Summary
형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.
Abstract
섬유아세포는 활성화 시 형태를 변화시키는 중간엽 세포이며, 궁극적으로 그들이 위치한 조직의 미세 환경에 영향을 미칩니다. 전통적인 화상 진찰 기술은 고정된 조직에 있는 단백질 상호 작용 그리고 형태학을 확인하는 에서 유용하더라도, 그(것)들은 세포가 단백질을 결합하고 장악할 수 있는 얼마나 빨리에 관해서는 통찰력을 줄 수 없습니다, 그리고 일단 활성화된 그들의 형태가 어떻게 변경되는지 Vivo. 본 연구에서, 우리는 2 개의 중요한 질문을 합니다: 1) 톨-유사 수용체-4 (TLR4) 및 리포폴리사카라이드 (LPS) 상호 작용을 통해 섬유아세포 활성화의 시간 과정은 무엇이며 2) 이 세포는 한 번 활성화되면 어떻게 행동합니까? 2 광자 화상 진찰을 사용하여, 우리는 그것의 동체 수용체, TLR4에 결합하는 LPS-FITC의 기능을 평가하는 새로운 기술을 개발했습니다, 유전 기자 마우스 라인에 있는 말초 섬유아세포에 표현된; FSP1cre; tdTomato록스 스톱 록스 생체 내. 이 독특한 접근을 허용하는 이 독특한 접근은 연구원이 단백질이 세포 행동을 바꿀 수 있는 방법 이해에 있는 세분성의 증가한 수준을 가질 수 있게 하는 살아있는 세포와 상호 작용하는 단백질의 심층적인, 시간 경과 비디오 및/또는 사진을 만들 수 있습니다.
Introduction
리포폴리사카라이드(LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막에서 발견되는 내독소1. LPS는 톨형 수용체 4(TLR4)/CD14/MD2 수용체 복합체 2에대해 높은 결합 친화도를 가지는다. TLR4는 광범위한 면역 세포, 중간엽 세포 및 감각 뉴런의 서브세트3,4,5의외부막에서 흔하게 발견되는 패턴 인식 수용체이다. 면역 세포에 발현되는 TLR4의 활성화는 MyD88 의존적이고 독립적인 제2 메신저 시스템으로 이어지며, 세포의 핵으로의 핵인자 카파 베타(NFθB) 전좌로 끝납니다. 이것은 프로토티면역세포가 인터류킨(IL)-1β, IL-6 및 TNF-α6과 같은 염증성 사이토카인을생성하고 방출하게 한다. 그러나, 다른 세포 유형이 TLR4 자극에 반응하는 방식은 명확하지 않다. 섬유아세포는 암 및 낭포성 섬유증과 같은 광범위한 병리학에 연루되어 있으며 최근에는 단핵구 화학적 매력및 염증 촉진 7,8,9. 우리 실험실은 급성 및 만성 통증의 발달에 섬유 아세포의 역할에 관심이, 초기 증거는 섬유 아세포에 의해 발표 된 요인 (매트릭스 금속 종로 단백질 효소 (MMPs), 금속 종단 단백질 효소의 조직 억제제 (TIMPs), 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGFs))는 신경 병성 통증10에관여합니다.
세포의 활성화 상태는 다음과 같은 다양한 인자에 의해 결정될 수 있다: 즉각적인 초기 유전자의 유도, 변경된 단백질 발현, 세포 증식, 및 형태학적 변화11,12,13. 세포의 활성화가 병리학에 기여하는 방법에 관하여 우리가 가질 수 있는 질문에 대답하기 위하여 존재하는 많은 기술이 있습니다, 그러나 그(것)들은 모두 그들의 한계가 있습니다. 프로토타입 면역조직화학은 형광성 으로 태그가 부착된 항체를 사용하여 고정 된 조직에 관심있는 단백질을 라벨링하며, 이는 비특이적일 수 있으며 종종 유익한 결과를 산출하기 전에 상당한 문제 해결이 필요할 수 있습니다14. 서양 블로팅은 사후 조직에서 단백질 발현 수준을 비교할 때 유용한 기술입니다. 그러나, 조직학 분대는 이 기술에 결여되고 연구원은 형태학15에있는 어떤 변경든지 확인할 수 없습니다. RNA-Seq는 많은 경우에 통찰력있는 데이터를 산출하는 견본에 있는 메신저 RNA의 존재를 정량화하는 것을 허용합니다; 그러나, 전사와 번역 사이의 간격은 자극16후에 시간적 분해를 갖기 어렵게 만든다. 공초점 화상 진찰은 조직의 단면에 존재하는 단백질의 발현 및 공동 국소화를 결정하는 데 유용하다17. 종종 이것은 조직 샘플 전체를 대표하지 않습니다. 대조적으로, 다중 광자 현미경은 사용자가 포괄적인 3차원 표현18을만드는 견본에 대략 1 mm 깊이를 심층으로 심을 수 있습니다. 따라서, 우리는 생체 내, 2 광자 이미징 준비에 초점을 선택, 이러한 실험에서 수집 된 데이터는 살아있는 조직의 높은 플라스틱 및 상호 연결된 미세 환경에 더 직접적으로 관련되어 있기 때문에.
생체 내에서 단백질 수용체 상호작용을 연구하는 장점은 세포가 사후 조직 추출의 유해하고 예측할 수 없는 영향 없이 그들의 모국 환경에서실시간으로 자극에 반응하는 방법을 명확하게 포착할 수 있다는 것이다 19. 또한, 종방향 연구는 활성화로 인해 발생할 수 있는 세포 가소성과 프라이밍을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 2 광자 이미징을 사용하여 외부 자극이 적용될 때 존재하는 미세 환경의 무결성을 보존합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 몇 시간 동안 형광 태그가 붙은 LPS의 말초 주입 후 섬유아세포에서 분자의 섭취를 식별하는 방법과 섬유아세포 활성화에서 TLR4의 역할을 제공한다.
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Protocol
동물 절차는 달라스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 텍사스 대학에 의해 승인되었고 건강의 국가 학회 지침에 따라 있었습니다. 모든 실험은 C57BL/6 배경에서 사내에서 사육된 8-12주 된 수컷 및 암컷 마우스를 사용하여 수행하였다. 섬유아세포 특이적 단백질-1 프로모터에 의해 구동되는 cre-recombinase를 가진 형질전환 마우스는 상업적으로 구입하였다(Jackson, 012641) (FSP1cre)+/-tdTomato 록스-스톱-록스 마우스와 교차하고, 또한 상업적으로 구입 ( 잭슨, 007914) 및 (FSP1cre)+/- ; tdTomato록스 스톱 록스 및 FSP1cre-/-; tdTomato록스-스톱-록스 마우스는 C57BL/6 배경에서 사내에서 사육하였다(그림1A, B, C). 섬유아세포 특이적 단백질 1은 섬유아세포의 약 72%에 발현되는 내인성 단백질이며 진피 조직20에서효과적인 cre 드라이버를 나타낸다. 마우스는 그룹과 함께 보관되었고 음식과 물에 대한 광고 리비텀 접근권한을 부여하였다. 실온은 21±2°C에서 유지되었다. 우리는 8-12 주에 C57BL/6 교차 수컷 과 암컷 마우스를 사용하는 동안, 우리는 나이, 성별, 또는 유전 배경이 다광자 실험을 실행하는 데 필요한 요구 사항이라고 생각하지 않습니다. 마우스는 실험 직후 깊이 마취시키고 안락사시켰다.
