Här presenterar vi ett protokoll för att inducera svår TBI med den laterala vätskan slagverk skada (FPI) modell i vuxen, manliga Wistar råttor. Vi visar också användningen av ett trådlöst telemetrisystem för att samla in kontinuerliga video-EEG inspelningar och övervaka för epileptiform utsläpp överensstämmer med posttraumatisk epileptogenesis.
Den laterala vätske slag verks skada (FPI) modellen är väl etablerad och har använts för att studera TBI och posttraumatisk epilepsi (PTE). Dock har betydande variationer rapporter ATS för de specifika parametrar som används i olika studier som har använt denna modell, vilket gör det svårt att harmonisera och tolka resultaten mellan laboratorier. Till exempel, variation har rapporter ATS om storleken och placeringen av kraniektomi, hur Luer lås navet placeras i förhållande till kraniektomi, atmosfärstryck appliceras på Dura och varaktigheten av tryck pulsen. Var och en av dessa parametrar kan påverka skadans allvarlighets grad, som direkt korrelerar med incidensen av PTE. Detta har manifesteras som ett brett spektrum av dödlighet, rätande reflex tider och förekomst av kramp anfall rapporterade. Här ger vi ett detaljerat protokoll för den metod vi har använt för att under lätta harmoniseringen mellan studierna. Vi använde FPI i kombination med ett trådlöst EEG telemetri system för att kontinuerligt övervaka för elektrografiska förändringar och upptäcka beslag aktivitet. FPI induceras genom att skapa en 5 mm craniectomy över den vänstra hjärn halvan, mellan Bregma och lambda och intill den laterala åsen. En Luer lås navet är säkrad på skallen över kraniektomi. Denna hubb är ansluten till FPI-enheten, och en 20-millisekunders tryck puls levereras direkt till den intakta Dura genom tryck slangen ansluten till hubben via en twist lock-kontakt. Efter återhämtning, råttor är re-anesthetized att ta bort navet. Fem 0,5 mm, rost fritt stål EEG-elektrod skruvar är placerade i kontakt med Dura genom skallen och fungera som fyra inspelnings elektroder och en referens elektrod. Elektrod kablarna samlas i en piedestal kontakt som säkras på plats med ben cement. Kontinuerlig video/EEG-inspelningar samlas upp i upp till 4 veckor efter TBI.
I en 2015 rapport till kongressen, Centers för sjukdoms kontroll rapporterade att cirka 2 500 000 personer per år lider traumatisk hjärn skada (TBI) i USA1. Det uppskattas att TBI orsakar 20% av symptomatiska Epilepsier och 5% av alla Epilepsier2,3,4. Dessutom utvecklar cirka 20% av TBI-patienterna posttraumatisk epilepsi5. Viktigt, kroniska, återkommande anfall som uppstår som en följd av TBI är ofta farmakoresistenta, vilket ökar bördan av sjukdomen6. De exakta mekanismerna som leder till posttraumatisk epilepsi (PTE) är fortfarande oklara. Flera viktiga epidemiologiska studier har dock undersökt incidensen och den potentiella risken för utveckling av posttraumatisk epilepsi (PTE)2,4,7,8,9 ,10,11. Dessa epidemiologiska studier varje förstärkt sambandet mellan skada allvarlighets grad med risk för epileptogenesis.
Nuvarande metoder som har använts i stor utsträckning för att identifiera nya anti-epilepsi terapier har förlitat sig på modeller som använder chemo-Convulsants eller elektrisk tändved att inducera epilepsi12. Med tanke på den höga förekomsten av farmako-resistens mot läkemedel som utvecklats i dessa modeller av TBI patienter, vi hypotes om att TBI-inducerad kramper kan skilja sig från kemokonvulsiva eller Kindling-inducerad kramper och kan innebära olika vägar eller processer av epileptogenes. Därför kan en TBI-modell vara bättre lämpad för utveckling av behandlingar som är mer effektiva för att förhindra posttraumatisk epileptogenes.
TBI: s modell för vätske slag verks skada (FPI) har använts i årtionden och är en väletablerad metod för att undersöka både TBI och Pte13,14,15,16,17, 18. som vi nyligen granskade finns det dock en hög grad av variation i de FPI-metoder som rapporter ATS mellan laboratorierna19,20. Denna brist på enhetlighet mellan laboratorier förhindrar reproducerbarhet av prekliniska fynd och gör tolkningen av resultaten till en utmaning. Som en följd av detta har ökat intresse och ansträngningar tillämpats för att skapa en större harmonisering för dessa typer av studier21,22,23,24.
I ett försök att ytterligare öka samstämmigheten och harmoniseringen mellan laboratorier som fokuserar på att studera posttraumatisk epileptogenes ger vi här en detaljerad metod för vår strategi. Vi har tidigare rapporterat en 60% incidens av kramp anfall inom sex veckor efter svår TBI20. Vi använder nu denna metod för att övervaka råttor börjar dagen för skadan och kontinuerligt följa dem 24 timmar om dygnet i upp till 4 veckor. Vi har valt att använda ett trådlöst telemetrisystem som ger flera fördelar. Först, råttor kan fritt röra sig om sin bur, och därmed minskar stressen. Andra en minskning av signal brus som råtta fungerar som marken. Dessutom använder vårt nuvarande system en accelerometer som detekterar snabb rörelse i alla tre plan (X, Y och Z) och kan vara till hjälp för att identifiera kramp anfall händelser. Slutligen, det trådlösa telemetrisystemet möjliggör enklare hantering av råttor såsom kompletterande saltlösning injektioner, vägning och genomföra neurologiska svårighets grad poäng, vilket är komplicerat när råttor är knutna till en tjuder. Men detta tillvägagångs sätt har också flera begränsningar. Första, den initial kostnad av en system till protokollföra från upp till åtta råtta samtidig kanna bli inne om spänna av $60 000. För det andra begränsas strömmen av en batteri källa. Detta kräver daglig övervakning och byte av batterier. Den tid som krävs mellan batteri byten kan påverkas av samplings frekvensen. Men för en samplings frekvens på 1000 Hz byts batterierna normalt en gång i veckan. Den begränsade strömförsörjningen begränsar också systemet till inspelning från endast fyra EEG-signaler. Slutligen är signal avhopp begränsad men förekommer ibland. Emellertid, detta tillvägagångs sätt ger en konsekvent och pålitlig metod för att övervaka posttraumatisk epileptogenes och kan stöd i identifieringen av nya terapeutiska behandlingar.
Betydande variationer har rapporter ATS mellan laboratorier avseende de specifika parametrar och metoder som används för FPI TBI modell 14,26,27,28. Dessa inkonsekvenser har resulterat i motstridiga resultat och gör det svårt att harmonisera insatserna och resultaten mellan labbarna. Här har vi presenterat en detaljerad metodik som beskriver vårt förhållnings sätt till långsiktig, kontinuerlig inspelning av video/EEG för att övervaka posttraumatisk epileptiform-aktivitet. Ett antal steg är avgörande för att generera reproducerbara resultat med den beskrivna metoden.
