Summary
A administração crônica de isoproterenol através de uma bomba osmótica implantada tem sido amplamente utilizada para imitar a insuficiência cardíaca avançada em camundongos. Aqui, nós descrevemos métodos detalhados no implante cirúrgico da mini-bomba para a administração contínua do isoproterenol sobre 3 semanas, assim como, Avaliação ecocardiográfica para a criação bem sucedida do modelo.
Abstract
Isoproterenol (ISO), é um agonista beta-adrenérgico não seletivo, que é amplamente utilizado para induzir lesão cardíaca em camundongos. Quando o modelo agudo imita a cardiomiopatia stress-induzida, o modelo crônico, administrado através de uma bomba osmótica, imita a falha de coração avançada nos seres humanos. O objetivo do protocolo descrito é criar o modelo crônico de insuficiência cardíaca induzida por ISO em camundongos usando uma minibomba implantada. Este protocolo foi usado para induzir a insuficiência cardíaca em 100 + cepas de camundongos linhagens. Técnicas na implantação da bomba cirúrgica são descritas detalhadamente e podem ser relevantes para qualquer pessoa interessada em criar um modelo de insuficiência cardíaca em camundongos. Além disso, as mudanças semanais de remodelação cardíaca com base em parâmetros ecocardiográficos para cada cepa e tempo esperado para o desenvolvimento do modelo são apresentadas. Em resumo, o método é simples e reprodutível. O ISO contínuo administrado através da mini-bomba implantada sobre 3 a 4 semanas é suficiente para induzir o remodelamento cardíaco. Finalmente, o sucesso para a criação do modelo ISO pode ser avaliado in vivo por ecocardiografia serial demonstrando hipertrofia, dilatação ventricular e disfunção.
Introduction
A insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF) é acompanhada por uma resposta compensatória bem reconhecida do sistema nervoso simpático para manter a homeostase cardiovascular1. O estresse hemodinâmico e os efeitos deletérios no coração e na circulação foram observados com a ativação crônica. Estes tornaram-se a pedra angular da farmacoterapia contemporânea para a insuficiência cardíaca e são mecanismos importantes na progressão da insuficiência cardíaca e antagonismo terapêutico de sistemas Neurohormonais1.
Vários modelos de mouse estão disponíveis para investigações básicas de insuficiência cardíaca. Os modelos genéticos são atrativos para explorar terapias moleculares e investigar vias de sinalização. No entanto, esses modelos podem não ser relevantes para formas comuns de insuficiência cardíaca. Outros modelos comuns incluem a ligadura da artéria descendente anterior (Lad), a constrição transaórtica (TAC) e o isoproterenol (ISO), cada um visando uma etiologia patológica diferente2,3,4,5 ,6. A ligadura da artéria de LAD induz um infarction miocárdico da parede anterior que cria assim um modelo específico para a cardiomiopatia isquêmica. O TAC induz a sobrecarga de pressão aguda para criar um modelo hipertensivo de insuficiência cardíaca. Embora o gradiente de pressão possa ser medido, permitindo a estratificação da hipertrofia, o início agudo da hipertensão carece de relevância clínica direta4. Ambos os modelos LAD e TAC requerem um alto nível de perícia cirúrgica para executar. O modelo ISO agudo de insuficiência cardíaca imita cardiomiopatia induzida por estresse, também conhecida como doença de Takotsubo, que é caracterizada por um aumento acentuado nas catecolaminas e atividade no ventrículo esquerdo que imita o infarto agudo do miocárdio7, a 8. Em contrapartida, os modelos ISO crônicos de insuficiência cardíaca apresentam características de sintomas de insuficiência cardíaca avançada, com níveis cronicamente elevados de catecolaminas1. As vantagens do modelo crônico do ISO são que fornece a estimulação adrenérgicos crônica que imita a falha de coração avançada e que é relativamente fácil de criar. O investigador deve escolher um modelo que melhor recapitula sua patologia de interesse.
