Summary
Morfologiske ændringer forekommer i immun responderende fibroblast celler efter aktivering og fremme ændringer i cellulære rekruttering. Udnyttelse af 2-photon Imaging i forbindelse med en genetisk manipuleret fibroblast-specifikke protein 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muse linje og grøn fluorescently Tagged LPS-FITC, vi kan illustrere meget specifik optagelse af lipopolysaccharid i Dermal fibroblaster og morfologiske ændringer in vivo.
Abstract
Fibroblaster er mesenchymal celler, der ændrer deres morfologi ved aktivering, i sidste ende påvirker mikromiljøet i det væv, de er placeret i. Selv om traditionelle billeddannelsesteknikker er nyttige til at identificere protein interaktioner og morfologi i fast væv, er de ikke i stand til at give indsigt i, hvor hurtigt cellerne er i stand til at binde og optagelsen proteiner, og når de er aktiveret, hvordan deres morfologi ændringer i In vivo. I nærværende undersøgelse stiller vi 2 store spørgsmål: 1) Hvad er tidsforløbet af fibroblast aktivering via Toll-lignende receptor-4 (TLR4) og lipopolysaccharid (LPS) interaktion og 2) hvordan opfører disse celler sig, når de er aktiveret? Ved hjælp af 2-photon Imaging, har vi udviklet en ny teknik til at vurdere muligheden for LPS-FITC at binde til sin cognate receptor, TLR4, udtrykt på perifere fibroblaster i den genetiske reporter muse linje; FSP1cre; tdTomatoLOX-stop-LOX in vivo. Denne unikke tilgang giver forskerne mulighed for at skabe dybdegående, time-lapse videoer og/eller billeder af proteiner interagere med levende celler, der giver mulighed for at have en øget detaljeringsgrad i forståelsen af, hvordan proteiner kan ændre cellulære adfærd.
Introduction
Lipopolysaccharid (LPS) er et endotoksin, der findes i den ydre membran af gram-negative bakterier1. LPS har en høj bindingsaffinitet til den bompenge lignende receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor Complex2. TLR4 er en mønster anerkendelse receptor almindeligt forekommende på den ydre membran af en bred vifte af immunceller, mesenchymal celler, og en delmængde af sensoriske neuroner3,4,5. Aktivering af TLR4 udtrykt på immunceller fører til MyD88-afhængige og uafhængige anden Messenger-systemer, slutter med nuklear-faktor Kappa Beta (NFκB) translokation til kernen i cellen. Dette får prototypic immun cellen til at producere og frigive pro-inflammatoriske cytokiner såsom interleukin (IL) -1 β, IL-6, og TNF-α6. Men, hvordan andre celle-typer reagerer på TLR4 stimulation er ikke så klar. Fibroblaster har været impliceret i en bred vifte af patologier såsom kræft og cystisk fibrose og har for nylig vist sig at spille en rolle monocyt Chemo-tiltrækning og fremme betændelse7,8,9. Vores laboratorium er interesseret i rollen som fibroblaster i udviklingen af akutte og kroniske smerter, som tidlige beviser tyder på, at faktorer frigivet af fibroblaster (matrix metalloproteinaser (MMPs), vævs hæmmer af metalloproteinaser (TIMPs), og fibroblast vækstfaktorer (FGFs)) er involveret i neuropatiske smerter10.
Aktiverings tilstande af celler kan bestemmes af en række faktorer, der omfatter: induktion af umiddelbare tidlige gener, ændret protein udtryk, celle proliferation og morfologiske ændringer11,12,13. Der er mange teknikker, der findes til at besvare spørgsmål, vi måtte have om, hvordan aktivering af celler bidrager til patologier, men de har alle deres begrænsninger. Prototypical immunhistochemistry bruger fluorescently mærkede antistoffer til at mærke proteiner af interesse i fast væv, som kan være uspecifik og ofte kræver betydelig fejlfinding, før giver frugtbare resultater14. Western blotting er en nyttig teknik, når man sammenligner niveauer af protein ekspression i post mortem-væv; men den histologiske komponent mangler i denne teknik, og forskerne er ude af stand til at identificere eventuelle ændringer i morfologi15. RNA-SEQ tillader os at kvantificere tilstedeværelsen af Messenger RNA i en prøve, som i mange tilfælde giver indsigtsfulde data; men kløften mellem transkriptionen og oversættelsen gør det vanskeligt at have tidsmæssig opløsning efter en stimulus16. Confocal Imaging er nyttigt til at bestemme ekspression og samlokalisering af proteiner, der findes i et tværsnit af væv17. Ofte er dette ikke repræsentativt for hele vævsprøven. I modsætning hertil giver multiphoton mikroskoper brugerne mulighed for at billede omkring 1 mm dybt ind i en prøve, hvilket skaber en omfattende tredimensionel repræsentation18. Derfor vælger vi at fokusere på in vivo, 2-photon Imaging Preps, da data indsamlet fra disse eksperimenter er mere direkte relatable til den meget plastik og indbyrdes forbundne mikromiljø af levende væv.
En fordel ved at studere protein-receptor interaktioner in vivo er, at vi klart kan fange, hvordan cellerne reagerer på en stimulus, real-time, i deres indfødte miljø uden den skadelige og uforudsigelige indflydelse af post mortem-vævs ekstraktion19. Derudover kan longitudinale undersøgelser udføres for at vurdere cellulær plasticitet og priming, der kan opstå på grund af aktivering. Ved hjælp af 2-photon Imaging bevarer vi integriteten af det mikromiljø, der er til stede, når der anvendes en ekstern stimulus. Denne protokol giver en måde at identificere optagelsen af molekyler i fibroblaster efter perifer injektion af fluorescently Tagged LPS i løbet af flere timer in vivo og rollen som TLR4 i fibroblast aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af University of Texas i Dallas institutionel dyrepleje og brug udvalg og var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer. Alle eksperimenter blev udført ved hjælp af 8-12-ugers gamle mandlige og kvindelige mus opdrættet in-House på en C57BL/6 baggrund. Transgene mus med CRE-rekombinase drevet af den fibroblast-specifikke protein-1 promotor blev købt kommercielt (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- og krydsede med tdtomatoLOX-stop-LOX mus, også købt kommercielt ( Jackson, 007914) og (FSP1cre)+/- ; tdTomatoLOX-stop-LOX og FSP1cre-/-; tdTomatoLOX-stop-LOX -mus blev opdrættet in-House på en C57BL/6 baggrund (figur 1a, B, C). Fibroblast-specifik protein 1 er et endogene protein, der udtrykkes på ca. 72% fibroblast og repræsenterer en effektiv CRE-driver i dermal væv20. Mus var gruppe huse og givet ad libitum adgang til mad og vand. Rumtemperaturen blev opretholdt ved 21 ± 2 °C. Mens vi brugte C57BL/6 krydsede mandlige og kvindelige mus på 8-12 uger, vi tror ikke, at alder, køn, eller genetiske baggrund er nødvendige krav til at køre multiphoton eksperimenter. Mus blev dybt bedøvet umiddelbart efter eksperimentet og euthanized.
1. forberedelse af lægemidler
- Forbered en 5 μg/20 μL opløsning af lipopolysaccharid-FITC (Se tabel over materialer) i STERIL 1x PBS (pH 7,4). Vortex stamopløsningen ved medium intensitet i minimalt 30 sekunder for at sikre homogen blanding for en lige koncentration i hele opløsningen før pipettering (LPS er et glutinøs molekyle).
Bemærk: Anbring ikke LPS i en glasbeholder, hvis det er muligt, brug siliconiserede mikrocentrifugerør. Opbevares på is indtil brug.
2. opsætning af Imaging
- Konfigurer multiphoton-systemet (Se tabel over materialer) til billedbehandling med to farver. Dette kræver brug af to separate excitation lasere (Se tabel over materialer), en gfp/RFP filter Cube sæt (Se materialer tabel), og en 25x (1,05 na) vand-nedsænkning mål (Se tabel over materialer).
Bemærk: brugere kan ændre disse indstillinger for bedre at passe til alternative opsætninger og multiphoton mikroskop kapaciteter. Det er de parametre, der anvendes i forsøgsprotokollen. Se tabel over materialer for specifikke detaljer. - Anbring et stereotaxisk apparat (Se tabel over materialer) på scenen af multifoton mikroskop. Tilslut dette til en anæstesi levering maskine (Se tabel over materialer) for at sikre dyrene bedøvet i løbet af forsøget. Placer et stykke mat sort papir på overfladen af apparatet som et forbindelsespunkt for musen pote.
- Vælg resonans scanneren med et fast scanningsområde på 512 μm x 512 μm.
Bemærk: Udfør ikke forsøgene i denne protokol ved hjælp af en galvanometer scanner. På grund af den langsommere sample rate, vil der være forvrængning i z-stack time-lapse videoer på grund af respiration af dyret, der er uundgåelig. - Tune de to excitation lasere til excitation bølgelængder af gfp og RFP, 930 nm og 1100 nm henholdsvis, og dirigere den lette vej af begge excitation lasere til det enkelte mål ved hjælp af en koldtlysreflektorlamper spejl af 690-1050 nm tillader 930 nm-tunet excitation laser skal afspejles i hoved scanneren og den 1.100 nm-indstillede laser til at passere direkte ind i hoved scanneren (figur 2).
Bemærk: det er muligt at ændre disse excitation bølgelængder afhængigt af brugerens setup. - Indstil laser styrken i FITC til 5% og GFP til 20%.
Bemærk: denne opsætning giver et optimalt signal-støj-forhold (SNR) i disse eksperimenter. Detektér signal via multi-alkali-foto multiplikations slanger (PMTs); GaAsP-detektorer kan dog anvendes i stedet for meget følsomme eksperimenter. - Forbered rummet til billeddannelse under mørke forhold uden omstrejfende lys.
3. in vivo-billeddannelse
- Placer musen i induktions kammeret af anæstesi delivery system og bruge 5% isofluran (Se tabel over materialer) på en 2 L/min flowhastighed af ilt til at placere musen under dyb anæstesi.
Bemærk: det anbefales kraftigt at bære alle relevante PV under forsøget.- Overfør musen til stereotaksisk apparatet med adgang til en næse kegle for at opretholde anæstesi gennem hele eksperimentet. Reducer isofluran til 1,5%-2%, og hold strømningshastigheden konstant.
-
Fastgør bagpoten til et stykke sort papir med sort tape på områder, både proksimale og distale til det område af interesse (Dette reducerer virkningerne af musen respiration på billedkvalitet), at sikre plantar overflade af pote er uhindret og vender til målet. Sørg for, at musens hoved er stabilt i den næse kegle, der er fastgjort til apparatet.
Bemærk: Overvåg musen for eventuelle tegn på angst eller dehydrering i hele eksperimentet og Juster isofluran i overensstemmelse hermed.
- Placer en generøs mængde af sterile vandbaseret smøremiddel (gel, se tabel over materialer) på plantar overflade af pote og røre målet til det for at skabe en kolonne af væske mellem pote og målet.
- Brug FITC excitation Light til at fokusere ind i dermal lag af pote. Sørg for, at tdTomato-mærkede fibroblaster visualiseres, før du fortsætter (dette trin er vigtigt for at bestemme det korrekte brændplan til billedet).
Bemærk: den dermal lag af pote er omkring 100-150 μm i pote. - Billede det område af celler, der ligger lige under den plantar overflade af bagpoten med både 930 nm og 1100 nm-tunede lasere og erhverve en 15-minutters tid-lapse på omkring 5-10 z-skiver på ca. 1 μm per skive at etablere en repræsentation af miljøet forud for injektion med LPS-FITC.
- Udfør en intraplantar injektion af 5 μg/20 μL LPS-FITC på musens bagpote ved hjælp af en 25 μL glas Hamilton sprøjte (Se tabel over materialer) og 30g nål (Se tabel over materialer), at passe på ikke at forstyrre placeringen af pote.
- Billede et område af celler placeret lige under den plantar overflade af bagpoten med både 930 nm og 1100 nm-tunet lasere og erhverve en 60-120 minut tid-lapse på omkring 5-10 z-skiver på ca. 1 μm per skive for at identificere optagelsen af LPS-FITC af celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I første omgang injicerede vi LPS-FITC i bagpoten af vilde-type mus for at visualisere optagelsen af LPS-FITC i alle celletyper til stede i dermal lag af pote. Efter at have observeret et utal af celler i dermal lag af bagpote optagelsen fluorescently-Tagged LPS i en vildtype mus (video figur 1,2), vi forsøgte at specifikt målrette fibroblaster, da de er et primært fokus i vores forskning. Før billeddannelse poterne af dyr injiceres med LPS-FITC vi ønskede at være klar over, at der ikke er nogen iboende fluorescens af celler i dermal lag. Dette er for at sikre, at efter injektion, de billeder, vi tager, er sande interaktioner af celler med fluorescently-Tagged LPS og ikke nogen billeddannelse artefakter (video figur 3, 4). Efter LPS-FITC injektion, kun FSP1+ fibroblaster udtrykker TLR4 binde og Optag det injicerede protein, med en høj grad af samlokalisering med tdTomato tag udtrykt af disse celler (video figur 5). I modsætning hertil er mus, der har TLR4 slået ud af hele kroppen (TLR4ko) ikke binde og optagelse LPS efter injektion. Som tydeligt i videoen, silhuetter af celler er synlige efter LPS-FITC injektion, som indikerer, at stoffet dispergeringsmiddel i interstitiel væske omkring celler, men er faktisk ikke bundet af en receptor (video figur 6).
For at opsummere vores resultater, viser vi in vivo, at efter injektion af LPS-FITC, i en FSP1cre; tdTomatoLOX-stop-LOX celle-specifikke reaktiverede dyr kun fibroblaster interagere med og optagelse LPS. I modsætning hertil binder helkrops knockouts af TLR4 ikke og optages LPS-FITC efter injektion.
Figur 1 . tdtomato udtrykkes kun i FSP1+ fibroblaster på en CRE-afhængig måde. A) FSP1cre Transgene mus opdrættet på en C57BL/6 baggrund krydses med tdTomato mus opdrættet på en C57BL/6 baggrund for at generere mus udtrykte TDTOMATO i FSP1+ fibroblast i en CRE-afhængige mode. B) repræsentative PCR-resultater, som skildrer både positive og negative FSP1cre-mus, som udtrykker tdTomato. C) repræsentativt pictograph af Dermal fibroblaster i ekstracellulært rum placeret i muse poten. FSP1+ mus udtrykker et rødt fluorescerende protein kun i fibroblaster, mens FSP1- mus ikke gør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Lys sti af to-farvet 2-foton mikroskop. Skildringen af den lysvej, der er sat op til 2-farve 2-foton eksperiment oprettet. Laser 1 er indstillet til 930 nm for at begejstre FITC-konjugeret LPS og laser 2 er indstillet til 1100 nm for at begejstre tdTomato fundet i fibroblaster. Excitation Light fra laser 1 afspejles af koldtlysreflektorlamper spejl (690-1050 nm) mens excitation lys fra laser 2 passerer igennem til hoved scanneren. Excitation lys fra begge lasere afspejles af et sæt spejle til et andet koldtlysreflektorlamper spejl (650 nm) tillader excitation lys til at passere gennem målet og ind i vævet at ophidsende fluorophorerne. Lys udsendes fra de spændte fluorophorer og er fanget af den 25x mål og afspejles af koldtlysreflektorlamper spejl (650) til multi-alkali Photomultiplier rør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Eksperimentel flow diagram af 2-photon Microscopy. Mus er bedøvet og immobiliseret ved hjælp af en low-flow anæstesi system og stereotaksisk apparater. Den plantar overflade af pote står mål og er afbildet i 15 minutter. Intraplantar injektion af 5 μg/20 μl LPS-FITC udføres på den bedøvede mus og pote derefter afbildet for en varighed af tid, der er nødvendige for målet med forsøget. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video figur 1. Z-stack videoer af LPS-FITC optagelse i celler i vild type C57BL/6 mus. Z-stak video af dermal lag af bagpote af en C57BL/6 mus før LPS-FITC injektion. Plantar aspekt af en vildtype mus pote blev afbildet i 15 minutter før injektion med LPS-FITC til kontrol for auto luorescens produceret i gfp kanalen. Der er lidt at ingen signal i GFP kanalen indikerer ingen autofluorescens. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video figur 2. Z-stak video af dermal lag af bagpote af en C57BL/6 mus efter LPS-FITC injektion. Plantar aspekt af en vildtype mus pote blev afbildet for 1,5 timer post-LPS-FITC injektion for at visualisere optagelsen af LPS-FITC af alle celler, der udtrykker TLR4. Som tydeligt i videoen, et væld af celler binde og optagelse LPS-FITC hele forløbet af eksperimentet. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video figur 3. Z-stak video af dermal lag af bagpoten af en FSP1cre; tdTomato mus før LPS-FITC injektion. Plantar aspekt af en FSP1cre; tdtomato Mouse Paw blev afbildet i 15 minutter før injektion med LPS-FITC for at styre til autofluorescens, der produceres i gfp-kanalen. Der er lidt at ingen signal i GFP kanalen indikerer ingen autofluorescens. tdTomato-positive fibroblaster visualiseret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video figur 4. Z-stak video af dermal lag af bagpote af en TLR4ko mus før LPS-FITC injektion. Plantar aspektet af TLR4ko Mouse Paw blev afbildet i 15 minutter før injektion med LPS-FITC for at styre til autofluorescens, der produceres i gfp-kanalen. Der er lidt at ingen signal i GFP kanalen indikerer ingen autofluorescens. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video figur 5. Z-stak video af dermal lag af bagpoten af en FSP1cre; tdTomato mus efter LPS-FITC injektion. Plantar aspekt af en FSP1cre; tdtomato Mouse Paw blev afbildet i 1,5 timer post-LPS-FITC injektion for at visualisere optagelsen af LPS-FITC af tdtomato-positive fibroblaster, som udtrykker TLR4. Som det fremgår af videoen, ses meget specifik optagelse af LPS-FITC via TLR4 udtrykt på tdTomato-positive fibroblaster. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video figur 6. Z-stak video af dermal lag af bagpote af en TLR4ko mus efter LPS-FITC injektion. Plantar aspekt af en TLR4ko mus pote blev afbildet for 1,5 timer post-LPS-FITC injektion at visualisere, hvis optagelsen af LPS-FITC af celler i en hel-krop knockout af TLR4 er muligt. Som tydeligt i videoen, ingen optagelse af LPS-FITC ses af cellen i dermal lag af bagpote. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formentlig de vigtigste trin i in vivo 2-photon Imaging er: 1) at vælge den rigtige genetiske reporter mus og fluorescently-mærkede protein til multi-foton setup og eksperimentelle behov21,22; 2) Imaging den korrekte fokal plan for at have en nøjagtig repræsentation af populationen af celler i vævet23; 3) minimering af bevægelse på grund af et uretmæssigt immobiliseret dyr24; og 4) vælge, hvornår data skal analyseres kvalitativt vs. kvantitativt25,26,27. At sikre, at disse punkter bliver rettet, inden et eksperiment påbegyndes, vil give viden til at indsamle data, der både er reproducerbare og videnskabeligt stringente.
En vigtig overvejelse i protokollen er korrekt immobilisering af regionen til at blive inddelt. Respiration fra dyret forårsager minut skift i brændplanet under billeddannelse, og når der udføres z-stack og time-lapse video, dette forårsager betydelig forvrængning i videoen og kan have en negativ indflydelse på kvaliteten af de producerede data. Sikre, at pote er korrekt immobiliseret vil tillade vellykket billeddannelse af pote uden afbrydelse fra respiration. Hertil kommer, at kende lokalisering af celler i forsøget er et kritisk skridt i at identificere den korrekte brændplan til at visualisere. Fordi vi valgte at fokusere på Dermal fibroblaster, vi behøver kun at billedet en relativt kort afstand til pote at være i stand til at visualisere vores celletyper af interesse (~ 100-150 μm). I andre eksperimenter, er det vigtigt at overveje mulighederne i mikroskop og mål man bruger, fordi udførelsen af et eksperiment til billed celler dybt inde i vævet kan være udfordrende at umuligt givet brugerne oprettet. Endelig, at vælge, hvordan man nærmer sig dataanalyse er en vigtig overvejelse i de sidste trin af eksperimentet. Her viser vi, at fibroblaster udtrykker TLR4 er i stand til at optages og binde fluorescently-Tagged LPS, som er tydeligt ved den robuste samlokalisering af grøn (LPS) og rød (tdTomato udtrykt ved fibroblaster) i videoerne. Selvom der ikke foretages nogen kvantitativ billedanalyse i denne protokol, kan en bruger fortolke data, som er indsamlet fra denne protokol, på mange forskellige måder. Den første er en simpel Co-lokaliserings analyse ved hjælp af open source-software til at måle intensiteten af to forskellige farver i en given pixel28. Dette gør det muligt for brugeren at identificere, om to spændte fluorophorer detekteres på en given pixel i et erhvervet billede eller video, og hvor meget af dette overlap der er i et givet rum. Dette er nyttigt til at identificere, hvis de celler af interesse interagerer med en vis kapacitet med det injicerede molekyle. En alternativ metode til kvantitativ analyse er fluorescens intensitet29. Brugeren er i stand til at indsamle oplysninger om intensiteten af et givet signal i en celle af interesse. Data indsamlet fra disse analyser kan indikere, hvordan celler kan optages forskellige mængder af et molekyle i forhold til andre. Disse metoder til dataanalyse er et eksempel på, hvordan brugeren kan søge at analysere data indsamlet fra et eksperiment svarende til den, der udføres i denne protokol.
Vores genetiske modeller giver os mulighed for selektivt fluorescently tag (tdTomato) FSP1+ fibroblaster i en CRE/loxp-afhængige måde, som giver mulighed for hurtig og nem visualisering af celler i dermis af huden. Selv om dette gør det nemt at visualisere celler på grund af deres iboende fluorescens, er det muligt at udføre 2-foton Imaging uden genetisk mærkede celler, hvis brugeren har erfaring med at bestemme skiftet fra epidermis til dermis. Ved hjælp af de robuste niveauer af autofluorescens fra håret på huden kan være en nyttig indikator for, hvor brugeren er fokusering og retningen man skal bevæge sig ind for at opnå det ønskede brændfly. Dette vil naturligvis kun fungere, hvis brændplanet af interesse i tæt på huden og vil ikke cellen af interesse er dybt inde i vævet.
Det er ideelt at spore et brændfly gennem hele eksperimentet. men på grund af respirationen af et levende dyr, det gør det vanskeligt at forhindre ramme Skift over tid, når indarbejde z-stakke i en time-lapse eksperiment. For at kunne foretage fejlfinding af dette problem kan brugeren overveje at reducere billedkvaliteten ved at formindske linje gennemsnit ved brug af en resonans scanner og øge prøvehastigheden. Som tidligere nævnt, er det næsten umuligt at bruge en traditionel galvanometer scanner i et eksperiment, hvor en z-stak og time-lapse er indarbejdet på grund af den langsommere prøvehastighed af scanneren.
Ændring af varigheden af billed erhvervelse kan gøre det muligt for brugeren at bedre passer til behovene i deres eksperiment. Mens billeddannelse dyret i længere tid giver brugeren mulighed for at indsamle data i alle trin af molekyle endokytose og metabolisme, forkorte tiden til billedet kun specifikke dele af processen vil øge effektiviteten. Det er muligt at billedet i en kortere periode (~ 1-15 minutter) at identificere molekyle vedhæftet fil, en længere periode (~ 15-30 minutter) at visualisere receptor-ligand endocytose30, og den fulde varighed (~ 30-60 minutter) at visualisere cellulære aktivering og potentiel metabolisme af molekylet. Dette er meget afhængig dog på molekyle injiceres og cellerne blev visualiseret (figur 3).
En vigtig bemærkning i forsøgsprotokollen, der er beskrevet i dette manuskript, er, at vi i øjeblikket ikke kan afbilde identiske prøveområder før og efter injektionen. Dette skyldes karakteren af opsætningen og metoden til levering af lægemidler. Men vi er i stand til at spore celler fra en tid tidligt efter injektion i flere timer. Selv om det er vigtigt at holde styr på individuelle celler i løbet af eksperimentet, er regionale forskydninger i cellulær aktivering lige vigtige og kan fanges ved hjælp af denne metode. Visualisering af mere end to fluorophorer på et multifoton mikroskop samtidigt i øjeblikket er umuligt i betragtning af opsætningen, derfor er en begrænsning af denne metode, at brugerne kun kan afbilde to fluorophorer i modsætning til andet Billedbehandlingsudstyr, hvor 4 eller flere fluorophorer er i stand til at blive visualiseret samtidigt31. Samlet set er den beskrevne protokol specifik for målene i vores laboratorium og giver et nyttigt værktøj til at identificere cellulær aktivering, hvor de eksperimentelle muligheder opvejer begrænsningerne i protokollen.
De metoder, der er beskrevet i dette manuskript, giver en række fordele i forhold til eksisterende metoder til at visualisere aktivering af celler. Den første er, at de eksperimenter, der udføres her er in vivo, giver mulighed for real-time visualisering af celler bindende og op at tage molekyler, som er direkte indikation af aktivering specifikt med hensyn til en fornærmelse. Dette giver fordele i forhold til andre metoder såsom traditionelle Live-Cell Imaging teknikker, fordi vi er i stand til at bevare miljøet i cellerne, som væsentligt mindsker sandsynligheden for at forstyrrende resultater på grund af hyperexcitabilitet og ektopisk aktivitet af celler relateret til traume af dissociation32. Desuden nedsætter brugen af et multifoton mikroskop i denne eksperimentelle indstilling den hastighed, hvormed fluorophores foto blegemidler giver mulighed for kontinuerlig og signifikant længere billedbehandling sessioner, hvilket er vigtigt, hvis brugeren anvender denne metode til undersøgelser undersøge hastigheden af metabolisme eller langsigtet aktivering33. Endelig, hvis cellen typer af interesse bor dybt inde i vævet (> 100 mm) ved hjælp af en multifoton mikroskop er nødvendig for at opnå optimale signal34. Samlet set, hvis målet med en brugers eksperiment er at studere real-time optagelse og aktivering af celler som reaktion på en fornærmelse derefter ved hjælp af to-photon mikroskopi kombineret med transgene reporter linjer er mere egnet over andre konventionelle forestille sig teknikker.
Denne teknik giver brugerne mulighed for at udføre longitudinel undersøgelser på en bred vifte af celletyper med hensyn til aktivering, motilitet, og celle-til-celle interaktioner. Fordelen ved denne teknik er, at det giver mulighed for brugere at bruge deres egne genetisk mærkede rapporterede dyr og erstatte fluorescently-mærkede molekyle, der passer til deres forskningsinteresser (f. eks Tie2cre for epiteliale celler). Denne protokol er ikke begrænset til den specifikke opsætning vist i vores eksperimenter og kan være meget modificeret til at passe til behovene i ethvert laboratorium, der udnytter genetiske reporter linjer og 2-photon dermal billeddannelse i deres studier. Vi planlægger at bruge denne fremgangsmåde til at identificere aktivering og rekruttering af immunceller til skades stedet efter perifere traumer og afgøre, hvad det specifikke tidsforløb for aktivering og rekruttering er, så vi bedre kan forstå, hvad den bedste tilgang er for forebyggende Therapeutics er med hensyn til forskellige former for smerte.
Afslutningsvis har vi udviklet en ny teknik, der giver brugerne mulighed for at billedoptagelse af fluorescently-Tagged LPS af tdTomato-Tagged Dermal fibroblaster udtrykker TLR4 ved hjælp af 2-photon mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af Grant NS096030 (MDB). Vi vil også gerne takke billedbehandlings Core Manager ved Prakash. Vi vil også gerne takke Olympus Discovery Center/Imaging Core Facility hos UT Dallas for at levere udstyr og support
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