Först, med tanke på att incidensen av posttraumatisk epilepsi korrelerar med skada allvarlighets grad, tillämpa villkor som leder till den allvarligaste TBI. Specifikt, Använd en 5 mm craniektomi för att säkerställa att ett tillräckligt stort område av Dura exponeras. Dessutom, säkra en hona-hona Luer lås anordning på ytan av skallen, med öppningen placerad direkt över kraniektomi. Detta skiljer sig från andra laboratorier som har använt en mindre kraniectomy (3 mm) och/eller placerade en modifierad nål navet inuti kraniektomi, vilket effektivt minskar öppnings storleken. Genom att placera Luer lås utanför craniectomy, den 5mm öppningen bibehålls. Dessa specifika parametrar påverkar den totala kraften som appliceras på Dura. Atmosfärstryck som appliceras på Dura har också en stor inverkan på svårighets graden av den observerade skadan. Tyvärr, atmosfärstryck är mycket varierande och verkar vara enhets beroende. Vissa laboratorier har rapporterat att tillämpa en tryck puls på 8-10 MS18. Den metod som beskrivs här resulterar däremot i en 20 MS tryck puls. Detta är förenligt med andra laboratorier som verkar för att generera mer allvarliga skador 14,28. Det är tydligt att den skada-inducerande tryck pulsen är en parameter som visar betydande variationer mellan laboratorier och måste vara empiriskt definierade. Skadans svårighets grad kan dock bestämmas på grund val av en kombination av dödlighet (40-50%), rätande reflex tider (> 30 min)26. Det är också viktigt att endast djur med intakt Dura inkluderas i studien. Dessutom, om kraniektomi är ockluded av något lim eller cement så att en del av Dura under kraniektomi inte utsätts för den fulla kraften av vätske tryck puls, då djuret bör elimineras från studien. Dessutom kan överflödigt lim under Luer låset följa Dura och ta bort den med cement locket även efter en lyckad skada. Slutligen ger den släta formen av tryck puls kurvan på oscilloskopets spår en indikation på att det inte finns några luft bubblor i vätske kammaren och indikerar att kolven rör sig utan impedans.
Anestesi är en annan kritisk faktor som måste kontrol leras. Isofluran exponeringen bör hållas till lägsta möjliga nivå för att upprätthålla en kirurgisk plan anestesi. Råttor som utsätts för högre halter av isofluran eller under långa perioder är mer benägna att utveckla neurogent-inducerad lungödem. Beredning av skallen representerar en annan kritisk aspekt av metoden. Särskilt torkar skallen och ta bort något ben damm hjälper till att förhindra att råttor från att ta bort sändaren i förtid.
Placeringen av skruvar och anslutning av EEG-ledningar är uppenbarligen avgörande för att producera konsekvent reproducerbara inspelningar. Det är viktigt att skruvarna inte placeras för djupt för att framkalla en lesion på hjärnan. Benet luckan återvinnas från kraniektomi av vuxna (12 veckor gamla) manliga Wistar råttor är genomgående 2 mm tjock. Använd EEG-elektrod skruvar med en 2,5 mm skaft. Det är bra att använda tips av böjda mygga hemostatiska pincett som en spacer för att säkerställa att skruvarna bara sträcker sig till basen av benet och inte sticker ut i hjärnan.
Den strategi som presenteras här har vissa begränsningar. Batterierna måste bytas regelbundet. Hur ofta batteri byten varierar beror på samplings frekvensen. Batterierna byts vanligt vis en gång i veckan för en samplings frekvens på 1000 Hz. Denna tidsram kan för längas genom att minska samplings frekvensen. Systemet är också begränsat till inspelning från fyra monopolära EEG-elektroder. Emellertid, detta ger två kanaler per halvklotet och kan skilja mellan fokal och generaliserade händelser och kan skilja mellan främre och bakre förändringar. Trots dessa begränsningar, detta tillvägagångs sätt ger en rimlig metod för att genomföra kontinuerlig video/EEG övervakning och upptäckt av epileptiform förändringar efter svår TBI.
Den metod som beskrivs här resulterar i både elektrografiska och kramp anfall inom en månad efter TBI. Därför ger denna metod en rimlig tidsram för att studera potentiella terapeutiska för att förhindra epileptogenes efter svår TBI. Detta tillvägagångs sätt ger också en metod för att undersöka de molekyl ära mekanismerna i samband med PTE och kan leda till identifiering av potentiella bio markörer som kan användas för att identifiera patienter som är mest i risk zonen för att utveckla PTE.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Paul Dressel för hans ovärderliga stöd i grafisk design och förberedelse av figurer.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |