Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59647
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Science, Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

Abstract

פיברופיצוצים הם תאים mesenchymal כי לשנות את המבנה שלהם על ההפעלה, בסופו של דבר השפעה על מיקרואקולוגיה של הרקמה הם ממוקמים. למרות טכניקות הדמיה מסורתיות שימושיות בזיהוי אינטראקציות חלבונים ומורפולוגיה ברקמה קבועה, הם לא מסוגלים לתת תובנה לגבי איך תאים במהירות מסוגלים לאגד וספיגת חלבונים, ולאחר הפעלת כיצד שינויי המבנה שלהם ב vivo. במחקר הנוכחי, אנו שואלים 2 שאלות עיקריות: 1) מה הוא הזמן-קורס של הפעלת פיברובלסט דרך קולטן כמו חיוג 4 (TLR4) ו ליפופוליד (LPS) אינטראקציה 2) איך תאים אלה להתנהג פעם הופעל? באמצעות 2-פוטון הדמיה, פיתחנו טכניקה הרומן כדי להעריך את היכולת של lps-fitc לאגד קולטן קנצוני שלה, TLR4, הביע על פיברופיצוצים היקפיים קו העכבר העיתונאי הגנטי; FSP1cre; . vivo, לקס. גישה ייחודית זו מאפשרת לחוקרים ליצור מעמיק, קטעי וידאו ו/או תמונות של חלבונים אינטראקציה עם תאים חיים המאפשר אחד יש רמה מוגברת של צפיפות הרשת בהבנת איך חלבונים יכולים לשנות התנהגות תאית.

Introduction

ליפופוליסכריד (LPS) הוא אנדוטוקסין שנמצא בקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים1. LPS יש זיקה מחייבת גבוהה עבור קולטן כמו אגרה 4 (TLR4)/CD14/MD2 מורכבת הקולטן2. TLR4 הוא הזיהוי דפוס הקולטן נמצא בדרך כלל על הקרום החיצוני של מגוון רחב של תאים חיסוניים, התאים mesenchymal, וקבוצת משנה של נוירונים סנסטיים3,4,5. ההפעלה של TLR4 ביטא על התאים החיסוניים מוביל למערכות שליחה התלויים בMyD88 ועצמאיים, ומסתיים באמצעות הטרנסלוקציה של הגורם הגרעיני ביתא (NFκB) לגרעין התא. זה גורם תא החיסון prototypic לייצר ולשחרר ציטוקינים פרו דלקתיים כגון Interleukin (IL) -1 β, IL-6 ו-TNF-α6. עם זאת, האופן שבו סוגי תאים אחרים מגיבים לגירוי TLR4 אינו ברור. פיברותקיעות כבר היה מעורב במגוון רחב של פתווגיות כגון סרטן סיסטיק פיברוזיס לאחרונה הוכחו לשחק תפקיד מונוציט כימותרפיה-אטרקציה וקידום דלקת7,8,9.  המעבדה שלנו מעוניינת בתפקיד של בעיות בהתפתחות של כאב חריף וכרוני, כפי שראיות מוקדמות מצביעות על כך שגורמים שפורסמו על ידי פיברוטיטים (Mps מטריקס), רקמות מעכבי של מטאלוסים (TIMPs), ופיברוביסט גורמי גדילה (FGFs)) מעורבים בכאבים נוירופתיים10.