1. 마약 의 준비
- 멸균 1x PBS (pH 7.4)에서 리포폴리사카라이드 FITC (재료 표참조)의 5 μg/ 20 μL 용액을 준비합니다. 최소 30초 동안 중간 강도의 스톡 용액을 소용돌이로 하여 파이펫팅 전에 용액 전체에 걸쳐 동일한 농도를 위한 균일한 혼합을 보장합니다(LPS는 찹쌀 분자).
참고: 가능하면 LPS를 유리 용기에 넣고 실리콘 미세 원심분리튜브를 사용하지 마십시오. 사용할 때까지 얼음을 유지하십시오.
2. 이미징 설정
- 2색 이미징을 위해 다원시스템(재료 표참조)을 설정합니다. 이를 위해서는 두 개의 별도의 여기 레이저(재료 표참조), GFP/RFP 필터 큐브 세트(재료 표 참조), 25x(1.05 NA) 수분 침수 목표(재료 표참조)를 사용해야 합니다.
참고: 사용자는 대체 설정 및 다원현미경 기능에 더 잘 맞게 이러한 설정을 변경할 수 있습니다. 이들은 실험 프로토콜에 사용되는 매개 변수입니다. 구체적인 내용은 재료 표를 참조하십시오. - 다광자 현미경의 무대에 입체 전도 장치 (재료 표참조)를 놓습니다. 이 것을 마취 전달 기계에 연결하여 실험 기간 동안 동물이 마취되도록 하십시오(재료 표참조). 마우스 발의 연결 점으로 장치의 표면에 무광택 검은 종이 조각을 놓습니다.
- 512 μm x 512 μm의 고정 스캔 영역이 있는 공진 스캐너를 선택합니다.
참고: 갈바노미터 스캐너를 사용하여 이 프로토콜에서 실험을 수행하지 마십시오. 느린 샘플 속도로 인해 불가피한 동물의 호흡으로 인해 z 스택 타임 랩스 비디오에서 왜곡이 있을 수 있습니다. - 두 개의 여기 레이저를 GFP와 RFP, 각각 930 nm 및 1100 nm의 흥분 파장에 조정하고, 690-1,050 nm의 이색 거울을 사용하여 두 여기 레이저의 광 경로를 단일 목표에 지시하여 930 nm 튜닝 된 흥분 레이저를 허용합니다. 메인 스캐너와 1,100 nm 튜닝 레이저에 반영하여 메인 스캐너로직접 전달합니다(그림 2).
참고: 사용자의 설정에 따라 이러한 여기 파장을 변경할 수 있습니다. - FITC의 레이저 파워를 5%, GFP를 20%로 설정합니다.
참고: 이 설정은 이러한 실험에서 최적의 신호 대 잡음 비(SNR)를 제공합니다. 다중 알칼리 광 승수 튜브 (PMTs)를 통해 신호를 감지; 그러나 GaAsP 검출기는 매우 고감도 실험에서 대신 사용될 수 있습니다. - 어두운 환경에서도 미각을 들이마를 대지 않고 이미징을 위한 공간을 준비합니다.
3. 생체 내 이미징
- 마취 전달 시스템의 유도 챔버에 마우스를 놓고 깊은 마취 아래에 마우스를 배치하는 산소의 2 L / 분 유량에서 5 % 이소플루란 (재료 표참조)를 사용합니다.
참고: 실험 중에 모든 적절한 PPE를 착용하는 것이 좋습니다.- 실험 전반에 걸쳐 마취를 유지하기 위해 코 콘에 접근할 수 있는 스테레오택시 장치로 마우스를 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 전달한다. 이소플루란을 1.5%-2%로 줄이고 유량을 일정하게 유지합니다.
-
뒷발을 검은 종이에 검은 색 테이프로 단단히 부착하여 관심 영역의 근접 및 말단 영역에 (이것은 마우스 호흡이 이미지 품질에 미치는 영향을 줄임) 발의 발바닥 표면이 막히지 않고 마주 보고 있는지 확인합니다. 목표를 향해 올라가야 합니다. 마우스 의 머리가 장치에 부착 된 코 콘 내에서 안정적인지 확인하십시오.
참고: 실험 전반에 걸쳐 마우스에서 고민이나 탈수의 징후가 있는지 모니터링하고 그에 따라 이소플루란을 조정합니다.
- 발의 발바닥 표면에 충분한 양의 멸균 수성 윤활유 (젤, 재료 표참조)를 놓고 발과 목표 사이에 액체 열을 만들기 위해 목표를 만집니다.
- FITC 여기라이트를 사용하여 발의 진피 층에 초점을 맞춥니다. tdTomato 태그가 지정된 섬유아세포가 계속하기 전에 시각화되었는지 확인합니다(이 단계는 이미지에 대한 올바른 초점 평면을 결정하는 데 중요합니다).
참고 : 발의 진피 층은 발에 약 100-150 μm입니다. - 930 nm 및 1100 nm 튜닝 레이저를 사용하여 뒷발의 발바닥 표면 바로 아래에 위치한 세포 면적을 이미지화하고 슬라이스 당 약 1 μm에서 약 5-10 z 슬라이스의 15 분 시간 경과를 획득하여 이전에 환경의 표현을 확립합니다. LPS-FITC로 주입할 수 있습니다.
- 25 μL 유리 해밀턴 주사기 (재료 표참조)와 30G 바늘 (재료 표참조)을 사용하여 마우스의 뒷발에 5 μg / 20 μL LPS-FITC의 인트라 플란타르 주입을 수행하십시오.
- 930 nm 및 1100 nm 튜닝 레이저를 사용하여 뒷발의 발바닥 표면 바로 아래에 위치한 세포 영역을 이미지화하고 슬라이스 당 약 1 μm에서 약 5-10 z 슬라이스의 60-120 분 시간 경과를 획득하여 세포에 의한 LPS-FITC의 섭취를 식별합니다.
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Representative Results
처음에, 우리는 발의 진피 층에 존재하는 모든 세포 유형에서 LPS-FITC의 섭취를 시각화하기 위해 야생 형 마우스의 뒷발에 LPS-FITC를 주입했습니다. 야생형 마우스에서 뒤발 의 진피 층에서 무수한 세포를 관찰한 결과, 야생형 마우스에서 형광태그가 붙은 LPS(영상1,2)에서 섬유아세포를 구체적으로 표적으로 삼으려고 노력했다. LPS-FITC로 주입된 동물의 발을 이미징하기 전에 우리는 진피 층에 세포의 고유 형광이 없다는 것을 분명히하고 싶었습니다. 이것은 주사 후, 우리가 취하는 이미지가 형광태그된 LPS와 세포의 진정한 상호작용이 아니라 어떤 이미징 아티팩트가 아닌지 확인하기 위한 것이다(비디오그림 3,4). LPS-FITC 주사 후, TLR4를 발현하는 FSP1+ 섬유아세포만이 주입된 단백질을 결합하고 섭취하며, 이들 세포에 의해 발현된 tdTomato 태그와 높은 수준의 공동 국소화를 하였다(영상도5). 대조적으로, TLR4가 전신에서 기절한 마우스(TLR4KO)는 주사 후 LPS를 결합하고 섭취하지 않는다. 비디오에서 알 수 있듯이, 세포의 실루엣은 LPS-FITC 주입 후에 볼 수 있는데 이는 약물이 세포 주위의 간질 유체에서 분산되고 있지만 실제로 수용체에 의해 구속되지 않음을 나타냅니다(비디오그림6).
우리의 결과를 요약하기 위해, 우리는, 생체 내에서, 그 LPS-FITC의 주입 후, FSP1cre에 표시; tdTomato록스-스톱-록스 세포 특이적 재활성화 동물만 섬유아세포가 LPS와 상호 작용하고 섭취한다. 대조적으로, TLR4의 전신 녹아웃은 주입 후 LPS-FITC를 결합하고 섭취하지 않는다.
그림 1 tdTomato는 Cre 의존적 방식으로 FSP1+ 섬유아세포로만 표현됩니다. A)C57BL/6 배경에서 사육된 FSP1cre 형질전환 마우스는 C57BL/6 배경상에서 사육된 tdTomato 마우스와 교차하여 FSP1+ 섬유아세포에서 발현된 tdTomato를 cre 의존적인 방식으로 생성한다. B)tdTomato를 발현하는 양성 및 음성 FSP1cre 마우스를 모두 나타내는 대표적인 PCR 결과. C)마우스 발에 위치한 세포외 공간에서 진피 섬유아세포의 대표적인 그림. FSP1+ 마우스는 섬유아세포에서만 적색 형광 단백질을 발현하는 반면 FSP1-마우스는 그렇지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 2 색 2 광자 현미경의 빛 경로. 2색 2-광자 실험을 위해 설정된 라이트 경로의 묘사설정. 레이저 1은 FITC-컨쥬게이싱 된 LPS를 자극하기 위해 930 nm로 조정되고 레이저 2는 섬유 아세포에서 발견되는 tdTomato를 자극하기 위해 1100 nm로 조정됩니다. 레이저 1의 여기 광은 이색 거울 (690-1050 nm)에 의해 반사되고 레이저 2의 여기 광은 주 스캐너로 전달됩니다. 두 레이저의 여기 광은 두 번째 이색 거울 (650 nm)에 거울 세트에 의해 반사되어 여기 빛이 목표를 통과하고 조직으로 전달되어 형광을 자극합니다. 빛은 흥분된 형광에서 방출되고 25x 목표에 의해 포착되고 이색 거울(650)에 의해 다중 알칼리 광증선튜브로 반사된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 2 광자 현미경의 실험 흐름 도표. 마우스는 저유량 마취 시스템 및 입체적 장치를 사용하여 마취 및 고정됩니다. 발의 발바닥 표면은 목표에 직면하고 15 분 동안 이미지됩니다. 5 μg/20 μL LPS-FITC의 인트라플란타르 주사는 마취된 마우스상에서 수행되고 발은 실험의 목표에 필요한 시간 동안 이미지화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 그림 1. 야생 유형 C57BL/6 마우스의 세포에서 LPS-FITC 섭취량의 Z 스택 비디오. LPS-FITC 주입 전에 C57BL/6 마우스의 뒷발의 진피 층의 Z 스택 비디오. 야생형 마우스 발의 발바닥 양상은 GFP 채널에서 생성된 자가형광을 제어하기 위해 LPS-FITC로 주사되기 전 15분 동안 이미지화되었다. GFP 채널에는 자가형광을 나타내는 신호가 거의 없습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 그림 2. LPS-FITC 주입 후 C57BL/6 마우스의 뒷발의 진피 층의 Z-스택 비디오. 야생형 마우스 발의 발바닥 양상은 TLR4를 발현하는 모든 세포에 의해 LPS-FITC의 섭취를 시각화하기 위해 LPS-FITC 주사 후 1.5시간 동안 이미지화되었다. 비디오에서 알 수 있듯이, 실험 과정 전반에 걸쳐 다수의 세포가 LPS-FITC를 결합하고 섭취합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 그림 3. FSP1cre의 뒷발의 진피층의 Z-스택 비디오; LPS-FITC 주입 전에 tdTomato 마우스. FSP1cre의 판면 측면; tdTomato 마우스 발은 GFP 채널에서 생성된 자동 형광을 제어하기 위해 LPS-FITC로 주입하기 전에 15분 동안 이미지화되었습니다. GFP 채널에는 자가형광을 나타내는 신호가 거의 없습니다. tdTomato 양성 섬유 아세포가 시각화됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 그림 4. LPS-FITC 주입 전에 TLR4KO 마우스의 뒷발의 진피 층의 Z-스택 비디오. TLR4KO 마우스 발의 발바닥 양상은 GFP 채널에서 생성된 자동 형광을 제어하기 위해 LPS-FITC로 주입하기 전에 15분 동안 이미지화되었다. GFP 채널에는 자가형광을 나타내는 신호가 거의 없습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 그림 5. FSP1cre의 뒷발의 진피층의 Z-스택 비디오; LPS-FITC 주입 후 tdTomato마우스. FSP1cre의 판면 측면; tdTomato 마우스 발은 TLR4를 발현하는 tdTomato 양성 섬유아세포에 의해 LPS-FITC의 섭취를 시각화하기 위해 LPS-FITC 주사 후 1.5시간 동안 이미지화되었다. 