Summary
La administración crónica de isoproterenol a través de una bomba osmótica implantada se ha utilizado ampliamente para imitar la insuficiencia cardíaca avanzada en ratones. Aquí, describimos métodos detallados en la implantación quirúrgica de minibombas para la administración continua de isoproterenol durante 3 semanas, así como, evaluación ecocardiográfica para la creación exitosa del modelo.
Abstract
El isoproterenol (ISO), es un agonista beta-adrenérgico no selectivo, que se utiliza ampliamente para inducir lesiones cardíacas en ratones. Mientras que el modelo agudo imita la cardiomiopatía inducida por el estrés, el modelo crónico, administrado a través de una bomba osmótica, imita la insuficiencia cardíaca avanzada en los seres humanos. El propósito del protocolo descrito es crear el modelo de insuficiencia cardíaca crónica inducida por ISO en ratones utilizando una minibomba implantada. Este protocolo se ha utilizado para inducir insuficiencia cardíaca en más de 100 cepas de ratones endogámicos. Las técnicas sobre la implantación de bombas quirúrgicas se describen en detalle y pueden ser relevantes para cualquier persona interesada en crear un modelo de insuficiencia cardíaca en ratones. Además, se presentan los cambios semanales de remodelación cardíaca basados en parámetros ecocardiográficos para cada cepa y el tiempo esperado para el desarrollo del modelo. En resumen, el método es simple y reproducible. La ISO continua administrada a través de la minibomba implantada durante 3 a 4 semanas es suficiente para inducir la remodelación cardíaca. Por último, el éxito para la creación del modelo ISO puede evaluarse in vivo mediante ecocardiografía en serie que demuestra hipertrofia, dilatación ventricular y disfunción.
Introduction
La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) va acompañada de una respuesta compensatoria bien reconocida del sistema nervioso simpático para mantener la homeostasis cardiovascular1. Estrés hemodinámico y efectos nocivos en el corazón y la circulación se observaron con activación crónica. Estos se han convertido en la piedra angular de la farmacoterapia contemporánea para la insuficiencia cardíaca y son mecanismos importantes en la progresión de la insuficiencia cardíaca y el antagonismo terapéutico de los sistemas neurohormonales1.
Hay varios modelos de ratón disponibles para investigaciones básicas de insuficiencia cardíaca. Los modelos genéticos son atractivos para explorar terapias moleculares e investigar las vías de señalización. Sin embargo, estos modelos pueden no ser relevantes para las formas comunes de insuficiencia cardíaca. Otros modelos comunes incluyen ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), constricción transaortica (TAC) e isoproterenol (ISO), cada uno apuntando a una etiología patológica diferente2,3,4,5 ,6. La ligadura de la arteria LAD induce un infarto de miocardio de pared anterior creando así un modelo específico para la cardiomiopatía isquémica. TAC induce sobrecarga de presión aguda para crear un modelo hipertensivo de insuficiencia cardíaca. Aunque se puede medir el gradiente de presión, lo que permite la estratificación de la hipertrofia, la aparición aguda de la hipertensión carece de relevancia clínica directa4. Los modelos LAD y TAC requieren un alto nivel de experiencia quirúrgica para ejecutarse. El modelo ISO agudo de insuficiencia cardíaca imita la cardiomiopatía inducida por el estrés, también conocida como enfermedad de Takotsubo, que se caracteriza por un marcado aumento de las catecolaminas y la actividad en el ventrículo izquierdo que imita el infarto agudo de miocardio7, 8. Por el contrario, los modelos ISO crónicos de insuficiencia cardíaca presentan síntomas características de insuficiencia cardíaca avanzada, con niveles crónicamente elevados de catecolaminas1. Las ventajas del modelo ISO crónico son que proporciona estimulación adrenérgica crónica que imita la insuficiencia cardíaca avanzada y que es relativamente fácil de crear. El investigador debe elegir un modelo que recapitule mejor su patología de interés.