מצבי הפעלה של תאים יכולים להיקבע על ידי מגוון של גורמים הכוללים: אינדוקציה של גנים מוקדמים מיידית, ביטוי חלבון משתנה, הפצת תאים, ושינויים מורפולוגיים11,12,13. ישנן טכניקות רבות הקיימות כדי לענות על שאלות שאולי יש לנו על איך הפעלה של תאים תורמת הפתווגיות, אבל לכולם יש מגבלות שלהם. פרוטוסטיאוסטוכימיה משתמשת בנוגדנים מתויגים פלואורוסקופים כדי לתייג חלבונים של עניין ברקמה קבועה, אשר עשוי להיות בלתי ספציפי ולעתים קרובות דורשים פתרון בעיות משמעותיות לפני מניב תוצאות פוריות14. כתמים מערביים היא טכניקה שימושית בעת השוואת רמות של ביטוי חלבון ברקמה שלאחר המוות; עם זאת, המרכיב היסטולוגית חסר בטכניקה זו וחוקרים אינם יכולים לזהות שינויים במבנה מורפולוגיה15. RNA-Seq מאפשר לנו לכמת את הנוכחות של RNA שליח במדגם אשר במקרים רבים תשואות נתונים תובנה; עם זאת, הפער בין תמלול ותרגום מקשה על הרזולוציה הטמפורלית לאחר גירוי16. הדמיה קונפוקלית שימושית בקביעת הביטוי והלוקליזציה של חלבונים הקיימים בחתך של רקמות17. לעתים קרובות, אין זה נציג של כל דגימת הרקמה. לעומת זאת, מיקרוסקופ multiphoton לאפשר למשתמשים תמונה בערך 1 מ"מ עמוק לתוך מדגם, יצירת ייצוג תלת מימדי מקיף18. לכן, אנחנו בוחרים להתמקד ב-vivo, 2-פוטון הדמיה preps, כאשר הנתונים שנאספו מניסויים אלה הם יותר ישירות לתרגום מאוד פלסטיק והדדית מיקרוסביבה של רקמות החיים.

היתרון של לימוד אינטראקציות של קולטן חלבון ב vivo הוא שאנחנו יכולים ללכוד בבירור כיצד תאים להגיב גירוי, בזמן אמת, בסביבה הטבעית שלהם ללא השפעה מזיקה ובלתי צפויה של הוצאת רקמות שלאחר המוות19. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים לאורך כדי להעריך את הפלסטיות התאית והטרמה שעלולות להתרחש עקב הפעלה.  באמצעות הדמיה 2-פוטון, אנו שומרים על השלמות של המיקרו-סביבה בהווה כאשר מוחל גירוי חיצוני. פרוטוקול זה מספק דרך לזהות ספיגת מולקולות באמצעות הזרקה היקפית בעקבות הזרקת היקפי של מתויג LPS במהלך מספר שעות בvivo ואת התפקיד של TLR4 בהפעלת פיברובלסט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הליכים בעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס של דאלאס טיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה היו בהתאם לאומי מכונים הנחיות בריאות.  כל הניסויים בוצעו באמצעות 8-12-שבוע-גברים עכברים ונשים שנולדו ב-הבית על רקע C57BL/6. עכברים טרנסגניים עם recombinase מונע על ידי המקדם חלבון-1 הספציפי לפיברוהפיצוץ נרכשו מסחרית (ג'קסון, 012641) (FSP1cre)+/- וחצה עם עכברים tdtomatoלקס-stop-לקס , רכשו גם מסחרית ( ג'קסון, 007914) ו-(FSP1cre)+/- ; להפסיק את הFSP1cre. tdTomatoלקס-לעצור-לקס עכברים הונולדו ב-הבית על C57BL/6 רקע (איור 1א, ב, ג). חלבון פיברופיצוץ ספציפי 1 הוא חלבון אנדוגני המבוטא על בערך 72% של פיברובלסט ומייצג נהג יצור יעיל ברקמה העורי20. עכברים היו בקבוצה שוכנו ונתנו גישה מודעת ad למזון ומים. טמפרטורת החדר נשמרה ב -21 ± 2 ° c. בעוד השתמשנו C57BL/6 מוצלב עכברים זכר ונקבה ב 8-12 שבועות, אנחנו לא מאמינים הגיל, מין, או הרקע הגנטי הם דרישות הכרחי להריץ ניסויים בריבוי פוטון. עכברים היו מורדמים עמוקות מיד לאחר הניסוי והורדמים.

1. הכנת תרופות

  1. להכין 5 μg/20 μL פתרון של ליפופוליסכלידה-FITC (ראה שולחן חומרים) ב-1x מעקר PBS (pH 7.4). מערבולת הפתרון המניות בעוצמה בינונית עבור 30 שניות מינימלית כדי להבטיח ערבוב הומוגנית עבור ריכוז שווה לאורך הפתרון לפני ליטוף (LPS הוא מולקולה הדבקי).
    הערה: אל תמקם את LPS במיכל זכוכית, אם אפשר, השתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגה. . שמור על הקרח עד השימוש

2. הגדרת הדמיה

  1. הגדר את מערכת ריבוי הפוטון (ראה טבלת חומרים) עבור הדמיה של שני צבעים. זה דורש שימוש בשני לייזרים עירור נפרד (ראה טבלה של חומרים), קוביית מסנן gfp/rfp להגדיר (לראות את הטבלה חומרים), ו 25x (1.05 NA) מטרה טבילה במים (ראה טבלת חומרים).
    הערה: משתמשים יכולים לשנות הגדרות אלה כדי להתאים בצורה טובה יותר כיוונונים חלופיים ויכולות מיקרוסקופ רב-פוטון. אלו הפרמטרים המשמשים. בפרוטוקול הניסיוני ראה טבלת חומרים לפרטים ספציפיים.
  2. מניחים מנגנון סטריאוטקאלי (ראו טבלת חומרים) על הבמה של מיקרוסקופ רב-פוטון. חבר את זה למכונת משלוח הרדמה (ראה טבלת חומרים) כדי להבטיח את החיות מורדם למשך הניסוי. מניחים פיסת נייר שחור מאט על פני השטח של המנגנון כנקודת חיבור לכף העכבר.
  3. בחר את סורק התהודה עם שטח סריקה קבוע של 512 יקרומטר x 512 יקרומטר.
    הערה: אל תבצעו את הניסויים בפרוטוקול זה באמצעות סורק גלוונומטר. בשל קצב המדגם איטי יותר, תהיה עיוות z מחסנית זמן וידאו לשגות בשל הנשימה של החיה כי הוא בלתי נמנע.
  4. לכוון את שני לייזרים עירור כדי אורכי גל עירור של GFP ו RFP, 930 nm ו 1100 nm בהתאמה, ולהפנות את הנתיב האור של שני לייזרים עירור למטרה אחת באמצעות מראה דיקרואיק של 690-1050 ננומטר המאפשר את 930 ננומטר לייזר עירור מכוון להיות משתקף הסורק הראשי 1,100 ננומטר לייזר מכוון לעבור ישירות לתוך הסורק הראשי (איור 2).
    הערה: ניתן לשנות את אורכי הגל האלה בהתאם לכיוונון המשתמש.
  5. הגדר את כוח הלייזר של FITC ל-5% ו-GFP עד 20%.
    הערה: התקנה זו מספקת יחס מיטבי של אות לרעש (SNR) בניסויים אלה. זיהוי אות באמצעות צינורות מכפיל תמונות רב אלקליות (PMTs); עם זאת, גלאי GaAsP עשוי לשמש במקום ניסויים ברגישות גבוהה מאוד.
  6. הכינו את החדר להדמיה בתנאים אפלים ללא אור תועה.

3. בהדמיה vivo

  1. מניחים את העכבר לתוך החדר אינדוקציה של מערכת משלוח הרדמה ולהשתמש 5% isofלאנה (ראה שולחן חומרים) בקצב זרימה 2 L/min של חמצן למקום העכבר תחת הרדמה עמוקה.
    הערה: מומלץ מאוד ללבוש את כל ה-PPE המתאים במהלך הניסוי.
    1. העבר את העכבר למנגנון הסטריאוטקאלי עם גישה לקונוס האף כדי לשמור על ההרדמה במהלך הניסוי. הפחת את isof, to 1.5%-2% ושמור על קבוע קצב הזרימה.
    2. בחוזקה לצרף את הכף האחוריות אל פיסת נייר שחור עם קלטת שחור על האזורים האבובית והמרוחק לאזור העניין (זה מפחית את ההשפעות של הנשימה בעכבר על איכות התמונה), וודא את משטח plantar של כף הרגל הוא הללא השפעה ופנים לכיוון המטרה. ודא כי ראשו של העכבר יציב בתוך חרוט האף מחובר המנגנון.
      הערה: לעקוב אחר העכבר על כל סימן של מצוקה או התייבשות במהלך הניסוי ולהתאים את isofלוריאן בהתאם.
  2. מניחים כמות נדיבה של חומר סיכה סטרילי המבוסס על מים (ג'ל, ראה טבלת חומרים) על משטח plantar של כף היד ולגעת במטרה כדי ליצור טור של נוזל בין כף הרגל והמטרה.
  3. השתמש אור עירור FITC להתמקד לתוך השכבה העורי של כף היד. ודא כי tdTomato-שתייגת פיברופיצוצים הם דמיינו לפני המשך (שלב זה חשוב בקביעת מישור מוקד הנכון לתמונה).
    הערה: שכבת העורי של כפה הוא על 100-150 יקרומטר לתוך כף היד.
  4. תמונה באזור של תאים ממוקם ממש מתחת למשטח plantar של הרגל האחוריות עם שני 930 ננומטר ו 1100 ננומטר מכוון לייזרים ולרכוש 15 דקות זמן-פקיעה של כ 5-10 z-פרוסות ב כ 1 יקרומטר לכל פרוסה כדי להקים ייצוג של הסביבה לפני הזרקה עם LPS-FITC.
  5. ביצוע הזרקה של 5 μg/20 μL LPS-FITC על כף הרגל של העכבר באמצעות 25 μL זכוכית המילטון מזרק (ראה טבלת חומרים) ו 30g המחט (ראה לוח חומרים), מטפלת לא להפריע את המיקום של כף היד.
  6. תמונה באזור של תאים ממוקם ממש מתחת למשטח plantar של הרגל האחוריות עם שני 930 ננומטר ו 1100 ננומטר מכוון לייזרים ולרכוש 60-120 דקה זמן-פקיעה של אודות 5-10 z-פרוסות ב כ 1 יקרומטר לכל פרוסה כדי לזהות ספיגת lps-fitc על ידי תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתחילה, הזרקנו LPS-FITC לתוך האחוריות של עכברים מסוג פראי כדי להמחיש את ספיגת LPS-FITC בכל סוגי התאים הנמצאים בשכבה העורי של כף היד. לאחר שנצפתה מספר עצום של תאים בשכבת העורי של ספיגת כף הרגל האחוריות fluorescently אופן-מתויג LPS בעכבר סוג פראי (וידאו איור 1, 2), ניסינו במיוחד היעד פיברופיצוצים כפי שהם מוקד עיקרי במחקר שלנו. לפני הדמיה כפות הרגליים של בעלי חיים הוזרק עם LPS-FITC רצינו להיות ברור כי אין זריחה הטבועה של תאים בשכבה העורי. זה כדי להבטיח כי לאחר הזרקה, את התמונות שאנחנו לוקחים הם אינטראקציה אמיתית של תאים עם מתויג fluorescently לא כל חפצי הדמיה (וידאו איור 3, 4). לאחר הזרקת LPS-FITC, רק FSP1+ פיברותקיעות מביע TLR4 אגד וספיגה של חלבון מוזרק, עם רמה גבוהה של לוקליזציה עם תג tdTomato המבוטא על ידי תאים אלה (וידאו איור 5). לעומת זאת, עכברים כי יש TLR4 הפילו את כל הגוף (TLR4KO) לא לאגד לספיגת lps לאחר ההזרקה. כפי שניתן לראות בווידאו, צלליות של תאים גלויים לאחר הזרקת LPS-FITC אשר מציין כי התרופה היא פיזור של נוזל ביניים סביב התאים אבל הוא לא בעצם להיות מחויב על ידי קולטן (וידאו איור 6).

כדי לסכם את התוצאות שלנו, אנו מראים, בvivo, כי לאחר הזרקה של lps-fitc, בFSP1cre; tdTomatoלקס-stop-לקס -בעלי חיים ספציפיים להפעלה מופעל רק באמצעות שקיים אינטראקציה עם lps ספיגת. לעומת זאת, שלמות הגוף הנשירה של TLR4 לא לאגד וספיגת LPS-FITC לאחר ההזרקה.

Figure 1
איור 1 tdtomato מתבטאת רק ב-FSP1+ פיברותקיעות בצורה תלוית-יצורים. A) עכברים FSP1cre גניים התרבו על רקע C57BL/6 הם חצו עם עכברים tdTomato התרבו על רקע C57BL/6 כדי ליצור עכברים הביעו TDTOMATO ב FSP1+ פיברובלסט באופן משועבד ליצירת קשר. ב) המתארים את העכברים הFSP1cre החיוביים והשליליים המבטאים את tdTomato. ג) כתב-יד מייצג בחלל העצמי של העכבר. FSP1+ עכברים לבטא חלבון פלורסנט אדום רק בפיברותקיעות בעוד FSP1- עכברים לא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . מסלול אור של שני צבעים 2-פוטון מיקרוסקופ. התיאור של נתיב האור המוגדר לניסוי בן 2 הצבעים 2-פוטון הוגדר. לייזר 1 מכוון 930 nm לרגש FITC-מצועם LPS ו לייזר 2 מכוון 1100 nm כדי לרגש tdTomato נמצאו בפיברופיצוצים. האור עירור מלייזר 1 משתקף על ידי דיקרואיק mirror (690-1050 nm) בעוד האור עירור מלייזר 2 עובר דרך הסורק הראשי. אור העירור משתי לייזרים משתקף על ידי קבוצה של מראות לדיקרואיק שנייה (650 nm) המאפשר האור עירור לעבור דרך המטרה לתוך הרקמה כדי להלהיב את fluorophores. אור נפלט fluorophores נרגש והוא נתפס על ידי המטרה 25x ומשתקף על ידי המראה דיקרואיק (650) הצינורות הרב אלקליות הפוטולוטיפייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . תרשים זרימה ניסיוני של 2-פוטון מיקרוסקופ. עכברים מורדם ומקיבוע באמצעות מערכת הרדמה בעלת זרימה נמוכה ומנגנון סטריאוטקאלי. משטח plantar של כף פונה למטרה והוא התמונה עבור 15 דקות. הזרקה של 5 μg/20 μL LPS-FITC מבוצעת על העכבר המורדם והכפה הוא לאחר מכן התמונה למשך זמן הדרוש למטרת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Video Figure 1
וידאו איור 1. Z-מחסנית וידאו של ספיגת LPS-FITC בתאים בסוג פראי C57BL/6 עכברים. Z-מחסנית וידאו של השכבה העורי של הרגל האחוריות של C57BL/6 העכבר לפני הזרקת LPS-FITC. ההיבט plantar של כפה מסוג פראי העכבר היה התמונה עבור 15 דקות לפני ההזרקה עם LPS-FITC לשלוט על המיוצר פלואורסצנטית אוטומטי המיוצרים בערוץ GFP. אין משהו שאינו מאותת בערוץ GFP המצביע על אי-קרינה אוטומטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video Figure 2
וידאו איור 2. Z-מחסנית וידאו של השכבה העורי של הרגל האחוריות של C57BL/6 עכבר לאחר הזרקת LPS-FITC. ההיבט plantar של העכבר סוג פראי כפה היה הדמיה עבור 1.5 שעות post-LPS-FITC הזרקה כדי להמחיש את ספיגת LPS-fitc על ידי כל התאים ביטוי TLR4. כפי שניכר בווידאו, המון תאים לאגד וספיגת LPS-FITC במהלך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video Figure 3
וידאו איור 3. Z-מחסנית וידאו של השכבה העורי של הרגל האחוריות של FSP1cre; עכבר tdTomato לפני הזרקת LPS-FITC. ההיבט plantar של FSP1cre; tdTomato כפה העכבר היה התמונה עבור 15 דקות לפני ההזרקה עם LPS-FITC לשלוט על זריחה אוטומטית המיוצר בערוץ GFP. אין משהו שאינו מאותת בערוץ GFP המצביע על אי-קרינה אוטומטית. tdTomato-הפיברופיצוצים חיוביים הם דמיינו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video Figure 4
וידאו איור 4. Z-מחסנית וידאו של השכבה העורי של הרגל האחוריות של TLR4KO עכבר לפני lps-fitc הזרקה. ההיבט plantar של כפה TLR4KO העכבר היה התמונה עבור 15 דקות לפני ההזרקה עם lps-fitc לשלוט על זריחה אוטומטית המיוצר בערוץ gfp. אין משהו שאינו מאותת בערוץ GFP המצביע על אי-קרינה אוטומטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video Figure 5
וידאו איור 5. Z-מחסנית וידאו של השכבה העורי של הרגל האחוריות של FSP1cre; עכבר tdTomato לאחר הזרקת LPS-FITC.  ההיבט plantar של FSP1cre; tdTomato העכבר כפה היה תמונה עבור 1.5 שעות post-LPS-FITC הזרקה כדי להמחיש את ספיגת LPS-FITC על ידי tdTomato-חיובי פיברופיצוצים המבטא TLR4. כפי שניתן לראות בווידאו, ספיגה ספציפית מאוד של LPS-FITC באמצעות TLR4 ביטא על tdTomato-חיובית פיברותקיעות נתפסת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video Figure 6
וידאו איור 6. Z-מחסנית וידאו של השכבה העורי של הרגל האחוריות של TLR4KO עכבר לאחר הזרקת lps-fitc.  ההיבט plantar של כפה TLR4KO העכבר היה הדמיה עבור 1.5 שעות POST-LPS-fitc הזרקת להמחיש אם ספיגה של lps-fitc על ידי תאים בנוקאאוט גוף שלם של TLR4 הוא אפשרי. כפי שניכר בווידאו, לא ספיגה של LPS-FITC נראה על ידי התא בשכבה העורי של הרגל האחוריות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לטעון את הצעדים החשובים ביותר של vivo 2-פוטון הדמיה הם: 1) בחירת העכבר הכתב הגנטי הנכון ו-fluorescently אופן מתויג חלבון עבור ההתקנה multi-פוטון ואת הצרכים הניסיוניים21,22; 2) הדמיה של מטוס המוקד הנכון לייצוג מדויק של אוכלוסיית התאים ברקמה23; 3) מזעור התנועה בשל בעל חיים שאינו מותקן24; ו-4) בחירה מתי לנתח את איכות הנתונים לעומת ככמת25,26,27. הבטחת הטיפול בנקודות אלה לפני תחילת הניסוי תספק את הידע לאיסוף נתונים הקפדניים באופן מדעי וקפדני.

שיקול חשוב בפרוטוקול משתק כראוי את האזור ליצירת תמונה. נשימה מן החיה גורמת משמרות דקה במישור המוקד במהלך הדמיה, בעת ביצוע z-מחסנית וידאו פקיעה זמן, זה גורם עיוות משמעותי בווידאו יכול להשפיע לרעה על איכות הנתונים המיוצרים. להבטיח כי כפה הוא מתפקד כראוי יאפשר הדמיה מוצלחת של כפה ללא הפרעה מנשימה. בנוסף, הכרת ההתאמה של תאים בניסוי היא צעד קריטי בזיהוי מישור המיקוד הנכון להמחיש. בגלל שבחרנו להתמקד בפיברותקיעות עורי, אנחנו רק צריכים תמונה מרחק קצר יחסית לתוך כף כדי להיות מסוגל לדמיין את סוגי התאים שלנו עניין (~ 100-150 μm). בניסויים אחרים, חשוב לשקול את היכולות של המיקרוסקופ והאובייקטיבי אחד משתמש כי ביצוע ניסוי בתאי התמונה עמוק בתוך הרקמה עשוי להיות מאתגר בלתי אפשרי בהתחשב המשתמשים להגדיר.  לבסוף, בחירת אופן הגישה לניתוח נתונים היא שיקול חשוב בשלבים האחרונים של הניסוי. כאן, אנו מראים כי שTLR4 ביטוי המבטא הם מסוגלים ספיגת ולאגד fluorescently מתויג LPS אשר ניכרת על-ידי לוקליזציה חזק של ירוק (LPS) ו אדום (tdTomato מבוטא על ידי פיברותקיעות) בקטעי וידאו. למרות שלא נעשה ניתוח תמונה כמותי בפרוטוקול זה, קיימות מגוון דרכים בהן המשתמש יכול לפרש נתונים שנאספו מפרוטוקול זה. הראשון להיות ניתוח לוקליזציה שיתוף פשוט באמצעות תוכנת קוד פתוח כדי למדוד את העוצמה של שני צבעים שונים בפיקסל נתון28. זה מאפשר למשתמש לזהות אם שני fluorophores נרגש מזוהים על פיקסל נתון בתמונה רכשה או וידאו וכמה חלק זה חפיפה יש בחלל נתון. הדבר שימושי בזיהוי אם תאי העניין מקיימים אינטראקציה עם המולקולה המוזרקת. שיטה חלופית לניתוח כמותי היא בעוצמה של קרינה פלואורסצנטית29. המשתמש מסוגל לאסוף מידע על האינטנסיביות של אות נתון בתוך תא מעניין. נתונים שנאספו מניתוחים אלה עשויים להצביע על האופן שבו תאים עלולים לספיגת כמויות שונות של מולקולה בהשוואה לאחרים. שיטות אלה של ניתוח נתונים הן דוגמה לאופן שבו המשתמש עשוי לבקש לנתח נתונים שנאספו מניסוי הדומה לזו שבוצעה בפרוטוקול זה.

הדגמים הגנטיים שלנו מאפשרים לנו תג באופן סלקטיבי (tdtomato) FSP1+ פיברותקיעות בצורה מהירה/loxp התלוי, אשר מאפשר ויזואליזציה מהיר וקל של תאים בתוך דרמיס של העור. למרות שזה הופך את התאים ויזואליזציה קל בגלל הזריחה הטבועה שלהם, ניתן לבצע הדמיה 2-פוטון ללא תאים מתויגים גנטית אם המשתמש הוא מנוסה בקביעת המעבר מן האפידרמיס אל dermis. באמצעות רמות חזקות של פלואורסצנטית אוטומטי מן השיער על העור יכול להיות מחוון שימושי של איפה המשתמש מתמקד וכיוון אחד צריך לעבור כדי להשיג את המטוס הרצוי מוקד. זה ברור יעבוד רק אם המישור המוקד של עניין קרוב לעור לא יהיה תא העניין הוא עמוק בתוך הרקמה.

מעקב אחר מטוס מוקד לאורך הניסוי הוא אידיאלי; עם זאת, בשל הנשימה של בעל חיים חי, זה מקשה על מניעת שינויי מסגרת לאורך זמן כאשר משלבים z-ערימות לתוך ניסוי מעידה בזמן. כדי לפתור בעיה זו, המשתמש עשוי לשקול להפחית את איכות הדימות על-ידי הקטנת קו-בממוצע בעת שימוש בסורק תהודה והגדלת קצב הדגימה. כפי שהוזכר קודם לכן, כמעט בלתי אפשרי להשתמש בסורק גלוונומטר מסורתי בניסוי שבו z-מחסנית ו-לשגות זמן משולבים עקב קצב המדגם איטי יותר של הסורק.

שינוי משך רכישת התמונה עשוי לאפשר למשתמש להתאים בצורה טובה יותר את הצרכים של הניסוי שלהם. בעוד הדמיה של בעל החיים לפרקי זמן מורחבים מאפשר למשתמש לאסוף נתונים לאורך כל השלבים של מולקולה האנדוציטוזה וחילוף החומרים, קיצור הזמן לתמונה רק חלקים ספציפיים של התהליך יגביר את היעילות. ניתן לצלם למשך פרק זמן קצר יותר (~ 1-15 דקות) כדי לזהות מולקולה מצורף, פרק זמן ארוך יותר (~ 15-30 דקות) כדי להמחיש את הקולטן-ligand האנדוציטוזה30, ואת המשך המלא (~ 30-60 דקות) כדי להמחיש הסלולר הפעלה וחילוף החומרים הפוטנציאלי של המולקולה. זה תלוי מאוד עם זאת על המולקולה מוזרק והתאים היו דמיינו (איור 3).

הערה חשובה בפרוטוקול הניסיוני המתואר בכתב יד זה היא כי כרגע, אנחנו לא יכולים לצלם באזורים זהים לדוגמה מראש ולאחר ההזרקה. זאת בשל טבעו של הכיוונון ושיטת המסירה לסמים. עם זאת, אנו מסוגלים לעקוב אחר התאים מתקופה מוקדמת שלאחר ההזרקה במשך כמה שעות. אמנם חשוב לעקוב אחר תאים בודדים במהלך הניסוי, שינויים אזוריים בהפעלה הסלולר הם חשובים באותה מידה וניתן ללכוד באמצעות שיטה זו. מדמיין יותר משני fluorophores על מיקרוסקופ multiphoton בו זמנית ברגע זה בלתי אפשרי ניתן ההתקנה, לכן, מגבלה של שיטה זו היא כי משתמשים רק מסוגלים תמונה שני fluorophores לעומת ציוד דימות אחרים שבו 4 fluorophores או יותר מסוגלים להיות דמיינו בו31. באופן כללי, הפרוטוקול המתואר הוא ספציפי למטרות המעבדה שלנו ומספק כלי שימושי בזיהוי הפעלה תאית שבה האפשרויות הנסיוניות גוברות על מגבלות הפרוטוקול.

השיטות המתוארות בכתב יד זה מספקות מספר יתרונות על פני שיטות קיימות כדי להמחיש את הפעלת התאים. הראשון להיות כי הניסויים שבוצעו כאן הם בvivo, המאפשר הדמיה בזמן אמת של כריכת תאים ולמעלה לקיחת מולקולות אשר מעיד ישירות על הפעלה ספציפית לגבי עלבון. הדבר מספק יתרונות על פני שיטות אחרות כגון טכניקות הדמיה מסורתיות של תא חי, מכיוון שאנו מסוגלים לשמר את הסביבה של התאים אשר מפחיתה באופן משמעותי את הסבירות של תוצאות מייסדים עקב היפרפרביליות וחוץ רחמי פעילות של תאים הקשורים לטראומה של הדיסוציאציה32. בנוסף, השימוש של מיקרוסקופ multiphoton בהגדרה זו ניסיוני מקטין את הקצב שבו fluorophores צילום-אקונומיקה המאפשר מפגשים רציפה ובאופן משמעותי יותר הדמיה אשר חשוב אם המשתמש מחיל שיטה זו ללימודים חקירת קצב מטבוליזם או הפעלה ארוכת טווח33. לבסוף, אם סוגי העניין של התא נמצאים עמוק בתוך הרקמה (> 100 מ"מ) באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטון יש צורך להשיג אות אופטימלית34. בסך הכל, אם המטרה של הניסוי של המשתמש היא ללמוד ספיגה בזמן אמת והפעלה של תאים בתגובה להעליב אז באמצעות שני-פוטון מיקרוסקופ יחד עם קווי הכתב הטרנסגניים מתאים יותר על טכניקות אחרות לדמיין קונבנציונאלי.

טכניקה זו מאפשרת למשתמשים לבצע לימודי אורך על מגוון רחב של סוגי תאים ביחס להפעלה, תנועתיות ואינטראקציות תא לתאים. היתרון של טכניקה זו היא כי היא מאפשרת למשתמשים להשתמש גנטית שלהם מתויג בעלי חיים דיווחו ולהחליף את המולקולה fluorescently מתויג כדי להתאים את תחומי המחקר שלהם (g., Tie2cre עבור תאים אפיתל). פרוטוקול זה אינו מוגבל ההתקנה הספציפית המוצגת בניסויים שלנו יכול להיות שונה מאוד כדי להתאים את הצרכים של כל מעבדה ניצול הכתב הגנטי הדמיה 2-פוטון בלימודים שלהם. אנו מתכננים להשתמש בגישה זו כדי לזהות הפעלה וגיוס של תאים חיסוניים לאתר של פציעה בעקבות טראומה היקפית ולקבוע מה מסלול הזמן הספציפי של הפעלה וגיוס הוא כך שנוכל להבין טוב יותר מה הגישה הטובה ביותר היא לtherapeutics מניעתי היא ביחס לצורות שונות של כאב.

לסיכום, פיתחנו טכניקה הרומן המאפשר למשתמשים ספיגת תמונה של fluorescently מתויג LPS על ידי tdTomato-מתויג העורי בTLR4 באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המענק NS096030 (MDB). בנוסף, אנו רוצים להודות למנהל ליבת ההדמיה Prakash. אנחנו גם רוצים להודות האולימפוס דיסקברי מרכז/הדמיה ליבה מתקן ב UT דאלאס לאספקת ציוד ותמיכה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS, 4 L Fisherbrand BP3994
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe Hamilton 80501
BD Precision Glide Needle 30G VWR 305106
Blue Pad Fisherbrand 1420665
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) Olympus FV30-FGR
Isoflurane, USP 250 mL Vedco 50989-150-15
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate Sigma-Aldrich F3665-1MG
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL VWR 20170-333
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN Olympus MPE-RS TWIN
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD Olympus XLPLN25XWMP2
Personal Lubricant Jelly (Gel) equate ZH727 2E F1
SGM-4 Stereotaxic Apparatus Narishige 16030
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  2. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
  3. Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
  4. Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
  5. Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
  6. Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
  7. Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
  8. Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
  9. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  10. Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
  11. Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
  12. Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  13. Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
  14. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  18. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  19. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  20. Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
  21. Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
  22. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  23. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
  24. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
  25. Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
  26. Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  27. Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
  28. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  29. Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
  30. Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
  31. Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
  32. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  33. Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
  34. Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 149 הדמיה רב-פוטון קולטן שיחת טלפון 4 גנטית כתב ליפופוליסכד ב vivo
ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M.,… More

Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M., Andrew, A. T., Burton, M. D. In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin. J. Vis. Exp. (149), e59647, doi:10.3791/59647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter