Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59647
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Science, Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

تحدث التغيرات المورفولوجية في الخلايا الليفية المتجاوبة المناعية بعد التنشيط وتعزيز التعديلات في التوظيف الخلوي. استخدام التصوير بفوتونين بالاقتران مع بروتين خاص بالفيبلاف 1 (FSP1) من الفوتونات وراثياً؛ tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) خط الماوس والأخضر الفلورسنت الموسومة lipopolysaccharide-FITC، يمكننا أن نوضح استيعاب محددة للغاية من lipopolysaccharide في الخلايا الليفية الجلدية والتغيرات المورفولوجية في الجسم الحي.

Abstract

الخلايا الليفية هي الخلايا mesenchymal التي تغير مورفولوجيا عند التنشيط، مما يؤثر في نهاية المطاف على البيئة الدقيقة للأنسجة التي تقع فيها. على الرغم من أن تقنيات التصوير التقليدية مفيدة في تحديد تفاعلات البروتين ومورفولوجيا في الأنسجة الثابتة، فإنها ليست قادرة على إعطاء نظرة ثاقبة حول مدى سرعة الخلايا قادرة على ربط وكمية البروتينات، ومرة واحدة تنشيط كيف يتغير مورفولوجيا في فيفو. في هذه الدراسة، ونحن نسأل 2 الأسئلة الرئيسية: 1) ما هو المسار الزمني لتنشيط الخلايا الليفية عن طريق تأثير مثل مستقبلات-4 (TLR4) وتفاعل lipopolysaccharide (LPS) و 2) كيف تتصرف هذه الخلايا مرة واحدة تفعيلها؟ باستخدام التصوير 2-فوتون، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتقييم قدرة LPS-FITC لربط مستقبلات الكونات، TLR4، وأعرب عن الخلايا الليفية الطرفية في خط الماوس مراسل الوراثية. FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox في الجسم الحي. هذا النهج الفريد يسمح للباحثين لخلق أشرطة الفيديو المتعمقة، الفاصل الزمني و / أو صور من البروتينات التفاعل مع الخلايا الحية التي تسمح للمرء أن يكون مستوى متزايد من الحبيبية في فهم كيف يمكن للبروتينات تغيير السلوك الخلوي.

Introduction

Lipopolysaccharide (LPS) هو إندوتوكسين موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبية الغرام1. LPS لديه تقارب ملزم عالية لمستقبلات مثل الرسوم 4 (TLR4)/CD14/MD2 مستقبلات مجمع2. TLR4 هو مستقبلات التعرف على نمط وجدت عادة على الغشاء الخارجي لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية, الخلايا mesenchymal, ومجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية3,4,5. يؤدي تنشيط TLR4 المعبر عنه على الخلايا المناعية إلى أنظمة رسول ثانية معتمدة على MyD88 ومستقلة، وتنتهي بنقل بيتا كابا العامل النووي (NFיB) إلى نواة الخلية. وهذا يسبب الخلية المناعية prototypic لإنتاج وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل إنترلوكين (IL)-1β، IL-6، و TNF-α6. ومع ذلك, كيف تستجيب أنواع الخلايا الأخرى لتحفيز TLR4 ليست واضحة كما. وقد تورطت الخلايا الليفية في مجموعة واسعة من الأمراض مثل السرطان والتليف الكيسي، وقد ثبت مؤخرا أن تلعب دورا monocyte العلاج الكيميائي الجذب وتعزيز التهاب7،8،9.  يهتم مختبرنا بدور الخلايا الليفية في تطوير الألم الحاد والمزمن، حيث تشير الأدلة المبكرة إلى أن العوامل التي تطلقها الخلايا الليفية (مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، مثبطات الأنسجة من metalloproteinases (TIMPs)، والخلايا الليفية عوامل النمو (FGFs)) تشارك في الألم العصبي10.

يمكن تحديد حالات تنشيط الخلايا من خلال مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل: تحريض الجينات الفورية المبكرة، وتغيير التعبير البروتيني، وانتشار الخلايا، والتغيرات المورفولوجية11،12،13. هناك العديد من التقنيات الموجودة للإجابة على الأسئلة التي قد تكون لدينا حول كيفية تنشيط الخلايا يساهم في الأمراض، ولكن لديهم جميعا قيودها. يستخدم الكيمياء المناعية النمطية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتسمية البروتينات ذات الأهمية في الأنسجة الثابتة، والتي قد تكون غير محددة وغالبا ما تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرة قبل أن تسفر عن نتائج مثمرة14. النشاف الغربي هو تقنية مفيدة عند مقارنة مستويات التعبير البروتين في أنسجة ما بعد الوفاة. ومع ذلك، فإن العنصر النسيجي يفتقر إلى هذه التقنية والباحثين غير قادرين على تحديد أي تغييرات في مورفولوجيا15. RNA-Seq يسمح لنا لتحديد كمية وجود RNA رسول في عينة التي في كثير من الحالات تسفر عن بيانات ثاقبة. ومع ذلك، فإن الفجوة بين النسخ والترجمة يجعل من الصعب أن يكون القرار الزمني بعد التحفيز16. التصوير البؤري مفيد في تحديد التعبير والتعريب المشترك للبروتينات الموجودة في مقطع عرضي من الأنسجة17. في كثير من الأحيان، وهذا لا يمثل كامل عينة الأنسجة. وعلى النقيض من ذلك، تسمح المجاهر متعددة الفوتونات للمستخدمين بتصوير ما يقرب من 1 مم في عمق العينة، وخلق تمثيل شامل ثلاثي الأبعاد18. لذلك، نختار التركيز على في الجسم الحي، 2-الفوتون التصوير الإعدادية، والبيانات التي تم جمعها من هذه التجارب هي أكثر مباشرة ذات الصلة إلى البيئة الدقيقة البلاستيكية للغاية ومترابطة من الأنسجة الحية.

ميزة دراسة التفاعلات مستقبلات البروتين في الجسم الحي هو أننا يمكن أن التقاط بوضوح كيف تستجيب الخلايا لتحفيز, في الوقت الحقيقي, في بيئتهم الأصلية دون تأثير ضار وغير متوقع لاستخراج الأنسجة بعد الوفاة19. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء دراسات طولية لتقييم اللدونة الخلوية وفتيلة التي قد تحدث بسبب التنشيط.  باستخدام التصوير 2-فوتون، ونحن الحفاظ على سلامة البيئة الدقيقة موجودة عند تطبيق التحفيز الخارجي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد الاستفادة من الجزيئات في الخلايا الليفية بعد الحقن المحيطي من LPS الموسومة بشكل فلوري على مدى عدة ساعات في الجسم الحي ودور TLR4 في تنشيط الخلايا الليفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل جامعة تكساس في دالاس المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.  وقد أجريت جميع التجارب باستخدام الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8-12 أسبوعا ولدت في المنزل على خلفية C57BL/6. تم شراء الفئران المعدلة وراثيا مع الكري-recombinase مدفوعة من قبل المروج البروتين-1 محددة الليفية تجاريا (جاكسون، 012641) (FSP1cre)+/- وعبرت مع tdTomatolox-stop-lox الفئران، كما تم شراؤها تجاريا ( جاكسون, 007914) و ([فسب1كر])+/- ; tdTomatolox-stop-lox and FSP1cre-/-; ولدت tdTomatolox-stop-lox الفئران في المنزل على خلفية C57BL/6 (الشكل1A، B،C). البروتين الليفي الخاص 1 هو بروتين داخلي يعبر عنه على ما يقرب من 72٪ من الخلايا الليفية ويمثل سائق الكري فعالة في الأنسجة الجلدية20. وكانت الفئران تؤوي مجموعة وأعطيت إمكانية الحصول على الغذاء والماء. تم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة عند 21 ± 2 درجة مئوية. في حين استخدمنا C57BL/6 عبرت الفئران الذكور والإناث في 8-12 أسابيع، ونحن لا نعتقد أن العمر، الجنس، أو الخلفية الوراثية هي المتطلبات اللازمة لتشغيل التجارب متعددة الفوتونات. تم التخدير العميق للفئران مباشرة بعد التجربة وقتلوا.

1- تحضير المخدرات

  1. إعداد حل 5 ميكروغرام/20 ميكرولتر من الليبوبوليساكاريد-فيتك (انظر جدولالمواد) في PBS معقمة 1X (درجة الحموضة 7.4). دوامة حل الأسهم في كثافة متوسطة لمدة 30 ثانية الحد الأدنى لضمان خلط متجانسة لتركيز متساو في جميع أنحاء الحل قبل الأنابيب (LPS هو جزيء الدبق).
    ملاحظة: لا تضع LPS في حاوية زجاجية، إذا كان ذلك ممكناً، استخدم أنابيب الطرد المركزي الصغير السيليكونية. يُحفظ على الجليد حتى يُستعمل.

2. التصوير الإعداد

  1. قم بإعداد النظام متعدد الفوتونات (راجع جدولالمواد) للتصوير بلونين. وهذا يتطلب استخدام ليزرين منفصلين للإثارة (انظر جدولالمواد)، ومجموعة مكعب فلتر GFP/RFP (انظر جدول المواد)، وهدف غمر المياه بـ 25 x (1.05 NA) (انظر جدولالمواد).
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين تغيير هذه الإعدادات لتناسب بشكل أفضل الإعدادات البديلة وقدرات المجهر multiphoton. هذه هي المعلمات المستخدمة في البروتوكول التجريبي. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة.
  2. وضع جهاز مجسم (انظر جدولالمواد) على خشبة المسرح من المجهر متعدد الفوتون. توصيل هذا إلى آلة تسليم التخدير (انظر جدولالمواد) لضمان تخدير الحيوانات لمدة التجربة. ضع قطعة من الورق الأسود غير اللامع على سطح الجهاز كنقطة اتصال لمخلب الماوس.
  3. حدد الماسح الضوئي الرنانة مع منطقة مسح ثابتة من 512 ميكرومتر × 512 ميكرومتر.
    ملاحظة: لا تقم بإجراء التجارب في هذا البروتوكول باستخدام الماسح الضوئي مقياس الجلفانومتر. بسبب معدل العينة أبطأ، سيكون هناك تشويه في z-كومة أشرطة الفيديو الفاصل الزمني بسبب التنفس من الحيوان الذي لا مفر منه.
  4. ضبط الليزر الإثارة اثنين إلى الأطوال الموجية الإثارة من GFP وRFP، 930 نانومتر و 1100 نانومتر على التوالي، وتوجيه مسار الضوء من كل من الليزر الإثارة إلى هدف واحد باستخدام مرآة dichroic من 690-1050 نانومتر السماح ليزر الإثارة 930 nm ضبطها أن تنعكس على الماسح الضوئي الرئيسي والليزر 1100 نانومتر ضبطها لتمريرمباشرة إلى الماسح الضوئي الرئيسي (الشكل 2).
    ملاحظة: من الممكن تغيير هذه الأطوال الموجية الإثارة استناداً إلى إعداد المستخدم.
  5. تعيين قوة الليزر من FITC إلى 5٪ وGFP إلى 20٪.
    ملاحظة: يوفر هذا الإعداد نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية (SNR) في هذه التجارب. الكشف عن إشارة عن طريق أنابيب متعددة القلويات ومضاعف ة للصورة (PMTs)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أجهزة الكشف GaAsP بدلاً من ذلك في تجارب عالية الحساسية جداً.
  6. إعداد غرفة للتصوير في ظل ظروف مظلمة دون ضوء طائش.

3. في التصوير الحي

  1. ضع الماوس في غرفة الحث في نظام توصيل التخدير واستخدم 5% من الأيسوفلوران (انظر جدولالمواد) بمعدل تدفق الأكسجين 2 لتر/دقيقة لوضع الماوس تحت التخدير العميق.
    ملاحظة: من المستحسن للغاية ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التجربة.
    1. نقل الماوس إلى جهاز مجسممع مع الوصول إلى مخروط الأنف للحفاظ على التخدير طوال التجربة. خفض isoflurane إلى 1.5٪ -2٪ والحفاظ على معدل التدفق ثابت.
    2. تثبيت بقوة مخلب الخلفية إلى قطعة من الورق الأسود مع الشريط الأسود على المناطق القريبة والبعيدة على حد سواء إلى منطقة الاهتمام (وهذا يقلل من آثار التنفس الماوس على جودة الصورة)، والتأكد من سطح الأخمص من مخلب هو دون عائق وتواجه حتى نحو الهدف. تأكد من أن رأس الماوس مستقر داخل مخروط الأنف المرفقة بالجهاز.
      ملاحظة: مراقبة الماوس عن أي علامات الشدة أو الجفاف طوال التجربة وضبط isoflurane وفقا لذلك.
  2. وضع كمية سخية من زيوت التشحيم المعقمة القائمة على المياه (هلام، انظر جدولالمواد) على سطح الأخمص من مخلب ولمس الهدف لذلك من أجل خلق عمود من السائل بين مخلب والهدف.
  3. استخدم ضوء الإثارة FITC للتركيز في الطبقة الجلدية من الكف. تأكد من أن يتم تصور الخلايا الليفية الموسومة tdTomato قبل الاستمرار في (هذه الخطوة مهمة في تحديد المستوى البؤري الصحيح إلى الصورة).
    ملاحظة: الطبقة الجلدية من مخلب حوالي 100-150 ميكرومتر في مخلب.
  4. صورة منطقة الخلايا الواقعة تحت سطح الأخمص من مخلب الخلفية مع كل من 930 نانومتر و 1100 نانومتر ضبطها الليزر والحصول على 15 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي 5-10 z-شرائح في حوالي 1 ميكرومتر لكل شريحة لإنشاء تمثيل للبيئة قبل حقن مع LPS-FITC.
  5. إجراء حقن داخل البلنطاتر من 5 ميكروغرام /20 ميكروغرام LPS-FITC على مخلب الماوس الخلفي باستخدام 25 ميكرولتر زجاج هاميلتون حقنة (انظر جدولالمواد) وإبرة 30G (انظر جدولالمواد)، مع الحرص على عدم إزعاج موقف مخلب.
  6. صورة منطقة من الخلايا تقع مباشرة تحت سطح الأخمص من مخلب الخلفية مع كل من 930 نانومتر و 1100 نانومتر ضبطها الليزر والحصول على 60-120 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي 5-10 z-شرائح في ما يقرب من 1 ميكرومتر لكل شريحة لتحديد استيعاب LPS-FITC من قبل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في البداية، حقننا LPS-FITC في الكف الخلفي من الفئران البرية من أجل تصور استيعاب LPS-FITC في جميع أنواع الخلايا الموجودة في الطبقة الجلدية من مخلب. بعد أن لاحظت عددا لا يحصى من الخلايا في الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية الاستفادة من الفلورسنت الموسومة LPS في فأر ة نوع البرية (فيديوالشكل 1،2)، حاولنا استهداف الخلايا الليفية على وجه التحديد لأنها هي التركيز الرئيسي في أبحاثنا. قبل تصوير الكفوف من الحيوانات حقن مع LPS-FITC أردنا أن نكون واضحين أنه لا يوجد الفلورة المتأصلة في الخلايا في طبقة الجلد. هذا هو لضمان أنه بعد الحقن، والصور التي نتخذها هي تفاعلات حقيقية من الخلايا مع LPS ذات العلامات الفلورية وليس أي القطع الأثرية التصوير (فيديوالشكل 3، 4). بعد حقن LPS-FITC، فقط FSP1+ الخلايا الليفية التي تعبر عن TLR4 ربط واستيعاب البروتين المحقون، مع مستوى عال من التعريب المشترك مع علامة tdTomato التي تعبر عنها هذه الخلايا (فيديو الشكل 5). وعلى النقيض من ذلك, الفئران التي لديها TLR4خرج من الجسم بأكمله (TLR4 KO) لا ربط واستقبال LPS بعد الحقن. كما هو واضح في الفيديو، صور ظلية من الخلايا مرئية بعد حقن LPS-FITC الذي يشير إلى أن المخدرات تنتشر في السائل الخلالي حول الخلايا ولكن لا يتم في الواقع ملزمة من قبل مستقبلات (فيديوالشكل 6).

لتلخيص نتائجنا، ونحن نظهر، في الجسمالحي، أنه بعد حقن LPS-FITC، في FSP1cre. tdTomatolox-stop-lox خلية محددة إعادة تنشيط الحيوان فقط الخلايا الليفية تتفاعل مع وتحمل LPS. في المقابل, بالضربة القاضية لكامل الجسم من TLR4 لا ربط واستيعاب LPS-FITC بعد الحقن.

Figure 1
الشكل 1 يتم التعبير عن tdTomato فقط في FSP1+ الخلايا الليفية بطريقة تعتمد على Cre. A)يتم عبور الفئران المعدلة وراثيا FSP1cre ولدت على خلفية C57BL/6 مع الفئران tdTomato ولدت على خلفية C57BL/6 لتوليد الفئران أعرب tdTomato في FSP1+ الليفية بطريقة تعتمد على الكري. ب)النتائج التمثيلية PCR التي تصور الفئران FSP1cre الإيجابية والسلبية التي تعبر عن tdTomato. ج)التصوير التصويري التمثيلي للفليّات الجلدية في الفضاء خارج الخلية الموجود في مخلب الماوس. FSP1+ الفئران التعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر فقط في الخلايا الليفية في حين FSP1- الفئران لا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . ضوء المسار من اثنين من لون 2-الفوتون المجهر. تصوير مسار الضوء الذي تم إعداده لتجربة 2-لون 2-فوتون إعداد. يتم ضبط الليزر 1 إلى 930 نانومتر لإثارة LPS FITC-المترافقة والليزر 2 يتم ضبطها إلى 1100 نانومتر لإثارة tdTomato وجدت في الخلايا الليفية. ينعكس ضوء الإثارة من الليزر 1 من قبل مرآة dichroic (690-1050 نانومتر) في حين ضوء الإثارة من الليزر 2 يمر من خلال إلى الماسح الضوئي الرئيسي. وينعكس ضوء الإثارة من كلا الليزرين من خلال مجموعة من المرايا إلى مرآة ثنائية التفكير الثانية (650 نانومتر) مما يسمح للضوء الإثارة لتمرير من خلال الهدف وإلى الأنسجة لإثارة الفلوروفور. وينبعث الضوء من الفلوروفور المتحمس، ويُسبّأ بهدف 25 x وينعكس على المرآة الديكروية (650) إلى أنابيب المضاعف الضوئي القلوية المتعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . مخطط التدفق التجريبي للميكروسكوب الفوتون 2. يتم تخدير الفئران وشل حركتها باستخدام نظام التخدير منخفض التدفق وجهاز مجسم. يواجه السطح الأخمصي للمخلب الهدف ويتم تصويره لمدة 15 دقيقة. يتم إجراء حقن داخل البلنطار من 5 ميكروغرام/20 ميكرولتر LPS-FITC على الماوس التخدير ثم يتم تصوير مخلب لمدة من الوقت اللازمة لهدف التجربة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Video Figure 1
فيديو الشكل 1. Z-كومة أشرطة الفيديو من LPS-FITC استيعاب في الخلايا في البرية نوع C57BL/6 الفئران. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس C57BL/6 قبل حقن LPS-FITC. تم تصوير الجانب الأخمصي لمخلب الماوس من النوع البري لمدة 15 دقيقة قبل الحقن مع LPS-FITC للتحكم في الفلورة الذاتية المنتجة في قناة GFP. هناك إشارة قليلة إلى لا شيء في قناة GFP تشير إلى عدم وجود الفلورة الذاتية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video Figure 2
فيديو الشكل 2. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس C57BL/6 بعد حقن LPS-FITC. تم تصوير الجانب الأخمصي من مخلب الماوس نوع البرية لمدة 1.5 ساعة بعد LPS-FITC حقن لتصور استيعاب LPS-FITC من قبل جميع الخلايا التي تعبر عن TLR4. كما هو واضح في الفيديو، وهناك العديد من الخلايا ربط واستيعاب LPS-FITC طوال فترة التجربة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video Figure 3
فيديو الشكل 3. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من FSP1cre. tdTomato الماوس قبل حقن LPS-FITC. الجانب الأخمصي من FSP1cre; تم تصوير مخلب الماوس tdTomato لمدة 15 دقيقة قبل الحقن مع LPS-FITC للسيطرة على autofluorescence المنتجة في قناة GFP. هناك إشارة قليلة إلى لا شيء في قناة GFP تشير إلى عدم وجود الفلورة الذاتية. يتم تصور الخلايا الليفية الإيجابية tdTomato. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video Figure 4
فيديو الشكل 4. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس TLR4KO قبل حقن LPS-FITC. تم تصوير الجانب الأخمصي من مخلب الماوس TLR4KO لمدة 15 دقيقة قبل الحقن مع LPS-FITC للسيطرة على autofluorescence المنتجة في قناة GFP. هناك إشارة قليلة إلى لا شيء في قناة GFP تشير إلى عدم وجود الفلورة الذاتية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video Figure 5
فيديو الشكل 5. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من FSP1cre. tdTomato الماوس بعد حقن LPS-FITC.  الجانب الأخمصي من FSP1cre; تم تصوير مخلب الماوس tdTomato لمدة 1.5 ساعة بعد LPS-FITC حقن لتصور استيعاب LPS-FITC عن طريق tdTomato إيجابية الخلايا الليفية التعبير عن TLR4. كما هو واضح في الفيديو, وينظر إلى استيعاب محددة للغاية من LPS-FITC عن طريق TLR4 أعرب على tdTomato إيجابية الخلايا الليفية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video Figure 6
فيديو الشكل 6. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس TLR4KO بعد حقن LPS-FITC.  تم تصوير الجانب الأخمصي من مخلب الماوس TLR4KO لمدة 1.5 ساعة بعد LPS-FITC حقن لتصور ما إذا كان استيعاب LPS-FITC من قبل الخلايا في ضربة قاضية لكامل الجسم من TLR4 ممكن. كما هو واضح في الفيديو، لا ينظر إلى استيعاب LPS-FITC من قبل الخلية في الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن القول أن أهم الخطوات في الجسم الحي 2-فوتون التصوير هي: 1) اختيار الماوس مراسل الوراثية الحق والبروتين الفلورسنت الموسومة لإعداد الفوتون متعددة والاحتياجات التجريبية21،22؛ 2) تصوير المستوى البؤري الصحيح ليكون لها تمثيل دقيق لسكان الخلايا في الأنسجة23؛ 3) التقليل من الحركة بسبب الحيوان المعطلة بشكل غير صحيح24؛ و4) اختيار متى لتحليل البيانات نوعيا مقابل كميا25،26،27. ومن شأن ضمان معالجة هذه النقاط قبل بدء التجربة أن يوفر المعرفة اللازمة لجمع البيانات القابلة للاستنساخ والصارمة علمياً على حد سواء.

وثمة اعتبار هام في البروتوكول هو تعطيل المنطقة بشكل صحيح لكي يتم تصويرها. التنفس من الحيوان يسبب تحولات دقيقة في المستوى البؤري أثناء التصوير وعند تنفيذ z-كومة والوقت الفاصل الفيديو، وهذا يسبب تشويه كبير في الفيديو ويمكن أن تؤثر سلبا على نوعية البيانات المنتجة. ضمان أن يتم تعطيل مخلب بشكل صحيح سوف تسمح التصوير الناجح للمخلب دون انقطاع من التنفس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معرفة توطين الخلايا في التجربة هي خطوة حاسمة في تحديد المستوى البؤري الصحيح لتصور. لأننا اخترنا التركيز على الخلايا الليفية الجلدية، ونحن بحاجة فقط إلى صورة مسافة قصيرة نسبيا في مخلب لتكون قادرة على تصور أنواع الخلايا لدينا من الفائدة (~ 100-150 درجة مئوية). في تجارب أخرى، من المهم النظر في قدرات المجهر والهدف واحد يستخدم لأن إجراء تجربة لتصوير الخلايا في عمق الأنسجة قد يكون تحديا إلى المستحيل نظرا للمستخدمين إعداد.  وأخيراً، فإن اختيار كيفية التعامل مع تحليل البيانات هو اعتبار هام في الخطوات النهائية للتجربة. هنا، ونحن نظهر أن الخلايا الليفية التي تعبر عن TLR4 قادرة على الاستفادة وربط LPS ذات العلامات الفلورية وهو ما يتضح من التعريب المشترك القوي للأخضر (LPS) والأحمر (tdTomato التي تعبر عنها الخلايا الليفية) في أشرطة الفيديو. على الرغم من عدم إجراء تحليل صورة كمية في هذا البروتوكول، هناك مجموعة متنوعة من الطرق التي يمكن للمستخدم تفسير البيانات التي تم جمعها من هذا البروتوكول. الأول هو تحليل بسيط للتعريب المشترك باستخدام برامج مفتوحة المصدر لقياس كثافة لونين متميزين في بكسل معين28. وهذا يسمح للمستخدم بتحديد ما إذا تم الكشف عن اثنين من الفلوروفور متحمس على بكسل معين في صورة أو فيديو المكتسبة وكم من هذا التداخل هناك في مساحة معينة. وهذا مفيد في تحديد ما إذا كانت الخلايا ذات الاهتمام تتفاعل مع بعض القدرات مع جزيء حقن. طريقة بديلة للتحليل الكمي هي كثافة الفلورة29. المستخدم قادر على جمع معلومات عن شدة إشارة معينة داخل خلية من الفائدة. وقد تشير البيانات التي تم جمعها من هذه التحليلات إلى كيف يمكن للخلايا أن تمتص كميات مختلفة من الجزيء بالمقارنة مع غيرها. هذه الأساليب لتحليل البيانات هي مثال على كيفية سعي المستخدم إلى تحليل البيانات التي تم جمعها من تجربة مشابهة لتلك التي أجريت في هذا البروتوكول.

