Summary
Morfologiska förändringar sker i immun responsiva fibroblastceller efter aktivering och främja förändringar i cellulära rekrytering. Använda 2-Photon Imaging i samband med en genetiskt modifierade fibroblast-specifika protein 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-Stop-floxed (TB/TB) mus linje och grön Fluorescent taggade lipopolysackarid-FITC, vi kan illustrera mycket specifik upptag av lipopolysackarid i dermal fibroblaster och morfologiska förändringar in vivo.
Abstract
Fibroblaster är mesenkymala celler som ändrar sin morfologi vid aktivering, i slutändan påverkar mikromiljön i vävnaden de är placerade i. Även om traditionella avbildningstekniker är användbara för att identifiera proteininteraktioner och morfologi i fast vävnad, de kan inte ge insikt om hur snabbt celler kan binda och upptag proteiner, och en gång aktiverat hur deras morfologi förändringar i Vivo. I den nuvarande studien, frågar vi 2 stora frågor: 1) Vad är tiden-loppet av fibroblast aktivering via Toll-liknande receptor-4 (TLR4) och lipopolysackarid (LPS) interaktion och 2) hur dessa celler beter sig när aktiverad? Med hjälp av 2-Photon Imaging, har vi utvecklat en ny teknik för att bedöma förmågan hos LPS-FITC att binda till sin besläktat receptor, TLR4, uttryckt på perifera fibroblaster i den genetiska reporter mus linjen; FSP1cre; tdTomatoLOX-stopp-LOX in vivo. Detta unika tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att skapa djupgående, tidsfördröjd video och/eller bilder av proteiner som interagerar med levande celler som gör att man kan ha en ökad nivå av granularitet i förståelsen av hur proteiner förändrar cellernas beteende.
Introduction
Lipopolysackarid (LPS) är ett endotoxin som finns i det yttre membranet av gramnegativa bakterier1. LPS har en hög bindningsaffinitet för den avgiftsbelagda receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor Complex2. TLR4 är ett mönsterigenkänning receptor vanligt förekommande på det yttre membranet i ett brett spektrum av immunceller, mesenkymala celler, och en delmängd av sensoriska nervceller3,4,5. Aktivering av TLR4 uttrycks på immunceller leder till MyD88-beroende och oberoende andra Messenger-system, slutar med nukleär faktor kappa beta (nfκb) flyttning till kärnan av cellen. Detta orsakar vänlighet immunceller att producera och släppa pro-inflammatoriska cytokiner såsom interleukin (Il) -1 β, IL-6, och TNF-α6. Hur andra celltyper reagerar på TLR4 stimulering är dock inte lika tydlig. Fibroblaster har varit inblandade i ett brett spektrum av patologier såsom cancer och cystisk fibros och har nyligen visat sig spela en roll monocyt chemo-attraktion och främja inflammation7,8,9. Vårt labb är intresserad av rollen av fibroblaster i utvecklingen av akut och kronisk smärta, som tidiga belägg tyder på att faktorer som frigörs genom fibroblaster (Matrix metalloproteinaser (MMPs), vävnads hämmare av metalloproteinaser (TIMPs), och fibroblast tillväxtfaktorer (FGFs)) är involverade i neuropatisk smärta10.