O objetivo geral deste método é induzir a insuficiência cardíaca em camundongos usando uma mini bomba implantada que libera a ISO continuamente para imitar a ativação simpática crônica encontrada em pacientes com insuficiência cardíaca1. O método é simples e reprodutível. Embora haja uma variação clara entre as cepas de camundongo, a ISO administrada durante 3 a 4 semanas a 30 mg/kg/dia é suficiente para induzir o remodelamento cardíaco na maioria dos camundongos. Especificamente, a ISO leva a uma fase compensatória pró-hipertrófica durante a semana 1 seguida de desbaste da parede, dilatação ventricular e diminuição da função sistólica nas semanas 2 e 32. O sucesso para a criação do modelo ISO pode ser avaliado in vivo por ecocardiografia serial demonstrando hipertrofia, dilatação e disfunção ventricular, bem como ex vivo via avaliação histológica e molecular do tecido cardíaco colhido para acúmulo lipídico, fibrose, estresse er, apoptose e expressão gênica9,10,11,12.
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Protocol
Este protocolo adere às directrizes do cuidado animal da Universidade de Califórnia, Los Angeles (protocolo ARC #2010-075). Os leitores são aconselhados a aderir ao seu próprio protocolo IACUC-aprovado, como o cuidado do rato peri-procedimento e gestão de analgesia pode ser específico da instituição.
1. preparação da bomba osmótica isoproterenol
Nota: este procedimento foi aplicado com sucesso em ratos fêmeas 9 + week-old que pesam 18 + g de sobre 100 estirpes do rato linhagens, assim como, nos ratos masculinos em um subconjunto das tensões. Não há limite máximo de peso corporal para este procedimento. Inclua sempre controles pareados por idade, pois é desconhecido se a idade do tratamento afeta a suscetibilidade induzida por isoproterenol ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca.
- Pesar e gravar o peso corporal para cada rato.
- Calcule a quantidade e a concentração apropriadas de isoproterenol para cada rato (ver tabela 1 ; Arquivo suplementar).
Nota: as bombas osmóticas utilizadas neste experimento (tabela de materiais) têm um volume de reservatório de 100 μl e são projetadas para entregar drogas em caudais contínuos por até 28 dias. Prepare um extra de 20 μL de solução de isoproterenol por bomba para dar conta da perda de volume no tubo de enchimento durante o carregamento da bomba. - Pesar a quantidade apropriada de isoproterenol (tabela 1) usando um equilíbrio analítico e dissolvê-lo em 120 μL de solução estéril de nacl 0,9%. Pipetar vigorosamente ou Vortex por 1 min para solubilizar completamente isoproterenol.
Nota: Prepare as bombas osmóticas num gabinete de biossegurança laboratorial. As bombas devem ser tratadas com luvas cirúrgicas. A técnica estéril é recomendada durante todo a preparação das bombas osmóticas e durante o procedimento cirúrgico da implantação. - Pesar e gravar a bomba osmótica vazia juntamente com seu moderador de fluxo e, em seguida, remover o moderador do fluxo.
- Aspirar 120 μL de solução de isoproterenol para uma seringa de 1,0 mL e anexar o tubo de enchimento de ponta sem corte de 27 Gauge fornecido com as bombas osmóticas.
Nota: Certifique-se de que a seringa e o tubo de enchimento estão livres de bolhas de ar. - Enquanto segura a bomba na posição vertical, insira o tubo de enchimento através da abertura da bomba na parte superior até que a ponta do tubo de enchimento fica perto da parte inferior do reservatório da bomba.
- Carregue a bomba osmótica empurrando o êmbolo da seringa lentamente até que a solução de isoproterenol se encha até à abertura da bomba.
- Retire cuidadosamente o tubo de enchimento e limpe a solução em excesso.
- Insira de volta o moderador do fluxo para fechar a bomba e limpe qualquer solução em excesso.
- Confirme que mais de 90% do volume do reservatório foi preenchido repesando a bomba osmótica.
Nota: as bombas de controle são preparadas da mesma maneira preenchendo o reservatório da bomba com solução estéril de NaCl de 0,9%.
2. preparação de instrumentos cirúrgicos
- Limpe todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo O iluminador do microscópio da luz do O-anel da fibra óptica, 2 fórceps, suporte da agulha, Sterilizers quentes do grânulo, grânulos de vidro, e tesouras (tabela dos materiais).
- Autoclave instrumentos cirúrgicos em 121 ° C por 30 min para esterilizar instrumentos antes da cirurgia.
3. implante cirúrgico da bomba osmótica de isoproterenol
- Induzir a anestesia colocando o mouse em uma câmara de indução com isoflurano a 3% em 95% de O2 e 5% de CO2. Manter a anestesia com isoflurano 2% através de uma nosecona.
- Administrar 5 mg/kg de carprofeno s.c. ao Scruff do pescoço entre as omoplatas para analgesia.
- Coloc a pomada oftálmica nos olhos para impedir a desidratação córnea.
- Verifique a profundidade da anestesia, monitorando a taxa de respiração, reflexo de pinça do dedo do pé e cor da membrana mucosa.
- Coloque o mouse em uma posição supina em uma almofada aquecida. Retire o cabelo do abdômen inferior e desinfete a pele com Betadine ou clorexidina.
Nota: para minimizar a infecção pós-operatória, assegure-se de que o campo cirúrgico esteja livre de pêlos incidentes. - Use um par de tesouras cirúrgicas para cortar uma incisão de 1 cm-Long da pele do midline. Use um par de tesouras Blunt-ended para dissecar com cuidado a pele das paredes peritoneais subjacentes.
Nota: uma entrega intraperitoneal é preferível para acomodar o tamanho da bomba. - Puxe as paredes peritoneais para longe do intestino subjacente com fórceps e corte um furo de 0,8 cm nas paredes peritoneais usando tesouras cirúrgicas finas.
- Insira a bomba osmótica na cavidade peritoneal com a extremidade do fluxo moderador primeiro.
- Feche a preensão nas paredes peritoneais usando 5,0 Suturas absorvíveis em uma forma interrompida. Use 6,0 suturas não absorvíveis para fechar a incisão cutânea de forma interrompida.
- Coloque o mouse em uma incubadora dedicada para mantê-lo quente e seco durante a recuperação. Avalie a recuperação da anestesia monitorando o rato cada 30 minutos nas primeiras duas horas para o retorno da respiração e do movimento normais.
- Uma vez que o rato se recuperou completamente da anestesia, retorne-o à carcaça rotineira. Continuar a monitorizar o animal para complicações diárias até 3 dias e, em seguida, a cada 2 a 3 dias depois, até o final do experimento.
Observação: os animais devem ser monitorados quanto à evidência de dor ou infecção pós-operatória, sinais de perda de peso, falta de mobilidade, postura anormal, falha no noivo e excesso de lamber ou morder a área da incisão. - Administrar carprofeno 5mg/kg s.c. a cada 24 h para até 48 h e depois, conforme necessário.
- Administrar 0,25 mg/mL de amoxicilina em água potável durante 5 dias para prevenir infecções no local cirúrgico.
- Retire as suturas não absorvíveis após 7 a 10 dias.
4. Avaliação ecocardiográfica anestesia
Nota: a Avaliação ecocardiográfica pode ser realizada repetidamente para monitorar o remodelamento cardíaco de série durante várias semanas. Realizamos medições ecocardiográficas em intervalos semanais ao longo de 3 semanas.
- Induzir anestesia em câmara de indução em 1,25% a 1,5% de isoflurano. Uma vez devidamente sedado, prenda o mouse sobre a plataforma de ecocardiografia com fita permitindo que o mouse continue recebendo anestesia através de um cone de nariz.
- Diminua o isoflurano para uma dosagem de manutenção de 1% para minimizar os efeitos cronotrópicos e inotrópicos negativos da sedação excessiva. Tome nota das taxas respiratórias e cardíacas durante todo o estudo e ajuste a dosagem de isoflurano conforme necessário.
- Retire o cabelo do peito com uma loção depilatória e limpe o peito livre de pêlos.
- Coloque o gel de ultra-som no peito e posicione a sonda de ultra-som para a imagem do coração.
- No modo B, a imagem do ventrículo esquerdo (LV) na visão de eixo longo do paraesternal. Ajuste a plataforma de ecocardiografia para alinhar a valva aórtica e o ápice do ve no plano do feixe de ultra-som.
- Incline a plataforma da ecocardiografia para colocar o eixo longo do LV em 90 graus ao feixe do ultra-som e ao diâmetro máximo do LV no centro da imagem.
- Imagem do eixo curto LV girando a sonda de ultra-som 90 graus.
- Em M-modo medida LV espessura da parede e dimensões internas.
- Coloque o mouse de volta na gaiola. Monitor para o retorno da respiração normal e movimentos espontâneos do corpo.
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Representative Results
Em nosso estudo publicado previamente, nós administramos uma dosagem do ISO de 30 mg/kg/d sobre 21 dias através da bomba osmótica através das tensões híbridas do painel da diversidade do rato 105 (hmdp)2,13. Foram avaliados os desfechos por meio do ecocardiograma realizado na linha de base, semana 1, 2 e 3 do tratamento ISO (Figura 1). Semelhante a um estudo prévio em que os autores estudaram o impacto do isoproterenol entre 23 cepas de camundongo14, observamos variação entre as tensões entre os parâmetros ecocardiográficos. O resumo das alterações semanais com base nos parâmetros ecocardiográficos e no tempo esperado para odesenvolvimento do modelo é apresentado (Figura 2 e Figura 3)2,15. Embora as variações tenham sido observadas entre as cepas de camundongo, em média, a espessura da parede septal interventricular na diástole final (IVSd) e o encurtamento fracionário (FS) aumentam na primeira semana, mas diminuem em pontos temporais posteriores; diâmetro interno do ventrículo esquerdo na diástole final (LVIDd) e aumento da massa ventricular esquerda (LVM) ao longo de um período de 3 semanas (Figura 3). Esses achados são consistentes com uma fase compensatória pró-hipertrófica durante a semana 1 de isoproterenol seguida de desbaste da parede, dilatação ventricular e diminuição da função sistólica. Nosso estudo previamente publicado igualmente demonstrou o upregulation de diversos subconjuntos do gene associados com a hipertrofia ventricular esquerda, incluindo o marcador fibrótica Lgals3 e o marcador nppb da falha de coração por semana 32. Outros genes diferencialmente regulamentados incluem aqueles envolvidos na angiogênese, glicoproteína de sinal secretado, ligação polissacárida, citoesqueleto de actina, via de sinalização de quimiocina, matriz extracelular proteinácea e colágeno2. Esses resultados são corroborados por Achados ecocardiográficos e histológicos: os corações do camundongo demonstraram dimensões visivelmente maiores da câmara ventricular esquerda ISO e maiores quantidades de fibrose tratamento ISO em relação ao controle salino (Figura 4).
Figura 1: modelo crônico de insuficiência cardíaca induzida por isoproterenol (ISO) via Minibomba.
Este número foi adaptado com a permissão de Wang et al.2 e Chang et al.15por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: variação nas medidas ecocardiográficas de estrutura e função cardíaca entre as cepas de mouse do painel de diversidade de mouse híbrido (HMDP).
As barras pretas representam medidas a condição de linha de base na ordem classificada. As barras brancas representam medições após 3 semanas de infusão contínua de ISO. IVSd = espessura da parede septal interventricular; LVIDd = diâmetro interno do ventrículo esquerdo na diástole final; LVM = massa ventricular esquerda; FS = encurtamento fracionário. As barras de erro representam os erros padrão dos meios (SEM). Este número foi adaptado com permissão de Wang et al.2 e Chang et al.15.
Figura 3: as alterações médias nas medidas ecocardiográficas comparadas à linha de base em cada ponto de tempo de ISO para cada estirpe clássica do linhagens.
Este número foi adaptado com permissão de Wang et al.2 e Chang et al.15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: alterações ecocardiográficas e histológicas após infusão crônica de isoproterenol.
A) são mostradas imagens de ecocardiograma M-mode representativas de 2 ratos no início do estudo e na semana 3 do isoproterenol. Observe o alargamento das dimensões internas do ventrículo esquerdo em ambos os camundongos, bem como o desenvolvimento de fibrose endocárdica (seta vermelha) em #2 do mouse. (B) a mancha Tricrômico de Masson do ventrículo esquerdo no eixo curto demonstra fibrose extensa com tratamento com isoproterenol (barra de escala: 2 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Peso corporal (g) | Dosagem diária (μg/dia) | Vazão (μL/dia) | Concentração (μL/dia) | Isoproterenol (mg/120 μL) |
| 20 | 600 | 2,64 | 227 | 27,3 |
| 21 | 630 | 2,64 | 239 | 28,6 |
| 22 | 660 | 2,64 | 250 | 30 |
| 23 | 690 | 2,64 | 261 | 31,4 |
| 24 | 720 | 2,64 | 273 | 32,7 |
| 25 | 750 | 2,64 | 284 | 34,1 |
| 26 | 780 | 2,64 | 295 | 35,4 |
| 27 | 810 | 2,64 | 307 | 36,8 |
| 28 | 840 | 2,64 | 318 | 38,2 |
| 29 | 870 | 2,64 | 330 | 39,5 |
| 30 | 900 | 2,64 | 341 | 40,9 |
Tabela 1: concentração de isoproterenol e preparação para pesos corporais representativos na taxa de bomba osmótica de 30 mg/kg/d. Esta tabela foi adaptada com permissão de Wang et al.2 e Chang et al.15.
Arquivo suplementar. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aplicou-se este método a mais de 100 estirpes de camundongos incriados para avaliar os desfechos cardíacos devido à estimulação beta-adrenérgica crônica2,13. As diferenças significativas na susceptibilidade ao isoproterenol são sabidas para existir entre tensões do rato e podem ser personalizadas à tensão de interesse como necessário16. Isso pode ser devido à variação na função do receptor beta-adrenérgico entre as cepas de mouse17, diferenças dependentes de deformação na atividade do sistema nervoso autônomo16, a densidade do receptor beta-ADRENÉRGICO (beta-ar) e/ou acoplamento17 e outras diferenças genéticas entre as cepas. Com base na ecocardiografia serial in vivo, bem como na histologia do tecido cardíaco ex vivo e na expressão gênica com e sem ISO, o tratamento crônico com isoproterenol induziu diferenças marcantes que abrangem de processos celulares, matriz extracelular a inflamatória respostas2,13. As seguintes considerações podem ser relevantes para a aplicação deste modelo de insuficiência cardíaca.
Quase 30% dos camundongos implantados com bomba osmótica isoproterenol morreram antes do término do protocolo experimental2,13. Destes, mais de 90% morreram dentro das primeiras 48 horas após a implantação da bomba. As mortes apareceram estirpes específicas, com BXA-12/PgnJ, BXD-34/TyJ, BTBRT < + > TF/J, NZW/LacJ, BXD40/TyJ, e BALB/cJ sendo as cepas mais suscetíveis. Além disso, observou-se que os camundongos pesando < 20 g apresentaram maior mortalidade pós-operatória precoce (óbito dentro de 48 h). Permitir que os camundongos amadureça em pelo menos 9 a 10 semanas de idade ou > 20 g podem minimizar a mortalidade pós-operatória precoce. Portanto, pode ser importante dar conta de diferenças específicas de deformação e mortalidade pós-operatória precoce ao planejar um experimento. Não realizamos uma autópsia para determinar a causa da morte. Portanto, não somos capazes de determinar a taxa de falha das bombas osmóticas. Dos camundongos que foram sacrificados não detectamos defeitos visuais.