نماذجنا الوراثية تسمح لنا بعلامة الفلورسنت بشكل انتقائي (tdTomato) FSP1+ الخلايا الليفية بطريقة تعتمد على الكصي / loxP، والذي يسمح للتصور السريع والسهل للخلايا في الأدمة منالجلد. على الرغم من أن هذا يجعل تصور الخلايا سهلة بسبب الفلورة المتأصلة فيها، فمن الممكن إجراء التصوير 2-فوتون دون الخلايا الموسومة وراثيا إذا كان المستخدم من ذوي الخبرة في تحديد التحول من البشرة إلى الأدمة. استخدام مستويات قوية من autofluorescence من الشعر على الجلد يمكن أن يكون مؤشرا مفيدا من حيث يركز المستخدم والاتجاه الذي يحتاج المرء إلى التحرك في للحصول على المستوى البؤري المطلوب. ومن الواضح أن هذا لن يعمل إلا إذا كانت الطائرة المحورية ذات الاهتمام في مكان قريب من الجلد ولن تكون خلية الاهتمام عميقة داخل الأنسجة.

تتبع مستوى بؤري طوال التجربة هو مثالي؛ ومع ذلك، بسبب التنفس من الحيوان الحي، فإنه يجعل من الصعب منع تحولات الإطار مع مرور الوقت عند دمج z-مكدسات في تجربة الفاصل الزمني. لاستكشاف هذه المشكلة، قد يفكر المستخدم في تقليل جودة التصوير عن طريق تقليل متوسط الخط عند استخدام الماسح الضوئي الرنانة وزيادة معدل العينة. وكما ذُكر سابقاً، يكاد يكون من المستحيل استخدام ماسح ضوئي تقليدي في تجربة تُدمج فيها كومة z والفاصل الزمني بسبب معدل العينة الأبطأ للماسح الضوئي.

قد يسمح تغيير مدة الحصول على الصورة للمستخدم بملاءمة احتياجات تجربته بشكل أفضل. في حين أن تصوير الحيوان لفترات طويلة من الزمن يسمح للمستخدم لجمع البيانات في جميع مراحل بطانة الرحم جزيء والتمثيل الغذائي، وتقصير الوقت لصورة أجزاء محددة فقط من العملية سوف تزيد من الكفاءة. فمن الممكن لصورة لفترة أقصر من الزمن (~ 1-15 دقيقة) لتحديد مرفق جزيء، فترة أطول من الوقت (~ 15-30 دقيقة) لتصور مستقبلات ligand بطانة الرحم30، والمدة الكاملة (~ 30-60 دقيقة) لتصور الخلوية التنشيط والتمثيل الغذائي المحتمل للجزيء. هذا جدّا يعتمد مهما على الجزيء يحقن والخلايا كان صوّيت (شكل 3).

ملاحظة هامة في البروتوكول التجريبي الموصوفة في هذه المخطوطة هو أننا حاليا، ونحن غير قادرين على صورة مناطق عينة متطابقة قبل وبعد الحقن. ويرجع ذلك إلى طبيعة الإعداد وطريقة تسليم المخدرات. ومع ذلك، نحن قادرون على تتبع الخلايا من وقت مبكر بعد الحقن لعدة ساعات. في حين أنه من المهم تتبع الخلايا الفردية طوال فترة التجربة، فإن التحولات الإقليمية في التنشيط الخلوي لها نفس القدر من الأهمية ويمكن التقاطها باستخدام هذه الطريقة. تصور أكثر من اثنين من الفلوروفورعلى مجهر متعدد الفوتونات في وقت واحد في الوقت الراهن من المستحيل نظرا للإعداد، وبالتالي، فإن الحد من هذه الطريقة هو أن المستخدمين قادرون فقط على صورة اثنين من الفلوروفور بدلا من غيرها من معدات التصوير حيث 4 أو أكثر فلوروفورس قادرة على تصور في وقت واحد31. بشكل عام، البروتوكول الموصوف محدد لأهداف مختبرنا ويوفر أداة مفيدة في تحديد التنشيط الخلوي حيث تفوق الإمكانيات التجريبية حدود البروتوكول.

توفر الطرق الموضحة في هذه المخطوطة عدداً من الفوائد على الأساليب الموجودة لتصور تنشيط الخلايا. الأول هو أن التجارب التي أجريت هنا هي في الجسم الحي، مما يسمح للتصور في الوقت الحقيقي من الخلايا ملزمة وحتى أخذ الجزيئات التي تدل مباشرة على التنشيط على وجه التحديد فيما يتعلق بالإهانة. وهذا يوفر مزايا على طرق أخرى مثل تقنيات التصوير بالخلايا الحية التقليدية لأننا قادرون على الحفاظ على بيئة الخلايا مما يقلل بشكل كبير من احتمال حدوث نتائج مربكة بسبب فرط الإثارة والاغتراب نشاط الخلايا المتعلقة بصدمة التفكك32. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام مجهر متعدد الفوتونات في هذا الإعداد التجريبي يقلل من معدل تبييض الصور الفلوروفوريس مما يسمح لجلسات التصوير المستمر وأطول بكثير وهو أمر مهم إذا طبق المستخدم هذه الطريقة على الدراسات التحقيق في معدل التمثيل الغذائي أو التنشيط على المدى الطويل33. وأخيرا، إذا كانت أنواع الخلايا من الاهتمام تكمن في عمق الأنسجة (> 100 مم) باستخدام المجهر متعدد الفوتونات ضروري للحصول على إشارة الأمثل34. عموما، إذا كان الهدف من تجربة المستخدم هو دراسة الانتهاب في الوقت الحقيقي وتفعيل الخلايا ردا على إهانة ثم استخدام مجهرية اثنين فوتون إلى جانب خطوط مراسل المعدلة وراثيا هو أكثر ملاءمة على غيرها من تقنيات الخيال التقليدية.

تسمح هذه التقنية للمستخدمين بإجراء دراسات طولية على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا فيما يتعلق بالتنشيط، والحركة، والتفاعلات من خلية إلى خلية. ميزة هذه التقنية هي أنه يسمح للمستخدمين لاستخدام الحيوانات الخاصة بهم الموسومة وراثيا الإبلاغ عنها واستبدال جزيء ذات علامات فلورية لتتناسب مع اهتماماتهم البحثية (على سبيل المثال، Tie2cre للخلايا الظهارية). لا يقتصر هذا البروتوكول على الإعداد المحدد الموضح في تجاربنا ويمكن تعديله بشكل كبير ليتناسب مع احتياجات أي مختبر يستخدم خطوط المراسل الوراثي والتصوير الجلدي 2 فوتون في دراساتهم. ونحن نخطط لاستخدام هذا النهج لتحديد تفعيل وتعيين الخلايا المناعية إلى موقع الإصابة بعد الصدمة الطرفية وتحديد ما هو مسار الوقت المحدد للتفعيل والتوظيف حتى نتمكن من فهم أفضل ما هو النهج للعلاجات الوقائية فيما يتعلق بأشكال مختلفة من الألم.

في الختام، قمنا بتطوير تقنية جديدة تسمح للمستخدمين بالتقاط الصور من LPS ذات العلامات الفلورية بواسطة tdTomato الموسومة الخلايا الليفية الجلدية التي تحمل علامات تعبر عن TLR4 باستخدام مجهري 2 فوتون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يتم اعتماد هذا العمل بواسطة منحNS096030 (MDB). كما نود أن نشكر مدير التصوير الأساسي فيد براكاش. كما نود أن نشكر مركز أوليمبوس ديسكفري/ مرفق التصوير الأساسي في يو تي دالاس على توفير المعدات والدعم

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS, 4 L Fisherbrand BP3994
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe Hamilton 80501
BD Precision Glide Needle 30G VWR 305106
Blue Pad Fisherbrand 1420665
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) Olympus FV30-FGR
Isoflurane, USP 250 mL Vedco 50989-150-15
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate Sigma-Aldrich F3665-1MG
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL VWR 20170-333
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN Olympus MPE-RS TWIN
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD Olympus XLPLN25XWMP2
Personal Lubricant Jelly (Gel) equate ZH727 2E F1
SGM-4 Stereotaxic Apparatus Narishige 16030
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  2. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
  3. Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
  4. Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
  5. Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
  6. Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
  7. Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
  8. Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
  9. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  10. Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
  11. Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
  12. Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  13. Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
  14. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  18. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  19. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  20. Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
  21. Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
  22. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  23. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
  24. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
  25. Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
  26. Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  27. Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
  28. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  29. Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
  30. Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
  31. Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
  32. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  33. Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
  34. Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).

Tags

الهندسة الحيوية العدد 149 التصوير متعدد الفوتونات مستقبلات مثل الرسوم 4 وراثية مراسل lipopolysaccharide في الجسم الحي
في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M.,… More

Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M., Andrew, A. T., Burton, M. D. In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin. J. Vis. Exp. (149), e59647, doi:10.3791/59647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter