Summary
激活后免疫反应性成纤维细胞发生形态变化,促进细胞招募的改变。结合基因工程的纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)-cre,利用2光子成像;tdTomato 絮凝停止絮凝(TB/TB)小鼠线和绿色荧光标记的脂多糖-FITC,我们可以说明在皮下成纤维细胞和体内形态变化中脂多糖的高度特异性吸收。
Abstract
纤维细胞是中位细胞,在激活时改变其形态,最终影响它们所在的组织的微观环境。虽然传统的成像技术在识别固定组织中的蛋白质相互作用和形态方面很有用,但它们无法洞察细胞能够以多快的速度结合和摄取蛋白质,一旦激活了细胞的形态变化。体内。在本研究中,我们提出两个主要问题:1) 通过类似收费的受体-4(TLR4)和脂多糖(LPS)相互作用进行成纤维细胞活化的时间过程是什么？2) 这些细胞一旦激活后如何运作？利用2光子成像技术,我们开发了一种新技术,以评估LPS-FITC与基因报告小鼠线中外周成纤维细胞表达的共生受体TLR4结合的能力;FSP1cre;在体内的tdTomatolox-停止-洛克斯。这种独特的方法使研究人员能够创建深入、延时的视频和/或蛋白质与活细胞相互作用的图片,从而使一个人在了解蛋白质如何改变细胞行为方面拥有更高的粒度。
Introduction
脂多糖(LPS)是在克阴性细菌1的外膜中发现的内毒素。LPS对收费受体4(TLR4)/CD14/MD2受体复合物2具有高结合亲和力。TLR4是一种模式识别受体,常见于广泛免疫细胞、中位细胞和感觉神经元3、4、5的外膜。在免疫细胞上表达的TLR4的激活导致MyD88依赖和独立的第二信使系统,最后以核因子卡帕β(NF+B)易位到细胞核结束。这导致原体免疫细胞产生和释放亲炎细胞因子,如白细胞介素(IL)-1+,IL-6和TNF-+6。然而,其他细胞类型对TLR4刺激的反应并不清楚。纤维细胞已涉及广泛的病理学,如癌症和囊性纤维化,最近已被证明起一种单细胞化疗吸引和促进炎症7,8,9的作用。 我们的实验室对成纤维细胞在急性和慢性疼痛发展中的作用感兴趣,因为早期证据表明,纤维细胞(基质金属蛋白酶(MmPs)、金属蛋白酶(TimPs)组织抑制剂和成纤维细胞释放的因素生长因子(FF)涉及神经病痛10。
细胞的活化状态可以由多种因素决定,包括:诱导立即早期基因,改变蛋白质表达,细胞增殖和形态变化11,12,13。有许多技术存在,以回答我们可能有问题,细胞的激活如何有助于病理,但他们都有其局限性。原型免疫组织化学使用荧光标记抗体在固定组织中标记感兴趣的蛋白质,这些蛋白质可能是非特异性的,并且往往需要大量的故障排除,才能产生丰硕的成果14。西方印迹是比较死后组织蛋白质表达水平的有用技术;然而,组织学成分缺乏这种技术,研究人员无法识别形态学的任何变化15。RNA-Seq使我们能够量化样本中信使RNA的存在,在许多情况下,该样品会产生有见地的数据;然而,转录和翻译之间的差距使得在刺激16之后很难进行时间解析。共聚焦成像有助于确定存在于组织横截面的蛋白质的表达和共定位17。通常,这不能代表整个组织样本。相比之下,多光子显微镜允许用户将大约1毫米深的图像成像到样品中,从而形成全面的三维表示。因此,我们选择专注于体内2光子成像制备,因为这些实验收集的数据更直接地与生物组织高度可塑性和相互连接的微环境相对应。
研究体内蛋白质-受体相互作用的一个优点是,我们可以清楚地捕捉细胞在原生环境中对刺激的反应,没有死后组织提取的有害和不可预知的影响。此外,可以进行纵向研究,以评估由于激活而可能发生的细胞可塑性和充注性。 使用2光子成像,我们保留了应用外部刺激时微环境的完整性。该协议提供了一种方法,以识别在体内几个小时内注射荧光标记LPS后成纤维细胞中分子的摄取量,以及TLR4在成纤维细胞活化中的作用。
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Protocol
动物程序由德克萨斯大学达拉斯机构动物护理和使用委员会批准,符合国家卫生研究院的指导方针。 所有实验均使用在C57BL/6背景下在内部培育的8-12周大雄性小鼠和雌性小鼠进行。由成纤维细胞特异性蛋白-1启动剂驱动的具有cre-重组酶的转基因小鼠被商业购买(Jackson,012641) (FSP1cre)+/-并与tdTomatolox-停止-lox小鼠交叉,也购买商业(杰克逊, 007914) 和 (FSP1cre)+/- ;tdTomatolox-停止-洛克斯和FSP1cre-/- ;tdTomatolox-停止-洛克斯小鼠在内部在C57BL/6背景下繁殖(图1A,B,C)。纤维细胞特异性蛋白1是一种内源性蛋白质,在大约72%的成纤维细胞上表达,代表皮肤组织20的有效克因子。老鼠被组住,并给予食物和水。室温维持在21~2°C。虽然我们在8-12周使用C57BL/6交叉雄性小鼠和雌性小鼠,但我们并不认为年龄、性别或遗传背景是进行多光子实验的必要要求。实验后立即对老鼠进行深度麻醉,并安乐死。
1. 药物制剂
- 在无菌 1x PBS (pH 7.4) 中制备 5 μg/20 μL 脂多糖-FITC 溶液(参见材料表)。涡流在中等强度的库存溶液中,至少30秒,以确保均匀混合,在整个移液前,在整个溶液中具有同等浓度(LPS是谷类分子)。
注:请勿将LPS放入玻璃容器中,如果可能,请使用硅化微离心管。保持冰上,直到使用。
2. 成像设置
- 设置多光子系统(见材料表)进行双色成像。这需要使用两个单独的激励激光器(参见材料表)、GFP/RFP 滤波器立方体集(参见材料表)和 25x (1.05 NA) 水浸物(参见材料表)。
注:用户可以更改这些设置,以更好地适应替代设置和多光子显微镜功能。这些是实验协议中使用的参数。有关具体细节,请参阅材料表。 - 在多光子显微镜的舞台上放置一个立体仪器(见材料表)。将其连接到麻醉输送机(参见材料表),以确保动物在实验期间被麻醉。将一张哑光黑纸放在仪器表面,作为鼠标爪的连接点。
- 选择固定扫描面积为 512 μm x 512 μm 的谐振扫描仪。
注: 请勿使用电流计扫描仪执行此协议中的实验。由于采样速度较慢,z 堆栈延时视频将失真,因为动物的呼吸是不可避免的。 - 将两个激励激光器分别调谐到 GFP 和 RFP 的激发波长、930 nm 和 1100 nm,并使用 690-1,050 nm 的二色镜将两个激励激光器的光路径定向到单个目标,允许 930 nm 调谐激励激光器被反射到主扫描仪和1,100纳米调谐的激光直接进入主扫描仪(图2)。
注: 可根据用户的设置更改这些激发波长。 - 将 FITC 的激光功率设置为 5%,将 GFP 设置为 20%。
注:此设置在这些实验中提供了最佳信噪比 (SNR)。通过多碱光电倍增管(PMTs)检测信号;然而,GaAsP探测器可能用于非常高的灵敏度实验。 - 在没有杂散光的黑暗条件下准备成像室。
3. 体内成像
- 将鼠标放入麻醉输送系统的感应室,以2升/分钟氧气流速使用5%的胶原(见材料表),将鼠标置于深层麻醉状态。
注意:强烈建议在实验期间佩戴所有合适的 PPE。- 将鼠标转移到立体设备,并进入鼻锥,在整个实验过程中保持麻醉。将分路胶减小到1.5%-2%,并保持流速不变。
-
将后爪牢固地贴在一张黑色纸上,黑色胶带贴在接近和远近的感兴趣区域(这减少了鼠标呼吸对图像质量的影响),确保爪子的平面表面畅通无阻且朝面朝着目标。确保鼠标头在连接到设备的鼻锥内保持稳定。
注:在整个实验中监测鼠标是否有任何窘迫或脱水的迹象,并相应地调整偶路。
- 在爪子的木板表面放置大量无菌水性润滑剂(凝胶,见材料表),并触摸其目标,以便在爪子和目标之间形成一列液体。
- 使用 FITC 激发光聚焦到爪子的皮层。在继续之前,确保 tdTomato 标记的成纤维细胞可视化(此步骤对于确定正确的图像焦平面非常重要)。
注:爪子的皮层在爪子中约为100-150 μm。 - 使用 930 nm 和 1100 nm 调谐激光器对位于后爪平面下方的电池区域进行成像,并获取约 5-10 z 切片的 15 分钟延时,每个切片约 1 μm,以建立环境之前的环境表示形式与 LPS-FITC 一起注射。
- 使用25μL玻璃汉密尔顿注射器(见材料表)和30G针(见材料表)在小鼠的后爪上进行5μg/20μL LPS-FITC的内注射,注意不要干扰爪子的位置。
- 使用 930 nm 和 1100 nm 调谐激光器对位于后爪平面正下方的细胞区域进行成像,并获取 60-120 分钟的延时,大约 5-10 z 片,每片约 1 μm,以识别细胞对 LPS-FITC 的接受。
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Representative Results
最初,我们向野生型小鼠的后爪注射LPS-FITC,以可视化LPS-FITC在爪子皮肤层中存在的所有细胞类型的接受。在野生型小鼠(视频图1,图2)中观察了后爪取影LPS的皮肤层中无数的细胞(视频图1,2),我们试图专门针对成纤维细胞,因为它们是我们研究的主要焦点。在成像注射LPS-FITC的动物的爪子之前,我们希望清楚,皮肤层中没有细胞固有的荧光。这是为了确保注射后,我们拍摄的图像是细胞与荧光标记的LPS的真实相互作用,而不是任何成像伪像(视频图3,4)。LPS-FITC注射后,只有FSP1+成纤维细胞表达TLR4结合和接受注射的蛋白质,与这些细胞表达的tdTomato标记进行高水平的共定位(视频图5)。相反,有TLR4敲出整个身体(TLR4 KO)的小鼠在注射后不会结合和接受LPS。正如视频中所示,LPS-FIT注射后可以看到细胞的轮廓,这表明药物分散在细胞周围的间质流体中,但实际上并没有被受体束缚(视频图6)。
为了总结我们的结果,我们在体内显示,注射LPS-FITC后,在FSP1cre中;tdTomatolox-停止-洛克细胞特异性重新激活的动物只有成纤维细胞与LPS相互作用和接受LPS。相比之下,TLR4的全身敲除在注射后不会结合和采用LPS-FITC。
图 1.tdTomato 仅在 FSP1中表示 – 纤维细胞在融合的礼仪中。A) FSP1cre 转基因小鼠在 C57BL/6 背景上与在 C57BL/6 背景上培育的 tdTomato 小鼠交叉,以 FSP1 和成纤维细胞的方式生成以 FSP1表示的小鼠 tdTomato。B) 代表性PCR结果描绘了表达tdTomato的正负FSP1cre小鼠。C) 位于小鼠爪子的细胞外空间中真皮成纤维细胞的代表性象形图。FSP1–小鼠仅在成纤维细胞中表达红色荧光蛋白,而 FSP1-小鼠不表达。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.双色双光子显微镜的光路径。为 2 色 2 光子实验设置的光路径的描绘。激光 1 被调谐到 930 nm 以激发 FITC 结合的 LPS,激光 2 调谐到 1100 nm 以激发成纤维细胞中的 tdTomato。激光 1 的激发光由二色镜 (690-1050 nm) 反射,而激光 2 的激发光通过主扫描仪。两个激光器的激发光由一组反射镜反射至第二双色镜(650 nm),允许激发光通过目标并进入组织以激发荧光。光从激发的荧光道中发射,由25倍的物镜捕获,并通过二色镜(650)反射到多碱光倍增管。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.2 光子显微镜的实验流程图。使用低流量麻醉系统和立体麻醉装置对小鼠进行麻醉和固定。爪子的平面朝向目标,并成像15分钟。在麻醉小鼠上进行5μg/20μL LPS-FITC的平面内注射,然后对爪子进行成像,持续时间为实验目标。请点击此处查看此图的较大版本。
视频图 1。Z-堆栈视频LPS-FITC在野生类型C57BL/6小鼠的细胞中接受。LPS-FITC 注射前 C57BL/6 鼠标后爪皮肤层的 Z 堆叠视频。野生型小鼠爪的平面在注射LPS-FITC前15分钟被成像,以控制GFP通道产生的自荧光。GFP 通道中几乎没有信号指示没有自荧光。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频图 2。LPS-FITC 注射后C57BL/6鼠标后爪皮肤层的Z-堆叠视频。野生型小鼠爪的平面方面在LPS-FITC注射后被成像了1.5小时,以可视化所有表达TLR4的细胞对LPS-FITC的接受。正如视频中所明显,在整个实验过程中,大量的细胞结合并采用LPS-FITC。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频图 3。FSP1cre后爪皮层的Z堆栈视频;LPS-FITC 注射前的 tdTomato 鼠标。FSP1cre 的平面方面;在用LPS-FITC注射前15分钟,tdTomato鼠标爪被成像,以控制GFP通道中产生的自荧光。GFP 通道中几乎没有信号指示没有自荧光。tdTomato-正成纤维细胞被可视化。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频图 4。LPS-FITC 注射前 TLR4KO鼠标后爪皮肤层的 Z 堆叠视频。TLR4KO鼠标爪的平面在注射前15分钟与LPS-FITC进行成像,以控制GFP通道产生的自荧光。GFP 通道中几乎没有信号指示没有自荧光。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频图 5。FSP1cre后爪皮层的Z堆栈视频;LPS-FITC注射后,tdTomato鼠标。 FSP1cre 的平面方面;tdTomato 小鼠爪在 LPS-FITC 注射后进行 1.5 小时的成像,通过表达 TLR4 的 tdTomato 阳性成纤维细胞来可视化 LPS-FITC 的接受。正如视频中所示,通过TLR4对LPS-FITC的极特摄取在tdTomato-正成纤维细胞上可见。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频图 6。LPS-FITC 注射后TLR4KO鼠标后爪皮肤层的Z-堆栈视频。 TLR4KO小鼠爪的平面方面在LPS-FITC注射后被成像1.5小时,以可视化细胞在TLR4全身敲除中是否可能摄入LPS-FITC。正如视频中所示,后爪皮肤层中的细胞看不到LPS-FITC的摄取量。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
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Discussion
可以说,体内2光子成像最重要的步骤是:1)为多光子设置和实验需求选择正确的基因报告小鼠和荧光标记蛋白21、22;2) 成像正确的焦平面,以准确表示组织中细胞群23;3) 尽量减少因动物不适当固定而的运动24;4)选择何时对数据进行定性分析,而定量分析数据为25、26、27。确保在开始实验之前解决这些要点,将提供收集可重现和科学严谨的数据的知识。
议定书中的一个重要考虑因素是适当固定区域以成像。在成像过程中,以及执行 z-Stack 和延时视频时,来自动物的呼吸会导致焦平面的微小偏移,从而导致视频中出现严重失真,并可能对生成的数据质量产生负面影响。确保爪子被正确固定,将允许成功成像的爪子,而不会中断呼吸。此外,了解实验中细胞的定位是确定要可视化的正确焦平面的关键步骤。因为我们选择专注于皮肤成纤维细胞,我们只需要将相对较短的距离成像到爪子中,就能直观地显示我们感兴趣的细胞类型(+100-150 μm)。在其他实验中,考虑显微镜的功能和客观的一种用途是很重要的,因为根据用户设置,对组织深处的细胞进行成像实验可能难以实现。 最后,选择方法进行数据分析是实验最后步骤中的一个重要考虑因素。在这里,我们展示,表达TLR4的成纤维细胞能够接受和结合荧光标记的LPS,这表现在视频中绿色(LPS)和红色(以成纤维细胞表示的tdTomato)的强健共定位。尽管此协议中未执行定量图像分析,但用户可以通过多种方式解释从该协议收集的数据。第一种是使用开源软件进行简单的联合本地化分析,以测量给定像素28中两种不同颜色的强度。这允许用户识别在采集的图像或视频中的给定像素上检测到两个激发的荧光量,以及给定空间中有多少重叠。这对于确定感兴趣的细胞是否与注入的分子的某种容量相互作用非常有用。定量分析的另一种方法是荧光强度29。用户能够收集有关细胞内给定信号强度的信息。从这些分析中收集的数据可能表明细胞如何与其他分子相比,可以获取不同量的分子。这些数据分析方法是用户如何寻求分析从类似于此协议中执行的实验收集的数据的示例。
我们的基因模型允许我们选择性地以荧光标记(tdTomato)FSP1–成纤维细胞以克/洛克克斯P依赖性的方式,从而允许快速和容易地可视化皮肤真皮中的细胞。虽然这使得可视化细胞容易,因为它们固有的荧光,可以进行2光子成像没有基因标记的细胞,如果用户的经验,以确定从表皮到真皮的转变。使用皮肤上头发的强健的自荧光水平,可以有效指示用户对焦的位置和需要移动的方向,以获得所需的焦平面。这显然只有在靠近皮肤的感兴趣的焦点平面,而不是感兴趣的细胞是深在组织内时才起作用。
在整个实验中跟踪焦平面是理想的;然而,由于活体动物的呼吸,当将z堆栈纳入延时实验中时,很难防止帧随时间的变化。为了解决此问题,用户可以考虑在使用谐振扫描仪时降低线平均率并提高采样率,从而降低成像质量。如前所述,在实验中几乎不可能使用传统的电流计扫描仪,因为扫描仪的采样速率较慢,因此将 z 堆栈和延时合并在一起。
更改图像采集的持续时间可以使用户更好地适应其实验的需要。虽然长时间成像动物允许用户在分子内分泌和代谢的所有步骤中收集数据,但缩短仅对过程的特定部分进行成像的时间将提高效率。可以拍摄较短的时间(±1-15分钟)以识别分子附着,延长时间(±15-30分钟),以可视化受体配体内分泌30,以及全持续时间(+30-60分钟)以可视化细胞分子的活化和潜在的代谢。然而,这高度依赖于注入的分子和细胞被可视化(图3)。
本手稿中描述的实验协议中的一个重要说明是,目前,我们无法在注射前和注射后对相同的样品区域进行成像。这是由于设置的性质和药物输送方法。然而,我们能够跟踪细胞从时间早期注射后几个小时。虽然在整个实验过程中跟踪单个细胞很重要,但细胞活化的区域变化同样重要,可以使用此方法捕获。鉴于设置,目前不可能在多光子显微镜上同时可视化两个以上荧光波,因此,这种方法的局限性是用户只能成像两个荧光光,而其它成像设备则4或更多的荧光光草能够同时可视化31。总体而言,所述协议特定于我们实验室的目标,并且提供了一个有用的工具来识别实验可能性超过协议限制的细胞激活。
本手稿中描述的方法比现有方法具有许多优点,可以可视化细胞的激活。首先,在这里进行的实验是在体内进行的,允许细胞结合和获取分子的实时可视化,这些分子直接指示激活,特别是关于侮辱。这提供了比其他方法(如传统的活细胞成像技术)的优势,因为我们能够保护细胞的环境,这大大降低了由于超可兴奋性和异位性而产生混淆结果的可能性与分离创伤有关的细胞活动32。此外,在此实验环境中使用多光子显微镜可降低荧光团光漂白剂允许连续和显著延长成像会话的速度,如果用户将此方法应用于研究,则非常重要调查新陈代谢或长期活化的速度33。最后,如果感兴趣的细胞类型位于组织深处(>100 mm),则使用多光子显微镜需要获得最佳信号34。总体而言,如果用户实验的目标是研究细胞的实时摄取和激活,以回应侮辱,那么使用双光子显微镜加上转基因报告线比其他传统的想象技术更合适。
此技术允许用户对各种细胞类型进行纵向研究,包括活化、活动性和细胞与细胞之间的相互作用。这种技术的优点是,它允许用户使用自己的基因标记报告的动物,并取代荧光标记的分子,以适应他们的研究兴趣(例如,Tie2cre的上皮细胞)。该协议并不局限于我们实验中所示的特定设置,可以进行高度修改,以满足任何实验室在其研究中利用遗传报告线和双光子真成像的需求。我们计划使用这种方法来识别外周创伤后损伤部位的免疫细胞的激活和招募,并确定激活和招募的具体时间过程,以便我们更好地了解最佳方法是什么预防性治疗是有关各种形式的疼痛。
总之,我们开发了一种新技术,允许用户通过tdTomato标记的皮肤成纤维细胞使用2光子显微镜表达TLR4来成像荧光标记LPS。
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Disclosures
提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
此工作由授权 NS096030 (MDB) 支持。我们还要感谢成像核心经理维德·普拉卡什。我们还要感谢奥林巴斯发现中心/位于达拉斯大学成像中心设施提供设备和支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
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