Isoflurano é conhecido por ser negativamente cronotrópico e inotrópico. Deve-se tomar cuidado para minimizar a sedação e o impacto do isoflurano nas medições ecocardiográficas. Se o esterno lança uma sombra óssea e degrada qualidades de imagem, reposicione o mouse para a imagem do coração através de um espaço intercostal diferente. Se a medida da espessura da parede interventricular for complicada pela presença da parede ventricular direita, Reimage através de um espaço intercostal diferente para minimizar bordas mal delineadas. Medições exatas são críticas para análises comparativas a jusante.
Existe literatura documentando o uso de minipumps osmóticos em ratos18,19. Os leitores devem anotar que este protocolo estêve usado somente com ratos e que a outra literatura deve ser referenciada para a experimentação com outras espécies.
A literatura passada sugere que as injeções diárias do isoproterenol e da administração contínua através das bombas osmótica causam o peso ventricular similar relativo ao peso corporal20. No entanto, existem diferenças na hemodinâmica. As injeções diárias causam hipotensão imediata e taquicardia seguidas de hipertensão rebote em poucas horas. A administração contínua provoca hipotensão imediata no dia da implantação da bomba seguida da normalização da pressão arterial à hipertensão leve no dia 220. As tendências hemodinâmicas globais imitam mais de perto os hormônios simpáticos cronicamente ativados em pacientes com insuficiência cardíaca.
Na semana 1 de isoproterenol, a contratilidade foi aumentada ou supernormal. Na semana 2 e 3, a contratilidade estava de volta ao normal para a maioria das cepas e diminuiu para algumas cepas. No contexto do isoproterenol em curso, a contratilidade normal medida pelo encurtamento fracionário (FS) e pela fração de ejeção (EF) pode, de fato, representar a reserva contrátil prejudicada. Se o investigador deseja induzir um grau mais profundo de comprometimento cardíaco, pode-se aumentar a dosagem de ISO ou prolongar o período de tratamento ISO para 4 semanas, enquanto pesando o risco de aumento da mortalidade pós-operatória. Finalmente, os dados que apresentamos foram baseados apenas em camundongos femininos. Camundongos fêmeas demonstraram maior função contrátil pós-isquêmica e menor depleção de ATP em um modelo de lesão de reperfusão de isquemia em comparação aos camundongos machos21. Além disso, em um modelo crônico do ISO, os ratos masculinos demonstraram um coração elevado à relação de peso de corpo e reduziram níveis totais do norepinefrina em glândulas do parotid e submaxillary em comparação ao fêmeas22. O usuário pode precisar considerar as diferenças de gênero nos desfechos observados ao aplicar essa abordagem a fêmeas e machos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem a NIH K08 HL133491 para apoio ao financiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place | Alzet | Model 1004 | Includes filling tube, flow moderator and pump body |
| (-)-Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 16504-1G | (-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C. |
| 1 ml sterile syringe | VWR | BD309602 | |
| 30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator | AmScope | SKU: LED-30WR | |
| 5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture | Ethicon | J303H | 5-0, absorbable |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Glass beads | FST | 18000-46 | |
| Hot bead sterilizers | FST | 18000-50 | |
| Iris forceps | WPI | 15915 | |
| Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture | LOOK | AA-2176 | 6-0, non-absorbable |
| Needle holder | WPI | 15926 | |
| Normal Saline, 0.9% NaCl | Fisher | 89167-772 |
References
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