비디오에서 알 수 있듯이, tdTomato 양성 섬유아세포에 표현된 TLR4를 통해 LPS-FITC의 매우 구체적인 섭취가 보입니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 그림 6. LPS-FITC 주입 후 TLR4KO 마우스의 뒷발의 진피층의 Z-스택 비디오. TLR4KO 마우스 발의 발바닥 양상은 LPS-FITC 주사 후 1.5시간 동안 이미지화되어 TLR4의 전신 녹아웃에서 세포에 의한 LPS-FITC의 섭취가 가능하다. 비디오에서 알 수 있듯이, LPS-FITC의 어떤 섭취도 뒷발의 진피 층에서 세포에 의해 보이지 않습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
틀림없이 생체 내 2 광자 이미징의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 다중 광자 설정 및 실험 요구에 적합한 유전 기자 마우스 및 형광 태그 단백질을 선택21,22; 2) 조직(23)에 있는 세포의 집단의 정확한 표현을갖도록 정확한 초점 평면을 이미징; 3) 부적절하게 고정된 동물(24)으로인한 이동 최소화; 4) 정량적으로 데이터를 분석할 시기를 25,26,27. 실험을 시작하기 전에 이러한 점을 해결하도록 보장하면 재현 가능하고 과학적으로 엄격한 데이터를 수집하는 지식을 제공합니다.
프로토콜에서 중요한 고려 사항은 이미지화할 영역을 적절하게 고정하는 것입니다. 동물의 호흡은 이미징 중에 초점 평면의 미세한 변화를 일으키고 z-stack 및 타임랩스 비디오를 수행할 때 비디오에서 상당한 왜곡을 일으키고 생성된 데이터의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 발이 제대로 고정되어 있는지 확인하면 호흡을 방해하지 않고 발을 성공적으로 이미징 할 수 있습니다. 또한, 실험에서 세포의 국소화를 아는 것은 시각화할 올바른 초점 평면을 식별하는 데 중요한 단계이다. 우리는 진피 섬유아세포에 집중하기로 결정했기 때문에, 우리는 관심의 우리의 세포 모형을 구상할 수 있기 위하여 발에 상대적으로 짧은 거리를 심상할 필요가 있습니다 (~100-150 μm). 다른 실험에서는, 현미경의 기능을 고려하고 객관적인 하나는 사용자가 설정한 것을 감안할 때 조직 내 깊은 이미지 세포에 대한 실험을 수행하기 때문에 불가능할 수 있기 때문이다. 마지막으로, 데이터 분석에 접근하는 방법을 선택하는 것은 실험의 마지막 단계에서 중요한 고려 사항입니다. 여기에서, 우리는 TLR4를 표현하는 섬유아세포가 비디오에서 녹색 (LPS) 및 적색 (섬유아세포에 의해 표현된 tdTomato)의 강력한 공동 국소화에 의해 명백한 형광태그LPS를 취하고 묶을 수 있다는 것을 보여주고 있습니다. 이 프로토콜에서는 정량적 이미지 분석이 수행되지 않지만 사용자가 이 프로토콜에서 수집한 데이터를 해석할 수 있는 다양한 방법이 있습니다. 첫 번째는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 주어진 픽셀28에서두 개의 서로 다른 색상의 강도를 측정하는 간단한 공동 지역화 분석입니다. 이를 통해 사용자는 획득한 이미지 또는 비디오에서 지정된 픽셀에서 두 개의 흥분형광이 감지되는지 여부와 주어진 공간에 얼마나 많은 중복이 있는지 식별할 수 있습니다. 이것은 관심있는 세포가 주입된 분자와 어떤 용량으로 상호 작용하는지 확인하는 데 유용합니다. 정량분석의 대체 방법은 형광 강도29이다. 사용자는 관심 있는 셀 내에서 주어진 신호의 강도에 대한 정보를 수집할 수 있습니다. 이 분석에서 수집된 데이터는 세포가 그 외와 비교하여 분자의 각종 양을 취하는 방법을 나타낼 수 있습니다. 이러한 데이터 분석 방법은 사용자가 이 프로토콜에서 수행된 것과 유사한 실험에서 수집된 데이터를 분석하는 방법의 예입니다.
우리의 유전 모델은 우리가 선택적으로 형광 태그 (tdTomato) FSP1+ 섬유 아세포를 cre / loxP 의존적 인 방식으로, 피부의 진피에있는 세포의 빠르고 쉬운 시각화를 허용합니다. 이것은 그들의 본래 형광 때문에 세포를 쉽게 시공하게 하더라도, 사용자가 표피에서 진피에 교대를 결정하는 경험이 있는 경우에 유전적으로 표를 붙인 세포 없이 2 광자 화상 진찰을 실시할 수 있습니다. 피부에 머리에서 자기 형광의 강력한 수준을 사용하여 사용자가 초점을 맞추고 있는 위치와 원하는 초점 평면을 얻기 위해 이동해야 하는 방향을 나타내는 유용한 지표가 될 수 있습니다. 이것은 분명히 피부에 가까운 관심의 초점 면이 조직 내 깊은 관심의 세포가 되지 않을 경우에만 작동합니다.
실험 전반에 걸쳐 초점 평면을 추적하는 것이 이상적입니다. 그러나 살아있는 동물의 호흡으로 인해 z-stacks를 시간 경과 실험에 통합할 때 시간이 지남에 따라 프레임 이동을 방지하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 사용자는 공진 스캐너를 사용할 때 라인 평균을 줄이고 샘플 속도를 증가시켜 이미징 품질을 줄이는 것을 고려할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이 스캐너의 샘플 속도가 느리기 때문에 z-스택과 타임랩스가 통합되는 실험에서 기존의 갈바노미터 스캐너를 사용하는 것은 거의 불가능합니다.
이미지 수집 기간을 변경하면 사용자가 실험의 요구에 더 잘 맞을 수 있습니다. 오랜 시간 동안 동물을 이미징하는 동안 사용자는 분자 내분비증 및 대사의 모든 단계에 걸쳐 데이터를 수집 할 수 있지만, 프로세스의 특정 부분만 이미지하는 시간을 단축하면 효율성이 증가합니다. 분자 부착을 식별하는 짧은 시간(~1-15분) 동안 이미지를 이미지화할 수 있으며, 수용체-리간드 내분비증을 30, 전체 지속시간(~30-60분)으로 식별하여 분자 부착을 식별할 수 있습니다. 활성화 및 분자의 잠재적인 물질 대사. 이것은 그러나 주입된 분자에 높게 의존하고 세포를구상하였다 (도 3).
이 원고에 기술된 실험 프로토콜에서 중요한 점은 현재, 주입 전 및 사후 동일한 샘플 영역을 이미지화할 수 없다는 것입니다. 이것은 설치의 특성과 약물 전달 방법 때문입니다. 그러나, 우리는 몇 시간 동안 초기 주입 후 시간에서 세포를 추적 할 수 있습니다. 실험 의 과정을 통해 개별 세포를 추적하는 것이 중요하지만, 세포 활성화의 지역 적 변화는 동등하게 중요하며이 방법을 사용하여 캡처 할 수 있습니다. 현재 다광자 현미경으로 두 개 이상의 형광단을 동시에 시각화하는 것은 설치를 감안할 때 불가능하므로 이 방법의 한계는 사용자가 다른 이미징 장비와 는 달리 두 개의 형광단만 이미지화할 수 있다는 것입니다. 또는 더 많은 형광단은 동시에31을시각화 할 수 있습니다. 전반적으로, 설명된 프로토콜은 우리 실험실의 목표에 특정하며 실험 가능성이 프로토콜의 한계를 능가하는 세포 활성화를 식별하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
이 원고에 설명된 방법은 세포의 활성화를 시각화하는 기존 방법에 비해 많은 이점을 제공합니다. 여기에서 수행된 실험이 생체 내에서 수행되는 첫 번째 존재는, 모욕에 관하여 구체적으로 활성화를 직접 나타내는 분자를 결합하고 취하는 세포의 실시간 시각화를 허용합니다. 이것은 우리가 크게 과흥분성 및 자궁 외로 인해 혼동 결과의 가능성을 감소시키는 세포의 환경을 보존할 수 있기 때문에 전통적인 살아있는 세포 화상 진찰 기술과 같은 그밖 방법에 비해 이점을 제공합니다 해리의 외상과 관련된 세포의 활동32. 또한, 이 실험 환경에서 다광자 현미경을 사용하면 형광광 표백제가 연속적이고 현저하게 더 긴 이미징 세션을 허용하는 속도가 감소하며, 이는 사용자가 이 방법을 연구에 적용하는 경우에 중요합니다. 신진 대사 또는 장기 활성화의 속도를 조사33. 마지막으로, 관심 있는 세포 유형이 다광자 현미경을 사용하여 조직(>100 mm) 내에 깊숙이상주하는 경우 최적의 신호(34)를 얻을 필요가 있다. 전반적으로, 사용자의 실험의 목적이 모욕에 반응하여 세포의 실시간 섭취 및 활성화를 연구하는 것이라면, 트랜스제닉 리포터 라인과 결합된 2광자 현미경을 사용하는 것이 다른 기존의 상상 기술에 비해 더 적합하다.
이 기술은 사용자가 활성화에 관한 세포 유형의 다양 한에 종 방향 연구를 수행할 수 있습니다., 운동성, 그리고 세포-세포 상호 작용. 이 기술의 장점은 사용자가 자신의 유전자 태그가 있는 보고된 동물을 사용하고 형광 태그가 있는 분자를 연구 관심사에 맞게 대체할 수 있다는 것입니다(예: 상피 세포의 Tie2cre). 이 프로토콜은 우리의 실험에 표시된 특정 설정에 제한되지 않으며 그들의 연구 결과에 있는 유전 기자 선 및 2 광자 진피 화상 진찰을 이용하는 어떤 실험실든지의 필요에 맞게 높게 수정될 수 있습니다. 우리는 말초 외상 다음 부상 부위에 면역 세포의 활성화 및 모집을 식별하고 활성화 및 모집의 특정 시간 과정이 무엇인지 결정하기 위해이 방법을 사용할 계획입니다. 예방 치료에 대한 통증의 다양한 형태에 관한 것입니다.
결론적으로, 우리는 사용자가 2 광자 현미경을 사용하여 TLR4를 발현하는 tdTomato 태그진 진피 섬유아세포에 의해 형광 태그LPS의 화상 섭취를 할 수 있는 새로운 기술을 개발했습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 교부금 NS096030(MDB)에 의해 지원됩니다. 우리는 또한 이미징 코어 매니저 Ved Prakash에 감사드립니다. 또한 UT 달라스의 올림푸스 디스커버리 센터/이미징 코어 시설에 장비와 지원을 제공한 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
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