Aktiveringstillstånd av celler kan bestämmas av en mängd faktorer som inkluderar: induktion av omedelbara tidiga gener, förändrat proteinuttryck, cellproliferation, och morfologiska förändringar11,12,13. Det finns många tekniker som finns för att besvara frågor vi kan ha om hur aktivering av celler bidrar till patologier, men de har alla sina begränsningar. Prototypiska immunohistokemi använder fluorescerande märkta antikroppar för att märka proteiner av intresse för fast vävnad, som kan vara ospecifik och ofta kräver betydande felsökning innan ger fruktbara resultat14. Western blotting är en användbar teknik när man jämför nivåer av proteinuttryck i post-mortem vävnad; den histologiska komponenten saknas dock i denna teknik och forskarna kan inte identifiera några förändringar i morfologin15. RNA-SEQ tillåter oss att kvantifiera närvaron av Messenger-RNA i ett prov som i många fall ger insiktsfulla data; men klyftan mellan transkription och översättning gör det svårt att ha temporala upplösning efter en stimulans16. Konfokal avbildning är användbart vid bestämning av uttryck och samlokalisering av proteiner som finns i ett tvärsnitt av vävnader17. Ofta är detta inte representativt för hela vävnadsprovet. Multifotonmikroskop gör det däremot möjligt för användare att avbilda ungefär 1 mm djupt in i ett prov, vilket skapar en omfattande tredimensionell representation18. Därför väljer vi att fokusera på in vivo, 2-Photon Imaging Preps, som data som samlats in från dessa experiment är mer direkt relatable till mycket plast och sammankopplade mikromiljö av levande vävnad.
En fördel med att studera protein receptor interaktioner in vivo är att vi tydligt kan fånga hur celler reagerar på en stimulans, realtid, i sin egen miljö utan den skadliga och oförutsägbara påverkan av post-mortem vävnad utvinning19. Dessutom kan longitudinella studier utföras för att bedöma cellulär plasticitet och priming som kan uppstå på grund av aktivering. Med hjälp av 2-Photon Imaging, bevarar vi integriteten i den mikromiljö som finns när en extern stimulans tillämpas. Detta protokoll ger ett sätt att identifiera upptaget av molekyler i fibroblaster efter perifer injektion av Fluorescent märkta LP-skivor under loppet av flera timmar in vivo och rollen av TLR4 i fibroblast aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök godkändes av University of Texas vid Dallas institutionella djuromsorg och användning kommitté och var i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer. Alla experiment utfördes med 8-12-veckors gamla manliga och kvinnliga möss bred in-House på en C57BL/6 bakgrund. Transgena möss med CRE-driver drivs av fibroblast-specifika protein-1 promotorn köptes kommersiellt (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- och korsas med tdtomatoLOX-Stop-LOX möss, även köpt kommersiellt ( Jackson, 007914) och (FSP1cre)+/- ; tdTomatoLOX-stopp-LOX och FSP1cre-/-; tdTomatoLOX-Stop-LOX möss var uppfödda i egen hus på en C57BL/6 bakgrund (figur 1a, B, C). Fibroblast-specifikt protein 1 är ett endogent protein som uttrycks på ungefär 72% av fibroblast och representerar en effektiv CRE-drivrutin i dermal vävnad20. Möss var grupp inhysta och givet AD libitum tillgång till mat och vatten. Rumstemperaturen bibehölls vid 21 ± 2 ° c. Medan vi använde C57BL/6 korsade manliga och kvinnliga möss vid 8-12 veckor, vi tror inte att ålder, kön, eller genetisk bakgrund är nödvändiga krav för att köra multiphoton experiment. Möss var djupt sövda omedelbart efter försöket och euthanized.
1. beredning av läkemedel
- Bered en 5 μg/20 μL lösning av lipopolysackarid-FITC (se tabell över material) i steril 1x PBS (pH 7,4). Virvel stamlösningen på medelhög intensitet för minimalt 30 sekunder för att säkerställa homogen blandning för en jämn koncentration genom hela lösningen innan pipettering (LPS är en klibbig molekyl).
Obs: Placera inte LPS i en glasbehållare, om möjligt, Använd silikoniserade mikrocentrifugrör. Håll på is tills användning.
2. bilduppsättning
- Ställ in multiphoton-systemet (se tabell över material) för tvåfärgs avbildning. Detta kräver användning av två separata excitation lasrar (se tabell över material), en GFP/RFP filter kub set (se material tabell), och en 25x (1,05 na) vatten-nedsänkning mål (se tabell över material).
Obs: användare kan ändra dessa inställningar för att bättre passa alternativa konfigurationer och multiphoton Mikroskop kapacitet. Dessa är de parametrar som används i experiment protokollet. Se tabell över material för specifika detaljer. - Placera en stereotaxic-apparat (se tabell över material) på scenen i multiphoton-mikroskopet. Anslut detta till en anestesi leverans maskin (se tabell över material) för att säkerställa att djuren är sövda under hela experimentet. Placera en bit matt svart papper på ytan av apparaten som en anslutningspunkt för musen tass.
- Välj resonant scanner med en fast skanningsyta på 512 μm x 512 μm.
Anmärkning: utför inte experiment i detta protokoll med hjälp av en galvanometer scanner. På grund av den långsammare samplingsfrekvens, kommer det att finnas snedvridning i z-stack Time-lapse videor på grund av andningen av djuret som är oundvikligt. - Tune de två excitation lasrar till excitation våglängder av GFP och RFP, 930 nm och 1100 nm respektive, och rikta ljusbanan för både excitation lasrar till det enda målet med hjälp av en Dichroic spegel 690-1050 nm tillåter 930 nm-tuned excitation laser reflekteras till huvud skannern och 1 100 nm-trimmad laser för att passera direkt in i huvud skannern (figur 2).
Obs: det är möjligt att förändra dessa excitation våglängder beroende på användarens inställning. - Ställ in laser kraften hos FITC till 5% och GFP till 20%.
Obs: denna inställning ger en optimal signal-brus-förhållande (SNR) i dessa experiment. Detektera signal via multi-alkali Fotomultiplikatorrör (PMTs); men GaAsP detektorer kan användas i stället i mycket hög känslighet experiment. - Förbered rummet för avbildning under mörka förhållanden utan ströljus.
3. in vivo Imaging
- Placera musen i induktions kammaren i anestesi leveranssystemet och Använd 5% isofluran (se tabell över material) vid en 2 L/min flödeshastighet av syre för att placera musen under djup anestesi.
Obs: det rekommenderas starkt att bära all lämplig personlig skyddsutrustning under experimentet.- Flytta musen till stereotaxic apparat med tillgång till en näsa kon för att bibehålla anestesi hela experimentet. Minska isofluran till 1,5%-2% och behåll flödeshastigheten konstant.
-
Fast fästa Hind Paw till en bit svart papper med svart tejp på områden både proximala och distala till området av intresse (Detta minskar effekterna av mus andning på bildkvalitet), att se plantar yta av tass är fri och vänd upp mot målet. Se till att huvudet på musen är stabil i näsan kon ansluten till apparaten.
Obs: övervaka musen för eventuella tecken på ångest eller uttorkning under experimentet och justera isofluran därefter.
- Placera en generös mängd sterilt vattenbaserat smörjmedel (gel, se tabell över material) på plantar yta av Paw och vidrör målet till det för att skapa en kolumn av vätska mellan tass och mål.
- Använd FITC excitation ljus att fokusera på dermal skiktet av tass. Se till att tdTomato-märkta fibroblaster visualiseras innan du fortsätter på (detta steg är viktigt för att fastställa rätt fokalplan till bild).
Anmärkning: dermal skiktet av tass är ca 100-150 μm i tass. - Bildområdet av celler som ligger strax under plantar yta av baktass med både 930 nm och 1100 nm-trimmad lasrar och få en 15-minuters tidsfördröjning på ca 5-10 z-skivor på cirka 1 μm per skiva för att upprätta en representation av miljön före injektion med LPS-FITC.
- Utför en intraplantar injektion av 5 μg/20 μL LPS-FITC på musens baktass med hjälp av en 25 μL glas Hamilton spruta (se tabell över material) och 30g nål (se tabell över material), noga med att inte störa positionen av tass.
- Bild ett område av celler som ligger strax under plantar yta av baktass med både 930 nm och 1100 nm-trimmad lasrar och förvärva en 60-120 minuters tidsfördröjning på ca 5-10 z-skivor på cirka 1 μm per skiva för att identifiera upptaget av LPS-FITC av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inledningsvis injicerade vi LPS-FITC i Hind-Paw av Wild-typ möss för att visualisera upptaget av LPS-FITC i alla celltyper som finns i dermal skiktet av tass. Efter att ha observerat en myriad av celler i dermal skikt av hind Paw upptag Fluorescent-märkta LP-skivor i en vild typ mus (video bild 1, 2), försökte vi att specifikt rikta fibroblaster eftersom de är ett primärt fokus i vår forskning. Före avbildning av tassar av djur injiceras med LPS-FITC vi ville vara tydlig att det inte finns någon inneboende fluorescens av celler i dermal skiktet. Detta för att säkerställa att efter injektion, de bilder vi tar är sanna interaktioner av celler med Fluorescent-märkta LP-skivor och inte någon avbildning artefakter (video bild 3, 4). Efter LPS-FITC injektion, endast FSP1+ fibroblaster uttrycker TLR4 binda och upptag det injicerade proteinet, med en hög nivå av co-lokalisering med tdTomato taggen uttrycks av dessa celler (video figur 5). I motsats, möss som har TLR4 utslagen ur hela kroppen (TLR4Ko) binder inte och upptag LP-skivor efter injektion. Som framgår av videon, silhuetter av celler är synliga efter LPS-FITC injektion som indikerar att drogen är dispergering i interstitiell vätska runt celler men är faktiskt inte bunden av en receptor (video figur 6).
För att sammanfatta våra resultat, visar vi, in vivo, att efter injektion av LPS-FITC, i en FSP1cre; tdTomatoLOX-Stop-LOX cellspecifika återaktiverade djur endast fibroblaster interagera med och upptag LP-skivor. I motsats, hela kroppen Knockouts av TLR4 binder inte och upptag LPS-FITC efter injektion.
Figur 1 . tdtomato uttrycks endast i FSP1+ fibroblaster i ett CRE-beroende sätt. A) FSP1cre transgena möss föds upp på en C57BL/6 bakgrund korsas med tdTomato möss föds upp på en C57BL/6 bakgrund för att generera möss uttryckt TDTOMATO i FSP1+ fibroblast i en CRE-beroende sätt. B) representativa PCR-resultat som skildrar både positiva och negativa FSP1cre möss som uttrycker tdTomato. C) representativ piktgraf av dermal fibroblaster i extracellulära rymden ligger i musen Paw. FSP1+ möss uttrycker ett rött fluorescerande protein endast i fibroblaster medan FSP1- möss inte. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Ljus Stig av två-färg 2-Photon Mikroskop. Skildringen av ljusbanan som inrättats för 2-Color 2-Photon experiment inrättas. Laser 1 är inställd på 930 nm att excitera FITC-konjugerade LP-skivor och laser 2 är inställd på 1100 nm att excitera tdTomato finns i fibroblaster. Excitation ljus från laser 1 reflekteras av Dichroic Mirror (690-1050 nm) medan excitation ljus från laser 2 passerar fram till huvud skannern. Excitation ljus från båda lasrar reflekteras av en uppsättning speglar till en andra Dichroic spegel (650 Nm) tillåter excitation ljus att passera genom målet och in i vävnaden för att excitera fluoroforer. Ljus avges från upphetsad fluoroforer och fångas upp av 25x mål och reflekteras av Dichroic Mirror (650) till multi-alkali Fotomultiplikator rören. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Experimentell flödesschema av 2-Photon mikroskopi. Möss är sövda och immobiliserade med hjälp av ett lågt flöde anestesisystem och stereotaxic apparat. Den plantar ytan av tass ansikten målet och är avbildad i 15 minuter. Intraplantar injektion av 5 μg/20 μL LPS-FITC utförs på sövda musen och tass är sedan avbildas för en tid som krävs för målet med experimentet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video bild 1. Z-stack videor av LPS-FITC upptag i celler i vild typ C57BL/6 möss. Z-stack video av dermal skikt av bakbenen av en C57BL/6 mus innan LPS-FITC injektion. Den plantar aspekten av en vild typ mus Paw var avbildas i 15 minuter före injektion med LPS-FITC att kontrollera för autofluorescence produceras i GFP kanalen. Det finns lite att ingen signal i GFP-kanalen indikerar ingen autofluorescence. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video bild 2. Z-stack video av dermal skikt av bakbenen av en C57BL/6 mus efter LPS-FITC injektion. Den plantar aspekten av en vild typ mus Paw var avbildas för 1,5 timmar efter LPS-FITC injektion för att visualisera upptaget av LPS-FITC av alla celler som uttrycker TLR4. Som framgår av videon, en mängd celler binda och upptag LPS-FITC hela loppet av experimentet. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video bild 3. Z-stack video av dermal skikt av baktass av en FSP1cre; tdTomato mus innan LPS-FITC injektion. Den plantar aspekten av en FSP1cre; tdTomato mus Paw var avbildad i 15 minuter före injektion med LPS-FITC att kontrollera för autofluorescence produceras i GFP-kanalen. Det finns lite att ingen signal i GFP-kanalen indikerar ingen autofluorescence. tdTomato-positiva fibroblaster visualiseras. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video bild 4. Z-stack video av dermal skikt av hind Paw av en TLR4Ko mus innan LPS-FITC injektion. Den plantar aspekten av TLR4Ko mus Paw var avbildad i 15 minuter före injektion med LPS-FITC att kontrollera för autofluorescence produceras i GFP kanalen. Det finns lite att ingen signal i GFP-kanalen indikerar ingen autofluorescence. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video bild 5. Z-stack video av dermal skikt av baktass av en FSP1cre; tdTomato mus efter LPS-FITC injektion. Den plantar aspekten av en FSP1cre; tdTomato mus Paw var avbildad för 1,5 timmar efter LPS-FITC injektion för att visualisera upptaget av LPS-FITC av tdTomato-positiva fibroblaster uttrycker TLR4. Som framgår av videon, mycket specifikt upptag av LPS-FITC via TLR4 uttrycks på tdTomato-positiva fibroblaster ses. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video bild 6. Z-stack video av dermal skikt av bakbenen av en TLR4Ko mus efter LPS-FITC injektion. Den plantar aspekten av en TLR4Ko mus Paw var avbildas för 1,5 timmar efter LPS-FITC injektion för att visualisera om upptaget av LPS-FITC av celler i en hel-Body knockout av TLR4 är möjligt. Som framgår av videon, inget upptag av LPS-FITC ses av cellen i dermal skikt av baktass. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmodligen de viktigaste stegen i in vivo 2-Photon Imaging är: 1) att välja rätt genetisk reporter mus och fluorescently-märkta protein för multi-Photon setup och experimentella behov21,22; 2) avbildning av rätt fokalplan för att få en korrekt representation av populationen av celler i vävnaden23; 3) minimera rörelse på grund av ett felaktigt immobiliserat djur24; och 4) välja när data ska analyseras kvalitativt kontra kvantitativt25,26,27. Se till att ta itu med dessa punkter innan du påbörjar ett experiment kommer att ge kunskap för att samla in data som är både reproducerbara och vetenskapligt rigorösa.
En viktig faktor i protokollet är att man på ett korrekt sätt immobiliserar regionen för att avbildas. Andning från djuret orsakar minut förskjutningar i fokalplanet under avbildning och när du utför z-stack och Time-lapse video, detta orsakar betydande snedvridning i videon och kan negativt påverka kvaliteten på data som produceras. Se till att Paw är ordentligt immobiliserade kommer att möjliggöra framgångsrik avbildning av Paw utan avbrott från andning. Dessutom är att veta lokalisering av celler i experimentet ett kritiskt steg i att identifiera rätt fokalplan för att visualisera. Eftersom vi valde att fokusera på dermal fibroblaster, behöver vi bara bilden en relativt kort sträcka i tass för att kunna visualisera våra celltyper av intresse (~ 100-150 μm). I andra experiment, det är viktigt att överväga funktionerna i Mikroskop och mål en använder eftersom utföra ett experiment till bildceller djupt inne i vävnaden kan vara utmanande att omöjligt med tanke på de användare som inrättats. Slutligen, att välja hur man ska närma sig dataanalys är en viktig faktor i de sista stegen i experimentet. Här visar vi att fibroblaster uttrycker TLR4 kan upptag och binda Fluorescent-märkta LP-skivor som framgår av robust Co-lokalisering av grönt (LPS) och röd (tdTomato uttryckt av fibroblaster) i videorna. Även om ingen kvantitativ bildanalys görs i det här protokollet finns det en mängd olika sätt som en användare kan tolka data som samlats in från det här protokollet. Den första är en enkel Co-lokalisering analys med öppen källkod för att mäta intensiteten av två distinkta färger i en given pixel28. Detta gör det möjligt för användaren att identifiera om två Exciterade fluoroforer upptäcks på en given pixel i en förvärvad bild eller video och hur mycket av denna överlappning det finns i ett visst utrymme. Detta är användbart för att identifiera om cellerna av intresse interagerar med viss kapacitet med den injicerade molekylen. En alternativ metod för kvantitativ analys är fluorescensintensitet29. Användaren kan samla in information om intensiteten av en given signal i en cell av intresse. Data som samlats in från dessa analyser kan indikera hur celler kan ta olika mängder av en molekyl i jämförelse med andra. Dessa metoder för dataanalys är ett exempel på hur användaren kan försöka analysera data som samlats in från ett experiment som liknar det som utfördes i detta protokoll.
Våra genetiska modeller tillåter oss att selektivt Fluorescent tagg (tdTomato) FSP1+ fibroblaster i en CRE/loxP-beroende sätt, vilket möjliggör snabb och enkel visualisering av celler i dermis av huden. Även om detta gör visualiserande celler lätt på grund av deras inneboende fluorescens, är det möjligt att genomföra 2-Photon Imaging utan genetiskt märkta celler om användaren har erfarenhet av att bestämma övergången från epidermis till dermis. Använda robusta nivåer av autofluorescence från håret på huden kan vara en användbar indikator på var användaren fokuserar och riktningen man behöver för att flytta in för att få önskad fokalplan. Detta uppenbarligen kommer bara att fungera om fokalplanet av intresse i nära huden och kommer inte cellen av intresse är djupt inne i vävnaden.
Att spåra ett fokalplan genom experimentet är idealiskt; men på grund av andningen av ett levande djur, det gör det svårt att förhindra ram Skift över tid när införliva z-staplar i ett tidsförlopp experiment. För att felsöka problemet kan användaren överväga att minska bildkvaliteten genom att minska linje medelvärdet när du använder en resonant scanner och öka samplingsfrekvensen. Som tidigare nämnts är det nästan omöjligt att använda en traditionell galvanometer scanner i ett experiment där en z-stack och tidsförlopp införlivas på grund av den långsammare samplingsfrekvens av skannern.
Ändra varaktigheten av bild förvärv kan tillåta användaren att bättre passa behoven hos deras experiment. Medan avbildning djuret under längre tid tillåter användaren att samla in data genom alla steg i molekylens endocytos och metabolism, förkorta tiden till bilden endast specifika delar av processen kommer att öka effektiviteten. Det är möjligt att bilden under en kortare tid (~ 1-15 minuter) för att identifiera molekyl fastsättning, en längre tidsperiod (~ 15-30 minuter) för att visualisera receptor-ligand endocytos30, och hela varaktigheten (~ 30-60 minuter) för att visualisera cellulära aktivering och potentiell metabolism av molekylen. Detta är starkt anhörigen emellertid på den injicerade molekylen, och cellerna visualiserades (figurera 3).
En viktig anmärkning i det experimentella protokollet som beskrivs i detta manuskript är att vi för närvarande inte kan avbilda identiska provområden före och efter injektionen. Detta beror på arten av installationen och metoden för läkemedelsleverans. Emellertid, vi har möjlighet att spåra celler från en tid tidigt efter injektion i flera timmar. Även om det är viktigt att hålla reda på enskilda celler under experimentet, är regionala Skift i cellulära aktiveringen lika viktiga och kan fångas med den här metoden. Visualisera mer än två fluoroforer på ett multiphoton Mikroskop samtidigt för tillfället är omöjligt med tanke på installationen, därför är en begränsning av denna metod att användarna bara kan bild två fluoroforer i motsats till annan bildutrustning där 4 eller fler fluoroforer kan visualiseras samtidigt31. Sammantaget är det beskrivna protokollet specifikt för målen för vårt labb och tillhandahåller ett användbart verktyg för att identifiera mobil aktivering där de experimentella möjligheterna överväger protokollets begränsningar.
De metoder som beskrivs i detta manuskript ger ett antal fördelar jämfört med befintliga metoder för att visualisera aktiveringen av celler. Den första är att de experiment som utförs här är in vivo, vilket möjliggör realtid visualisering av celler bindning och upp tar molekyler som är direkt tecken på aktivering specifikt i fråga om en förolämpning. Detta ger fördelar jämfört med andra metoder såsom traditionella Live-cell Imaging tekniker eftersom vi kan bevara miljön i cellerna som avsevärt minskar sannolikheten för störande resultat på grund av hyperexcitabilitet och ektopisk aktivitet av celler relaterade till trauma dissociation32. Dessutom minskar användningen av en multiphoton Mikroskop i denna experimentella inställning den hastighet med vilken fluoroforer foto-blekmedel möjliggör kontinuerlig och betydligt längre bildbehandling sessioner som är viktigt om användaren tillämpar denna metod för studier undersöka graden av metabolism eller långsiktig aktivering33. Slutligen, om de celltyper av intresse bor djupt inom vävnaden (> 100 mm) med hjälp av en multiphoton Mikroskop är nödvändigt för att få optimal signal34. Sammantaget, om målet med en användares experiment är att studera realtid upptag och aktivering av celler som svar på en förolämpning sedan med hjälp av två-Photon mikroskopi tillsammans med transgena reporter linjer är mer lämpade över andra konventionella föreställa tekniker.
Denna teknik tillåter användare att utföra longitudinella studier på en mängd olika celltyper när det gäller aktivering, motilitet, och cell-till-cell interaktioner. Fördelen med denna teknik är att den tillåter användare att använda sina egna genetiskt märkta rapporterade djur och ersätta den Fluorescent-märkta molekylen för att passa deras forskningsintressen (t. ex., Tie2cre för epitelceller). Detta protokoll är inte begränsat till de specifika inställningar som visas i våra experiment och kan vara mycket modifierad för att passa behoven hos alla labb med hjälp av genetiska reporter linjer och 2-Photon dermal Imaging i sina studier. Vi planerar att använda denna metod för att identifiera aktivering och rekrytering av immunceller till platsen för skadan efter perifer trauma och avgöra vad den specifika tidsförloppet för aktivering och rekrytering är så att vi bättre kan förstå vad det bästa tillvägagångssättet är för förebyggande Therapeutics är i hänseende till olika former av smärta.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en ny teknik som tillåter användare att bild upptaget av Fluorescent-märkta LP-skivor av tdTomato-märkta dermal fibroblaster uttrycker TLR4 med hjälp av 2-Photon mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Grant NS096030 (MDB). Vi skulle också vilja tacka Imaging Core Manager ved Prakash. Vi skulle också vilja tacka Olympus Discovery Center/Imaging Core facility på UT Dallas för att tillhandahålla utrustning och support
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