El objetivo general de este método es inducir la insuficiencia cardíaca en ratones utilizando una mini bomba implantada que libera ISO continuamente para imitar la activación simpática crónica que se encuentra en pacientes con insuficiencia cardíaca1. El método es simple y reproducible. Aunque hay una clara variación entre las cepas de ratón, ISO administrado durante 3 a 4 semanas a 30 mg/kg/día es suficiente para inducir la remodelación cardíaca en la mayoría de los ratones. Específicamente, ISO conduce a una fase compensatoria pro-hipertrófica durante la semana 1 seguida de adelgazamiento de la pared, dilatación ventricular y disminución de la función sistólica para la semana 2 y 32. El éxito para la creación del modelo ISO puede evaluarse in vivo mediante ecocardiografía en serie que demuestra hipertrofia, dilatación y disfunción ventricular, así como ex vivo a través de la evaluación histológica y molecular del tejido cardíaco cosechado para intramiocardio acumulación de lípidos, fibrosis, estrés urgencial, apoptosis y expresión génica9,10,11,12.
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Protocol
Este protocolo se adhiere a las directrices de cuidado animal de la Universidad de California, Los Angeles (protocolo ARC #2010-075). Se aconseja a los lectores que se adhieran a su propio protocolo aprobado por la IACUC, ya que el cuidado del ratón periprocedimiento y la gestión de la analgesia pueden ser específicos de la institución.
1. Preparación de la bomba osmótica isoproterenol
NOTA: Este procedimiento se ha aplicado con éxito en ratones hembra de más de 9 semanas que pesan 18+ g de más de 100 cepas de ratón endogámicas, así como, en ratones macho en un subconjunto de cepas. No hay límite máximo de peso corporal para este procedimiento. Incluya siempre controles coincidentes con la edad, ya que se desconoce si la edad del tratamiento afecta la susceptibilidad inducida por isoproterenol al desarrollo de insuficiencia cardíaca.
- Pesar y registrar el peso corporal de cada ratón.
- Calcular la cantidad y concentración adecuadas de isoproterenol para cada ratón (Ver Tabla 1 ; Archivo Suplementario).
NOTA: Las bombas osmóticas utilizadas en este experimento(Tabla de Materiales)tienen un volumen de depósito de 100 l y están diseñadas para suministrar medicamentos a caudales continuos durante un máximo de 28 días. Prepare una solución adicional de 20 ml de isoproterenol por bomba para tener en cuenta la pérdida de volumen en el tubo de llenado durante la carga de la bomba. - Pesar la cantidad adecuada de isoproterenol(Tabla 1) utilizando una balanza analítica y disolverla en 120 sL de solución estéril de NaCl al 0,9%. Pipetear vigorosamente o vórtice durante 1 min para solubilizar completamente isoproterenol.
NOTA: Prepare las bombas osmóticas en un gabinete de bioseguridad de laboratorio. Las bombas deben manipularse con guantes quirúrgicos. Se recomienda una técnica estéril durante la preparación de las bombas osmóticas y durante el procedimiento de implantación quirúrgica. - Pesar y grabar la bomba osmótica vacía junto con su moderador de flujo y luego eliminar el moderador de flujo.
- Aspirar 120 l de solución de isoproterenol en una jeringa de 1,0 ml y conecte el tubo de llenado de punta contundente de calibre 27 suministrado con las bombas osmóticas.
NOTA: Asegúrese de que la jeringa y el tubo de llenado estén libres de burbujas de aire. - Mientras sostiene la bomba en posición vertical, inserte el tubo de llenado a través de la abertura de la bomba en la parte superior hasta que la punta del tubo de llenado se sifique cerca de la parte inferior del depósito de la bomba.
- Cargue la bomba osmótica empujando el émbolo de la jeringa lentamente hasta que la solución de isoproterenol se llene hasta la abertura de la bomba.
- Retire cuidadosamente el tubo de llenado y limpie el exceso de solución.
- Inserte de nuevo el moderador de flujo para cerrar la bomba y limpiar cualquier exceso de solución.
- Confirme que más del 90% del volumen del depósito se ha llenado repesando la bomba osmótica.
NOTA: Las bombas de control se preparan de la misma manera llenando el depósito de la bomba con una solución estéril de NaCl al 0,9%.
2. Preparación de instrumentos quirúrgicos
- Limpie todos los instrumentos quirúrgicos, incluyendo el iluminador de microscopio de luz de anillo tórtuo de fibra óptica, 2 fórceps, soporte de aguja, esterilizadores de cuentas calientes, cuentas de vidrio y tijeras (Tabla de materiales).
- Instrumentos quirúrgicos de autoclave a 121oC durante 30 min para esterilizar instrumentos antes de la cirugía.
3. Implantación quirúrgica de bomba osmótica isoproterenol
- Inducir la anestesia colocando el ratón en una cámara de inducción con 3% de isoflurano en 95% de O2 y 5% de CO2. Mantener la anestesia con 2% de isoflurano a través de un nosecone.
- Administrar 5 mg/kg de carprofeno s.c. al cuello entre los omóplatos para la analgesia.
- Coloque pomada oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación corneal.
- Compruebe la profundidad de la anestesia monitoreando la tasa de respiración, el reflejo de pellizcar de los dedos de los dedos y el color de la membrana mucosa.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla calentada. Retire el vello de la parte inferior del abdomen y desinfecte la piel con betadina o clorhexidina.
NOTA: Para minimizar la infección postoperatoria, asegúrese de que el campo quirúrgico esté libre de cabello incidente. - Use un par de tijeras quirúrgicas para cortar una incisión de la piel de línea media de 1 cm de largo. Usa un par de tijeras contundentes para diseccionar cuidadosamente la piel de las paredes peritoneales subyacentes.
NOTA: Se prefiere una entrega intraperitoneal para acomodar el tamaño de la bomba. - Tire de las paredes peritoneales lejos del intestino subyacente con fórceps y corte un agujero de 0,8 cm en las paredes peritoneales usando tijeras quirúrgicas finas.
- Inserte la bomba osmótica en la cavidad peritoneal con el extremo del moderador de flujo primero.
- Cierre la bodega en las paredes peritoneales usando 5.0 suturas absorbibles de manera interrumpida. Utilice suturas 6.0 no absorbibles para cerrar la incisión cutánea de forma interrumpida.
- Coloque el ratón en una incubadora dedicada para mantenerlo caliente y seco durante la recuperación. Evaluar la recuperación de la anestesia mediante el monitoreo del ratón cada 30 minutos en las primeras dos horas para el retorno de la respiración y el movimiento normal.
- Una vez que el ratón se haya recuperado completamente de la anestesia, devuélvalo a la vivienda de rutina. Continúe monitoreando al animal en busca de complicaciones diarias hasta 3 días y luego cada 2 a 3 días después hasta el final del experimento.
NOTA: Los animales deben ser monitoreados en busca de evidencia de dolor o infección postoperatorio, signos de pérdida de peso, falta de movilidad, postura anormal, falta de aseo y lamer o morder excesivamente el área de la incisión. - Administrar carprofeno 5mg/kg s.c. cada 24 h durante un máximo de 48 h y posteriormente según sea necesario.
- Administrar 0,25 mg/ml de amoxicilina en agua potable durante 5 días para prevenir infecciones en el sitio quirúrgico.
- Retire las suturas no absorbibles después de 7 a 10 días.
4. Evaluación ecocardiográfica bajo anestesia
NOTA: La evaluación ecocardiográfica se puede realizar repetidamente para controlar la remodelación cardíaca en serie durante varias semanas. Realizamos mediciones ecocardiográficas a intervalos semanales durante 3 semanas.
- Inducir la anestesia en una cámara de inducción al 1,25% a 1,5% del isoflurano. Una vez que esté adecuadamente sedado, fije el ratón sobre la plataforma de ecocardiografía con cinta adhesiva que permite al ratón continuar recibiendo anestesia a través de un cono nasal.
- Disminuir el isoflurano a una dosis de mantenimiento de 1% para minimizar los efectos cronotrópicos e inotrópicos negativos de la sobresedación. Tome nota de las frecuencias respiratorias y cardíacas a lo largo del estudio y ajustar la dosis de isoflurano según sea necesario.
- Retire el pelo del pecho con una loción depilatoria y limpie el pecho libre de pelo.
- Coloque el gel de ultrasonido en el pecho y coloque la sonda de ultrasonido para obtener una imagen del corazón.
- En el modo B, idee el ventrículo izquierdo (LV) en la vista parasternal del eje largo. Ajuste la plataforma de ecocardiografía para alinear la válvula aórtica y el ápice LV en el plano del haz de ultrasonido.
- Incline la plataforma de ecocardiografía para colocar el eje largo LV a 90 grados al haz de ultrasonido y el diámetro máximo del LV en el centro de la imagen.
- Imagen del eje corto LV girando la sonda de ultrasonido 90 grados.
- En modo M, mida el espesor de la pared LV y las dimensiones internas.
- Vuelva a colocar el ratón en la jaula. Monitor para el retorno de la respiración normal y movimientos espontáneos del cuerpo.
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Representative Results
En nuestro estudio publicado anteriormente, administramos una dosis ISO de 30 mg/kg/d durante 21 días a través de la bomba osmótica a través de 105 cepas del Panel híbrido de diversidad de ratones (HMDP)2,13. Evaluamos los resultados utilizando ecocardiograma realizado al inicio, semana 1, 2 y 3 del tratamiento ISO(Figura 1). Al igual que un estudio previo donde los autores estudiaron el impacto del isoproterenol entre 23 cepas de ratón14, observamos una sorprendente variación entre cepas entre los parámetros ecocardiográficos. Se presenta el resumen de los cambios semanales basados en los parámetros ecocardiográficos y el tiempo previsto para el desarrollo del modelo (Figura 2 y Figura 3)2,15. Aunque se observaron variaciones entre las cepas de ratón, en promedio, el espesor de la pared interventricular del tabique al final de la diástole (IVSd) y el acortamiento fraccionario (FS) aumentan en la primera semana, pero disminuyen en puntos de tiempo posteriores; diámetro interno ventricular izquierdo en la diástole final (LVIDd) y la masa ventricular izquierda (LVM) aumentan durante un período de 3 semanas(Figura 3). Estos hallazgos son consistentes con una fase compensatoria pro-hipertrófica durante la semana 1 de isoproterenol seguida de adelgazamiento de la pared, dilatación ventricular y disminución de la función sistólica. Nuestro estudio publicado anteriormente también demostró la regulación ascendente de varios subconjuntos genéticos asociados con la hipertrofia ventricular izquierda, incluyendo el marcador fibroso Lgals3 y el marcador de insuficiencia cardíaca Nppb para la semana 32. Otros genes regulados diferencialmente incluyen los involucrados en la angiogénesis, glicoproteína de señal secreta, unión a polisacáridos, citoesqueleto de actina, vía de señalización de quimiocina, matriz extracelular proteica y colágeno2. Estos resultados son corroborados por hallazgos ecocardiográficos e histológicos: los corazones del ratón demostraron dimensiones visiblemente más grandes de la cámara ventricular izquierda bajo ISO y mayores cantidades de fibrosis bajo tratamiento ISO en relación con el control salino(Figura 4).
Figura 1: Modelo de insuficiencia cardíaca inducida por isoproterenol crónico (ISO) a través de mini-bomba.
Esta figura ha sido adaptada con el permiso de Wang et al.2 y Chang et al.15Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Variación en las medidas ecocardiográficas de la estructura cardiaca y la función entre las cepas de ratón del Panel híbrido de diversidad de ratones (HMDP).
Las barras negras representan mediciones bajo la condición de línea base en orden de clasificación. Las barras blancas representan mediciones después de 3 semanas de perfusión ISO continua. IVSd - espesor de la pared interventricular del tabique; LVIDd - diámetro interno del ventyéxizquierdo izquierdo en la diastolato final; LVM - masa ventricular izquierda; FS: acortamiento fraccionario. Las barras de error representan los errores estándar de los medios (SEM). Esta figura ha sido adaptada con el permiso de Wang et al.2 y Chang et al.15.
Figura 3: Los cambios medios en las medidas ecocardiográficas en comparación con la línea de base en cada punto de tiempo ISO para cada cepa endogámica clásica.
Esta figura ha sido adaptada con el permiso de Wang et al.2 y Chang et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios ecocardiográficos e histológicos después de la perfusión crónica de isoproterenol.
(A) Se muestran imágenes representativas del ecocardiograma en modo M de 2 ratones al inicio y en la semana 3 de isoproterenol. Tenga en cuenta el agrandamiento de las dimensiones internas del ventínventricular izquierdo en ambos ratones, así como el desarrollo de fibrosis endocardial (flecha roja) en #2 de ratón. (B) La tinción tricroma de Masson del ventrículo izquierdo en el eje corto demuestra una fibrosis extensa con tratamiento con isoproterenol (barra de escala: 2 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Peso corporal (g) | Dosis diaria (g/día) | Caudal (L/día) | Concentración (L/día) | Isoproterenol (mg/120 l) |
| 20 | 600 | 2.64 | 227 | 27.3 |
| 21 | 630 | 2.64 | 239 | 28.6 |
| 22 | 660 | 2.64 | 250 | 30 |
| 23 | 690 | 2.64 | 261 | 31.4 |
| 24 | 720 | 2.64 | 273 | 32.7 |
| 25 | 750 | 2.64 | 284 | 34.1 |
| 26 | 780 | 2.64 | 295 | 35.4 |
| 27 | 810 | 2.64 | 307 | 36.8 |
| 28 | 840 | 2.64 | 318 | 38.2 |
| 29 | 870 | 2.64 | 330 | 39.5 |
| 30 | 900 | 2.64 | 341 | 40.9 |
Tabla 1: Concentración de isoproterenol y preparación para pesos corporales representativos a la velocidad de la bomba osmótica de 30 mg/kg/d. Esta tabla ha sido adaptada con el permiso de Wang et al.2 y Chang et al.15.
Archivo suplementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Hemos aplicado este método a más de 100 cepas de ratones endogámicos para evaluar los resultados cardíacos debido a la estimulación beta-adrenérica crónica2,13. Se sabe que existen diferencias significativas en la susceptibilidad al isoproterenol entre las cepas de ratón y pueden personalizarse para la cepa de interés según sea necesario16. Esto puede deberse a la variación en la función del receptor beta-adrenérgico entre las cepas del ratón17, diferencias dependientes de la tensión en la actividad del sistema nervioso autónomo16, la densidad del receptor beta-adrenérgico (beta-AR) y/o el acoplamiento17 y otras diferencias genéticas entre las cepas. Basado en ecocardiografía serial in vivo, así como en la histología del tejido cardíaco ex vivo y la expresión génica con y sin ISO, el tratamiento crónico con isoproterenol indujo diferencias sorprendentes que abarcan desde procesos celulares, matriz extracelular a inflamatoria respuestas2,13. Las siguientes consideraciones pueden ser relevantes para la aplicación de este modelo de insuficiencia cardíaca.
Cerca del 30% de los ratones implantados con bomba osmótica isoproterenol murieron antes del final del protocolo experimental2,13. De ellos, más del 90% murió en las primeras 48 horas después de la implantación de la bomba. Las muertes parecían específicas de la tensión, con BXA-12/PgnJ, BXD-34/TyJ, BTBRT<+>tf/J, NZW/LacJ, BXD40/TyJ, y BALB/cJ siendo las cepas más susceptibles. Además, observamos que los ratones que pesaban 20 g tenían una mayor mortalidad postoperatoria temprana (muerte dentro de 48 h). Permitir que los ratones maduren al menos a 9 a 10 semanas de edad o > 20 g puede minimizar la mortalidad postoperatoria temprana. Por lo tanto, puede ser importante tener en cuenta las diferencias específicas de la tensión y la mortalidad postoperatoria temprana al planificar un experimento. No realizamos una autopsia para determinar la causa de la muerte. Por lo tanto, no somos capaces de determinar la tasa de fallas de las bombas osmóticas. De los ratones que fueron sacrificados no detectamos defectos visuales.
Se sabe que el isoflurano es negativomente cronotrópico e inotrópico. Se debe tener cuidado de minimizar la sedación y el impacto del isoflurano en las mediciones ecocardiográficas. Si el esternón proyecta una sombra ósea y degrada las cualidades de la imagen, cambie la posición del ratón para que idee el corazón a través de un espacio intercostal diferente. Si la medición del espesor de la pared interventricular se complica por la presencia de la pared ventricular derecha, vuelva a crear una imagen a través de un espacio intercostal diferente para minimizar los bordes mal delineados. Las mediciones precisas son fundamentales para los análisis comparativos posteriores.
Existe literatura que documenta el uso de minibombas osmóticas en ratas18,19. Los lectores deben tener en cuenta que este protocolo sólo se ha utilizado con ratones y que se debe hacer referencia a otra literatura para la experimentación con otras especies.
La literatura anterior sugiere que las inyecciones diarias de isoproterenol y la administración continua a través de bombas osmóticas causan un peso ventricular similar en relación con el peso corporal20. Sin embargo, hay diferencias en la hemodinámica. Las inyecciones diarias causan hipotensión inmediata y taquicardia seguida de hipertensión de rebote en pocas horas. La administración continua causa hipotensión inmediata el día de la implantación de la bomba seguida de la normalización de la presión arterial a la hipertensión leve para el día 220. Las tendencias hemodinámicas generales imitan más de cerca las hormonas simpáticas activadas crónicamente en pacientes con insuficiencia cardíaca.
En la semana 1 de isoproterenol, contractilidad se incrementó o supernormal. Para la semana 2 y 3, la contractilidad volvió a la normalidad para la mayoría de las cepas y disminuyó para algunas cepas. En el contexto del isoproterenol en curso, la contractilidad normal medida por el acortamiento fraccionado (FS) y la fracción de eyección (EF) puede, de hecho, representar una reserva contráctilela deteriorada. Si el investigador desea inducir un grado más profundo de deterioro cardíaco, uno puede aumentar la dosis ISO o alargar el período de tratamiento ISO a 4 semanas, mientras que pesa el riesgo de mayor mortalidad postoperatoria. Por último, los datos que presentamos se basaron únicamente en ratones hembra. Los ratones hembra han demostrado una mayor función contráctile post-isquémica y menor agotamiento de ATP en un modelo de lesión por reperfusión de isquemia en comparación con los ratonesmachos 21. Además, en un modelo ISO crónico, los ratones machos han demostrado una elevada relación corazón-peso corporal y han reducido los niveles totales de noradrenalina en las glándulas parótidas y submaxilares en comparación con las hembras22. El usuario puede tener que considerar las diferencias basadas en el género en los resultados observados al aplicar este enfoque a las mujeres y los hombres.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen a NIH K08 HL133491 por su apoyo a la financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place | Alzet | Model 1004 | Includes filling tube, flow moderator and pump body |
| (-)-Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 16504-1G | (-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C. |
| 1 ml sterile syringe | VWR | BD309602 | |
| 30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator | AmScope | SKU: LED-30WR | |
| 5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture | Ethicon | J303H | 5-0, absorbable |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Glass beads | FST | 18000-46 | |
| Hot bead sterilizers | FST | 18000-50 | |
| Iris forceps | WPI | 15915 | |
| Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture | LOOK | AA-2176 | 6-0, non-absorbable |
| Needle holder | WPI | 15926 | |
| Normal Saline, 0.9% NaCl | Fisher | 89167-772 |
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