporteerd over de grootte en de locatie van de craniectomy, hoe de Luer Lock hub is geplaatst ten opzichte van de craniectomy, de atmosferische druk toegepast op de Dura en de duur van de druk puls. Elk van deze parameters kan impact letsel Ernst, die direct correleert met de incidentie van PTE. Dit is gemanifesteerd als een breed scala van sterftecijfers, het recht reflex tijden en incidentie van convulsieve epileptische aanvallen gemeld. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de methode die we hebben gebruikt om te helpen harmonisering tussen studies te vergemakkelijken. We gebruikten FPI in combinatie met een draadloze EEG telemetrie systeem om continu te controleren voor stroom veranderingen en detecteren inbeslagneming activiteit. FPI wordt geïnduceerd door het creëren van een 5 mm craniectomy over de linker halfrond, tussen de Bregma en Lambda en grenzend aan de laterale NOK. Een Luer Lock hub is beveiligd op de schedel over de craniectomy. Deze hub is aangesloten op de FPI apparaat, en een 20-milliseconde druk puls wordt rechtstreeks geleverd aan de intacte Dura door middel van druk slang aangesloten op de naaf via een twist lock connector. Na terugwinning, zijn de ratten re-verdoofd om de hub te verwijderen. Vijf 0,5 mm, roestvrijstaal EEG elektrode schroeven worden geplaatst in contact met de Dura door de schedel en dienen als vier opname-elektroden en een referentie-elektrode. De elektrodedraden worden verzameld in een voetstuk connector die is bevestigd op zijn plaats met bot cement. Continu video/EEG opnames worden verzameld voor maximaal 4 weken na TBI.
In een 2015 rapport aan Congres, meldden de centra voor de controle van de ziekte dat ongeveer 2.500.000 mensen per jaar traumatische hersenenverwonding (TBI) in de V.S.1lijden. Er wordt geschat dat TBI veroorzaakt 20% van de symptomatische epilepsie en 5% van alle epilepsie2,3,4. Daarnaast, ongeveer 20% van de TBI patiënten te ontwikkelen post-traumatische epilepsie5. Belangrijk, chronische, terugkerende aanvallen die optreden als gevolg van TBI zijn vaak pharmacoresistant, het verhogen van de last van de ziekte6. De precieze mechanismen die leiden tot post-traumatische epilepsie (PTE) blijven onduidelijk. Verscheidene belangrijke epidemiologische studies hebben echter de incidentie en het potentiële risico van het ontwikkelen van post-traumatische epilepsie (PTE)2,4,7,8,9 ,10,11. Deze epidemiologische studies elk versterkt de correlatie van de ernst van de schade met het risico van epileptogenese.
De huidige methoden die veelvuldig zijn gebruikt om nieuwe anti-epilepsie therapieën te identificeren hebben zich sterk gebaseerd op modellen die gebruik maken van chemo-convulsants of elektrische aanmaak om epilepsie te induceren12. Gezien de hoge incidentie van de apotheek-resistentie tegen drugs ontwikkeld in deze modellen door TBI patiënten, we veronderstellen dat TBI-geïnduceerde epileptische aanvallen kunnen afwijken van chemoconvulsant of aandoening-geïnduceerde epileptische aanvallen en kan betrekking hebben op verschillende trajecten of processen van epileptogenese. Daarom kan een TBI model beter geschikt zijn voor de ontwikkeling van behandelingen die effectiever zijn om post-traumatische epileptogenese te voorkomen.
De vloeistof percussie blessure (FPI) model van TBI is gebruikt voor decennia en is een gerenommeerde methode om zowel TBI en Pte13,14,15,16,17te onderzoeken, 18. echter, zoals we onlangs herzien, is er een hoge mate van variabiliteit in de FPI methoden gerapporteerd in laboratoria19,20. Dit gebrek aan consistentie tussen laboratoria voorkomt reproduceerbaarheid van preklinische bevindingen en maakt de interpretatie van de resultaten een uitdaging. Als gevolg daarvan zijn er meer belangstelling en inspanningen gedaan om een grotere harmonisatie te bewerkstelligen voor dit soort studies21,22,23en24.
In een poging om de samenhang en de harmonisatie tussen de laboratoria gericht op het bestuderen van posttraumatische epileptogenese verder te vergroten, bieden we hier een gedetailleerde methodologie van onze aanpak. We hebben eerder gemeld een 60% incidentie van convulsieve epileptische aanvallen binnen zes weken na ernstige TBI20. Wij gebruiken nu deze benadering om ratten te controleren die de dag van verwonding beginnen en hen onophoudelijk 24 uren per dag voor maximaal 4 weken volgen. We hebben ervoor gekozen om een draadloos telemetrie systeem te gebruiken dat verschillende voordelen biedt. Ten eerste, ratten zijn in staat om vrij te bewegen over hun kooi, en dus vermindert stress. Tweede een vermindering van het signaallawaai als de rat fungeert als de grond. Bovendien, ons huidige systeem maakt gebruik van een versnellingsmeter die snelle beweging detecteert in alle drie de vliegtuigen (X, Y en Z) en kan nuttig zijn om convulsieve inbeslagneming gebeurtenissen te identificeren. Ten slotte, het draadloze telemetrie systeem zorgt voor eenvoudiger beheer van ratten, zoals aanvullende zoute injecties, wegen en het uitvoeren van neurologische Ernst scores, die ingewikkeld is wanneer ratten zijn gehecht aan een Tether. Deze aanpak heeft echter ook een aantal beperkingen. Eerst, kunnen de aanvankelijke kosten van een systeem om van maximaal acht ratten gelijktijdig te registreren in de waaier van $60.000 zijn. Ten tweede, wordt de macht beperkt door een batterij bron. Dit vereist dagelijkse monitoring en vervanging van batterijen. De tijd die nodig is tussen de veranderingen van de batterij kan worden beïnvloed door de sampling rate. Echter, voor een 1000 Hz sampling rate, batterijen worden meestal een keer per week. De beperkte stroomvoorziening beperkt ook het systeem tot de opname van slechts vier EEG-signalen. Ten slotte, signaal drop-out is beperkt, maar doet af en toe optreden. Echter, deze aanpak biedt een consistente en betrouwbare methode om post-traumatische epileptogenese te controleren en kan helpen bij de identificatie van nieuwe therapeutische behandelingen.
Er is aanzienlijke variabiliteit gerapporteerd tussen laboratoria met betrekking tot de specifieke parameters en methoden die worden gebruikt voor de FPI TBI model 14,26,27,28. Deze inconsistenties hebben geresulteerd in tegenstrijdige resultaten en maken het moeilijk om de inspanningen en uitkomsten tussen de laboratoria te harmoniseren. Hier hebben we een gedetailleerde methodologie voor het beschrijven van onze aanpak van de lange termijn, continue opname van video/EEG te controleren voor post-traumatische epileptiform activiteit. Een aantal stappen zijn van cruciaal belang voor het genereren van reproduceerbare resultaten met de beschreven methode.
Ten eerste, aangezien de incidentie van post-traumatische epilepsie correleert met de ernst van de verwondingen, gelden de voorwaarden die resulteren in de meest ernstige TBI. Gebruik in het bijzonder een 5 mm craniectomy om ervoor te zorgen dat een voldoende groot gebied van Dura wordt blootgesteld. Bovendien, veilig een vrouwelijk-vrouwelijk Luer Lock apparaat op het oppervlak van de schedel, met de opening direct geplaatst op de craniectomy. Dit verschilt van andere laboratoria die gebruik hebben gemaakt van een kleinere craniectomy (3 mm) en/of geplaatst een gemodificeerde naald naaf in de craniectomy, die effectief vermindert de opening grootte. Door het Luer-slot buiten de craniectomy te plaatsen, wordt de 5mm opening gehandhaafd. Deze specifieke parameters beïnvloeden de totale kracht die op de Dura wordt toegepast. De atmosferische druk toegepast op de Dura heeft ook een grote invloed op de ernst van de waargenomen schade. Helaas, atmosferische druk is zeer variabel en lijkt afhankelijk van het apparaat. Sommige Labs hebben gemeld het toepassen van een druk puls van 8-10 MS18. In tegenstelling, de methode hier beschreven resulteert in een 20 MS druk puls. Dit is in overeenstemming met andere Labs die lijken te genereren meer ernstige schade 14,28. Het is duidelijk dat de verwonding-veroorzakende druk impuls een parameter is die aanzienlijke veranderlijkheid tussen laboratoria toont en moet empirisch worden bepaald. De ernst van de verwondingen kan echter worden bepaald op basis van een combinatie van sterftecijfers (40-50%), waarbij de reflex tijden (> 30 min)26worden gerecht. Het is ook van cruciaal belang dat alleen dieren met een intacte Dura worden opgenomen in de studie. Bovendien, als de craniectomy wordt afgesloten door een lijm of cement zodanig dat een deel van de Dura onder de craniectomy niet wordt blootgesteld aan de volle kracht van de vloeistof druk puls, dan is het dier moet worden geëlimineerd uit de studie. Ook, overtollige lijm onder de Luer Lock kan vasthouden aan de Dura en verwijder deze met de cement dop, zelfs na een succesvolle blessure. Ten slotte geeft de vloeiende vorm van de druk Pulse curve op de oscilloscoop Trace de indicatie dat er geen luchtbellen zijn in de vloeistof kamer en geeft aan dat de zuiger zonder impedantie beweegt.
Anesthesie is een andere kritieke factor die moet worden gecontroleerd. Isofluraan blootstelling moet worden gehouden tot de laagste niveaus mogelijk om een chirurgisch vlak van anesthesie te handhaven. Ratten blootgesteld aan hogere niveaus van Isofluraan of voor lange duur hebben meer kans op neurogene-geïnduceerde longoedeem te ontwikkelen. De voorbereiding van de schedel vertegenwoordigt een ander kritisch aspect van de methode. In het bijzonder, het drogen van de schedel en het verwijderen van een bot stof helpt om te voorkomen dat de ratten uit het verwijderen van de zender voortijdig.
De plaatsing van de schroeven en de aansluiting van de EEG draden zijn uiteraard van cruciaal belang voor het produceren van consequent reproduceerbare opnames. Het is belangrijk dat de schroeven niet te diep worden geplaatst om een laesie op de hersenen te induceren. De bone flap hersteld van de craniectomy van volwassen (12 weken oud) mannelijke Wistar ratten is consequent 2 mm dik. Gebruik EEG-elektrode schroeven met een 2,5 mm schacht. Het is nuttig om de uiteinden van gebogen mug hemostatische Tang te gebruiken als een spacer om ervoor te zorgen dat de schroeven alleen uit te breiden tot de basis van het bot en niet uitsteken in de hersenen.
De hier gepresenteerde aanpak heeft een aantal beperkingen. Batterijen moeten regelmatig worden gewijzigd. De frequentie van de batterij veranderingen is afhankelijk van de sampling rate. Batterijen worden meestal een keer per week veranderd voor een sampling rate van 1000 Hz. Dit tijdsbestek kan worden verlengd door de Samplingsnelheid te verlagen. Het systeem is ook beperkt tot de opname van vier monopolaire EEG-elektroden. Echter, dit biedt twee kanalen per halfrond en kan onderscheid maken tussen focal en algemene gebeurtenissen en kan differentiëren tussen anterior en posterior veranderingen. Ondanks deze beperkingen, deze aanpak biedt een redelijke methode voor het uitvoeren van continue video/EEG monitoring en detectie van epileptiform veranderingen na ernstige TBI.
De methode hier beschreven resulteert in zowel stroom en convulsieve epileptische aanvallen binnen een maand na TBI. Daarom, deze aanpak biedt een redelijke termijn waarin de studie potentiële therapeutische voor het voorkomen van epileptogenese na ernstige TBI. Deze aanpak biedt ook een methode om de moleculaire mechanismen geassocieerd met PTE te onderzoeken en kan leiden tot de identificatie van potentiële biomarkers die kunnen worden gebruikt om patiënten te identificeren die het meest risico op het ontwikkelen van PTE.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen Paul Dressel bedanken voor zijn onschatbare steun in het grafisch ontwerp en de voorbereiding van figuren.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |