Summary
Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in vivo illustreren.
Abstract
Fibroblasten zijn mesenchymale cellen die hun morfologie veranderen bij activering, wat uiteindelijk invloed heeft op de micro omgeving van het weefsel waarin ze zich bevinden. Hoewel traditionele beeldvormingstechnieken nuttig zijn bij het identificeren van eiwit interacties en morfologie in vast weefsel, zijn ze niet in staat om inzicht te geven in hoe snel cellen kunnen binden en opname van eiwitten, en eenmaal geactiveerd hoe hun morfologie veranderingen in Vivo. In de huidige studie, vragen we 2 belangrijke vragen: 1) wat is de tijd-loop van fibroblast activering via Toll-achtige receptor-4 (TLR4) en lipopolysaccharide (LPS) interactie en 2) Hoe gedragen deze cellen zich eenmaal geactiveerd? Met behulp van 2-Photon Imaging hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld om het vermogen van LPS-FITC te beoordelen om te binden aan zijn verwant receptor, TLR4, uitgedrukt op perifere fibroblasten in de genetische reporter muis lijn; FSP1cre; tdTomatoLox-stop-Lox in vivo. Deze unieke aanpak stelt onderzoekers in staat om diepgaande, timelapse-Video's en/of Foto's van eiwitten te creëren die interactie vertonen met levende cellen, waardoor men een groter granulariteit kan hebben in het begrijpen hoe eiwitten cellulair gedrag kunnen veranderen.
Introduction
Lipopolysaccharide (LPS) is een endotoxine gevonden in het buitenste membraan van gram-negatieve bacteriën1. LPS heeft een hoge bindingsaffiniteit voor de tol-achtige receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor complex2. TLR4 is een patroon herkennings receptor die vaak voorkomt op het buitenste membraan van een breed scala aan immuuncellen, mesenchymale cellen en een subset van sensorische neuronen3,4,5. Activering van TLR4 uitgedrukt op immuuncellen leidt tot MyD88 afhankelijke en onafhankelijke tweede Messenger systemen, eindigend met Nuclear-factor Kappa Beta (NFκB) translocatie naar de kern van de cel. Dit zorgt ervoor dat de prototypische immuuncel pro-inflammatoire cytokines produceert en vrijgeeft, zoals Interleukine (IL) -1 β, IL-6 en TNF-α6. Echter, hoe andere celtypes reageren op TLR4 stimulatie is niet zo duidelijk. Fibroblasten zijn betrokken geweest bij een breed scala aan pathologieën zoals kanker en Cystic fibrose en hebben onlangs aangetoond dat het een rol speelt monocyt chemo-aantrekkingskracht en het bevorderen van ontstekingen7,8,9. Ons lab is geïnteresseerd in de rol van fibroblasten bij de ontwikkeling van acute en chronische pijn, als vroeg bewijs suggereert dat factoren vrijkomen door fibroblasten (matrix matrixmetalloproteïnases (mmps), weefsel remmer van matrixmetalloproteïnases (timps), en fibroblast groeifactoren (FGFs)) zijn betrokken bij neuropathische pijn10.
De activerings toestanden van cellen kunnen worden bepaald door een verscheidenheid aan factoren, waaronder: inductie van direct-vroege genen, veranderde eiwit expressie, celproliferatie en morfologische veranderingen11,12,13. Er zijn veel technieken die bestaan om vragen te beantwoorden over hoe activering van cellen bijdraagt aan pathologieën, maar ze hebben allemaal hun beperkingen. Prototypische immunohistochemie gebruikt fluorescently gelabelde antilichamen tegen etiket eiwitten van belang in vast weefsel, die mogelijk onspecifiek zijn en vaak aanzienlijke probleemoplossing vereisen voordat ze vruchtbare resultaten opleveren14. Western blotting is een nuttige techniek bij het vergelijken van niveaus van eiwit expressie in postmortemweefsel; echter, de histologische component ontbreekt in deze techniek en onderzoekers zijn niet in staat om veranderingen in de morfologie te identificeren15. RNA-SEQ stelt ons in staat om de aanwezigheid van Messenger RNA te kwantificeren in een monster dat in veel gevallen inzichtelijke gegevens oplevert; echter, de kloof tussen transcriptie en vertaling maakt het moeilijk om de temporele resolutie na een stimulus16. Confocale beeldvorming is nuttig bij het bepalen van de expressie en de co-lokalisatie van eiwitten die bestaan in een dwarsdoorsnede van weefsels17. Vaak is dit niet representatief voor het geheel van het weefselmonster. Daarentegen kunnen gebruikers met multiphoton-microscopen ongeveer 1 mm diep in een steekproef afbeellen, waardoor een uitgebreide driedimensionale representatie18ontstaat. Daarom kiezen we ervoor om zich te concentreren op in vivo, 2-Photon Imaging Preps, omdat de gegevens die worden verzameld uit deze experimenten meer rechtstreeks relatable zijn aan de zeer plastic en onderling verbonden micro-omgeving van levend weefsel.
Een voordeel van het bestuderen van eiwit-receptor interacties in vivo is dat we duidelijk kunnen vastleggen hoe cellen reageren op een stimulus, real-time, in hun eigen omgeving zonder de schadelijke en onvoorspelbare invloed van postmortemingsweefsel extractie19. Bovendien, longitudinale studies kunnen worden uitgevoerd om te beoordelen van de cellulaire plasticiteit en priming die kunnen optreden vanwege activering. Met behulp van 2-Photon Imaging, behouden we de integriteit van de micro omgeving aanwezig wanneer een externe stimulans wordt toegepast. Dit protocol biedt een manier om de opname van moleculen in fibroblasten te identificeren na perifere injectie van fluorescendig gelabelde LPS in de loop van enkele uren in vivo en de rol van TLR4 bij de activering van fibroblast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Texas bij Dallas institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité en waren in overeenstemming met de nationale instituten voor gezondheids richtlijnen. Alle experimenten werden uitgevoerd met 8-12-week-oude mannelijke en vrouwelijke muizen gefokt in-House op een C57BL/6 achtergrond. Transgene muizen met CRE-of aangedreven door de Fibroblast-specifieke proteïne-1-promotor werden commercieel aangekocht (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- en gekruist met tdtomatoLox-stop-Lox -muizen, ook commercieel aangekocht ( Jackson, 007914) en (FSP1cre)+/- ; tdTomatoLox-stop-Lox en FSP1cre-/-; tdTomatoLox-stop-Lox -muizen werden in eigen huis gefokt op een C57BL/6-achtergrond (Figuur 1a, B, C). Fibroblast-specifiek proteïne 1 is een endogeen eiwit, uitgedrukt op ongeveer 72% van de Fibroblast en vertegenwoordigt een effectieve CRE-driver in het dermale weefsel20. Muizen waren ondergebracht in een groep en kregen ad libitum toegang tot voedsel en water. De kamertemperatuur werd gehandhaafd op 21 ± 2 °C. Terwijl we gebruikten C57BL/6 gekruiste mannelijke en vrouwelijke muizen op 8-12 weken, we geloven niet dat de leeftijd, geslacht, of genetische achtergrond zijn noodzakelijke vereisten voor het uitvoeren van multiphoton experimenten. Muizen werden direct na het experiment grondig verdomaliseerd en geëeuthaneerd.
1. bereiding van geneesmiddelen
- Bereid een 5 μg/20 μL-oplossing van lipopolysaccharide-FITC (Zie tabel van de materialen) in steriele 1x PBS (pH 7,4). Vortex de stockoplossing met een gemiddelde intensiteit van minimaal 30 seconden om een homogene menging te garanderen voor een gelijke concentratie in de gehele oplossing vóór het pipetteren (LPS is een glutineus molecuul).
Opmerking: plaats geen LPS in een glazen container, gebruik indien mogelijk Gesiliconiseerde microcentrifuge buizen. Blijf op ijs tot het gebruik.
2. Imaging-opstelling
- Stel het multiphoton-systeem in (Zie tabel met materialen) voorbeeld bewerking in twee kleuren. Dit vereist het gebruik van twee afzonderlijke excitatie lasers (Zie tabel van materialen), een GFP/RFP filter kubus set (Zie materiaal tabel), en een 25x (1,05 na) water-onderdompeling doelstelling (Zie tabel van de materialen).
Opmerking: gebruikers kunnen deze instellingen wijzigen zodat ze beter passen bij alternatieve opstellingen en multiphoton-Microscoop-mogelijkheden. Dit zijn de parameters die worden gebruikt in het experimentele protocol. Zie tabel met materialen voor specifieke details. - Plaats een stereo taxic-apparaat (Zie tabel met materialen) op het podium van de multiphoton-Microscoop. Verbind dit met een anesthesie-bezorg machine (Zie tabel met materialen) om ervoor te zorgen dat de dieren voor de duur van het experiment verdoving worden. Plaats een stukje mat zwart papier op het oppervlak van het apparaat als een verbindingspunt voor de muis poot.
- Selecteer de resonante scanner met een vast scan oppervlak van 512 μm x 512 μm.
Opmerking: Voer de experimenten in dit protocol niet uit met een galvanometer scanner. Vanwege de langzamere samplefrequentie, zal er vervorming zijn in z-stack time-lapse Video's als gevolg van de ademhaling van het dier dat onvermijdelijk is. - Stem de twee excitatie lasers af op de excitatie golflengten van GFP en RFP, respectievelijk 930 nm en 1100 nm, en het lichtpad van beide excitatie lasers naar de enkele doelstelling met behulp van een dichroïde spiegel van 690-1050 nm, waardoor de 930 nm-afgestemde excitatie Laser om te worden weerspiegeld in de hoofd scanner en de 1.100 nm-tuned laser om rechtstreeks in de hoofd scanner te passeren (Figuur 2).
Opmerking: het is mogelijk om deze excitatie golflengten te wijzigen, afhankelijk van de instelling van de gebruiker. - Stel de laser kracht van FITC in op 5% en GFP tot 20%.
Opmerking: deze instelling biedt een optimale signaal-ruis verhouding (SRV) in deze experimenten. Detecteer signaal via multi-alkali-buizen (PMTs); in plaats daarvan kunnen GaAsP-detectoren echter worden gebruikt in zeer gevoelige experimenten. - Maak de ruimte klaar voorbeeld vorming onder donkere omstandigheden zonder strooilicht.
3. in vivo beeldvorming
- Plaats de muis in de inductie kamer van de anesthesie levering systeem en gebruik 5% Isofluraan (Zie tabel van de materialen) op een 2 L/min stroomsnelheid van zuurstof te plaatsen van de muis onder diepe anesthesie.
Opmerking: het wordt ten zeerste aanbevolen om tijdens het experiment alle geschikte PBM te dragen.- Breng de muis over naar het stereotaxsche apparaat met toegang tot een neuskegel om anesthesie gedurende het experiment te handhaven. Reduceer de Isofluraan tot 1,5%-2% en houd de stroomsnelheid constant.
-
Bevestig de achterpoot stevig aan een stuk zwart papier met zwarte tape op gebieden zowel proximale als distale naar het gebied van belang (dit vermindert de effecten van muis ademhaling op beeldkwaliteit), ervoor te zorgen dat het plantaire-oppervlak van de poot is vrij en geconfronteerd met naar de doelstelling. Zorg ervoor dat de kop van de muis stabiel is binnen de neuskegel die aan het apparaat is bevestigd.
Opmerking: Controleer de muis op tekenen van nood of uitdroging tijdens het experiment en pas Isofluraan dienovereenkomstig aan.
- Plaats een royale hoeveelheid steriel water-gebaseerd smeermiddel (gel, Zie tabel van de materialen) op het plantaire-oppervlak van de poot en raak de doelstelling om het te creëren van een kolom van vloeistof tussen het poot en het doel.
- Gebruik de FITC excitatie licht om zich te concentreren op de dermale laag van de poot. Zorg ervoor dat fibroblasten met tdTomato-Tags worden gevisualiseerd voordat u doorgaat (deze stap is belangrijk bij het bepalen van het juiste brandvlak voor het beeld).
Opmerking: de dermale laag van de poot is ongeveer 100-150 μm in de poot. - Beeld het gebied van cellen dat zich net onder het plantaire-oppervlak van de achterpoot bevindt, met zowel de 930 nm-als 1100 nm-afgestemde lasers en verkrijg een time-lapse van 15 minuten van ongeveer 5-10 z-segmenten met ongeveer 1 μm per segment om een weergave van de omgeving te creëren vóór injectie met LPS-FITC.
- Voer een intraplantaire injectie van 5 μg/20 μL LPS-FITC uit op de achterpoten van de muis met een 25 μL glas Hamilton-spuit (Zie tabel met materialen) en 30g-naald (Zie tabel met materialen) en zorg dat de positie van de poot niet wordt verstoord.
- Beeld een gebied van cellen net onder het plantaire-oppervlak van de achterpoot met zowel de 930 nm-als 1100 nm-afgestemde lasers en verkrijg een time-lapse van 60-120 minuten van ongeveer 5-10 z-segmenten met ongeveer 1 μm per segment om de opname van LPS-FITC door cellen te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aanvankelijk hebben we LPS-FITC geïnjecteerd in de achterpoot van wild-type muizen om de opname van LPS-FITC in alle celtypen aanwezig in de dermale laag van het poot te visualiseren. Na het constateren van een groot aantal cellen in de dermale laag van de Hind paw-opname fluorescently-Tagged LPS in een wild type muis (video figuur 1, 2), probeerden we specifiek te richten op fibroblasten omdat ze een primaire focus zijn in ons onderzoek. Voor de beeldvorming van de poten van dieren die met LPS-FITC werden geïnjecteerd, wilden we duidelijk zijn dat er geen inherente fluorescentie van cellen in de dermale laag is. Dit is om ervoor te zorgen dat na de injectie de beelden die we nemen echte interacties van cellen zijn met de fluorescently gelabelde LPS en geen imaging-artefacten (video figuur 3, 4). Na LPS-FITC injectie, alleen FSP1+ fibroblasten uitdrukken TLR4 binden en opname van het geïnjecteerde eiwit, met een hoog niveau van co-lokalisatie met de tdTomato tag uitgedrukt door deze cellen (video figuur 5). Muizen die TLR4 uit het hele lichaam hebben geslagen (TLR4ko) binden en opname van LPS na de injectie niet. Zoals duidelijk in de video, zijn silhouetten van cellen zichtbaar na LPS-FITC-injectie, wat aangeeft dat het medicijn zich verspreidt in de interstitiële vloeistof rond cellen, maar niet daadwerkelijk wordt gebonden door een receptor (video figuur 6).
Om onze resultaten samen te vatten, tonen we in vivo dat na injectie van LPS-FITC, in een FSP1cre; tdTomatoLox-stop-Lox Cell-specifiek gereactiveerd dier alleen fibroblasten interactie met en opname LPS. In tegenstelling, het hele lichaam Knockouts van TLR4 niet binden en opname van LPS-FITC na injectie.
Figuur 1 . tdtomato wordt alleen uitgedrukt in FSP1+ fibroblasten op een CRE-afhankelijke manier. A) FSP1cre transgene muizen gefokt op een C57BL/6 achtergrond worden gekruist met tdtomaat muizen gefokt op een C57BL/6 achtergrond voor het genereren van muizen uitgedrukt TDTOMATO in FSP1+ fibroblast in een CRE-afhankelijke mode. B) representatieve PCR-resultaten die zowel positieve als negatieve FSP1cre muizen afbeelden die tdTomato uitdrukken. C) representatieve pictografiek van dermale fibroblasten in extracellulaire ruimte gelegen in de muis poot. FSP1+ muizen uiten een rood fluorescerende proteïne alleen in fibroblasten, terwijl FSP1- muizen dat niet doen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Lichtpad van tweekleurige 2-photon Microscoop. De afbeelding van het lichtpad dat is ingesteld voor het 2-kleurige 2-fotonen-experiment dat is ingesteld. Laser 1 is afgestemd op 930 nm om FITC-geconjugeerde LPS te prikkelen en laser 2 is afgestemd op 1100 nm om Tdtomaat te prikkelen die in fibroblasten wordt aangetroffen. Excitatie licht van laser 1 wordt weerspiegeld door de dichroïde spiegel (690-1050 nm) terwijl het excitatie lampje van laser 2 doorloopt naar de hoofd scanner. Excitatie licht van beide lasers wordt weerspiegeld door een reeks spiegels naar een tweede dichroïde spiegel (650 nm) waardoor excitatie licht het doel en in het weefsel kan passeren om de fluor Foren te prikkelen. Licht wordt uitgezonden door de opgewonden fluor en wordt opgevangen door de 25x-doelstelling en gereflecteerd door de dichroïde spiegel (650) naar de multialkali-fotomultiplicatorbuizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . Experimenteel stroomschema van 2-photon microscopie. Muizen zijn verdoving en geïmmobiliseerd met behulp van een lage-flow anesthesie systeem en stereotaxic apparatuur. Het plantaire-oppervlak van de poot wordt geconfronteerd met het doel en wordt gedurende 15 minuten afgebeeld. Intraplantar injectie van 5 μg/20 μL LPS-FITC wordt uitgevoerd op de verdoofd Mouse en de poot wordt vervolgens voor een tijdsduur die nodig is voor het doel van het experiment afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video figuur 1. Z-stack Video's van LPS-FITC opname in cellen in het wild type C57BL/6 muizen. Z-stack video van de dermale laag van de achterpoot van een C57BL/6-muis vóór LPS-FITC-injectie. Het plantaire-aspect van een wild type muis poot werd gedurende 15 minuten voorafgaand aan de injectie met LPS-FITC afgebeeld om de autofluorescentie te controleren die in het GFP-kanaal werd geproduceerd. Er is weinig tot geen signaal in het GFP-kanaal dat aangeeft dat er geen auto fluorescentie is. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video figuur 2. Z-stack video van de dermale laag van de achterpoot van een C57BL/6 muis na LPS-FITC injectie. De plantaire aspect van een wild type muis poot werd afbeelding gemaakt voor 1,5 uur post-LPS-FITC injectie om de opname van LPS-FITC visualiseren door alle cellen uitdrukken TLR4. Zoals duidelijk in de video, een veelheid van cellen binden en opname van LPS-FITC gedurende de loop van het experiment. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video figuur 3. Z-stack video van de dermale laag van de achterpoot van een FSP1cre; tdTomato muis voor LPS-FITC injectie. Het plantaire-aspect van een FSP1cre; tdTomato Mouse paw werd gedurende 15 minuten voorafgaand aan de injectie met LPS-FITC geimageerd om te controleren of autofluorescentie in het GFP-kanaal werd geproduceerd. Er is weinig tot geen signaal in het GFP-kanaal dat aangeeft dat er geen auto fluorescentie is. tdTomato-positieve fibroblasten worden gevisualiseerd. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video figuur 4. Z-stack video van de dermale laag van de achterste poot van een TLR4ko muis vóór LPS-FITC injectie. Het plantaire-aspect van TLR4ko Mouse paw werd gedurende 15 minuten voorafgaand aan de injectie met LPS-FITC afgebeeld om de autofluorescentie te controleren die in het GFP-kanaal werd geproduceerd. Er is weinig tot geen signaal in het GFP-kanaal dat aangeeft dat er geen auto fluorescentie is. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video figuur 5. Z-stack video van de dermale laag van de achterpoot van een FSP1cre; tdTomato muis na LPS-FITC injectie. Het plantaire-aspect van een FSP1cre; tdtomato Mouse paw werd afbeelding gemaakt voor 1,5 uur post-LPS-FITC injectie om de opname van LPS-FITC visualiseren door tdtomato-positieve fibroblasten uitdrukken TLR4. Zoals duidelijk in de video, wordt zeer specifieke opname van LPS-FITC via TLR4 uitgedrukt op tdTomato-positieve fibroblasten gezien. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video figuur 6. Z-stack video van de dermale laag van de achterpoot van een TLR4ko muis na LPS-FITC injectie. Het plantaire-aspect van een TLR4ko -muis poot werd voor 1,5 uur na LPS-FITC-injectie afgebeeld om te visualiseren of de opname van LPS-FITC door cellen in een hele lichaams Beker van TLR4 mogelijk is. Zoals duidelijk in de video, geen opname van LPS-FITC wordt gezien door de cel in de dermale laag van de achterste poot. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Misschien wel de belangrijkste stappen van in vivo 2-Photon Imaging zijn: 1) het kiezen van de juiste genetische reporter muis en fluorescently gelabeld eiwit voor de multi-photon Setup en experimentele behoeften21,22; 2) beeldvorming van het juiste focale vlak om een nauwkeurige weergave van de populatie van cellen in het weefsel23; 3) minimaliseren van de beweging als gevolg van een onjuist geïmmobiliseerd dier24; en 4) kiezen wanneer gegevens kwalitatief te analyseren versus kwantitatief25,26,27. Zorg ervoor dat u deze punten voor aanvang van een experiment aan te pakken zal bieden de kennis voor het verzamelen van gegevens die zowel reproduceerbaar en wetenschappelijk rigoureus.
Een belangrijke overweging in het protocol is het correct immobiliseren van de regio om te worden imaged. Ademhaling van het dier veroorzaakt minuten verschuivingen in het brandvlak tijdens beeldvorming en bij het uitvoeren van z-stack en time-lapse video, dit veroorzaakt aanzienlijke vervorming in de video en kan een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van de geproduceerde gegevens. Ervoor te zorgen dat de Paw correct is geïmmobiliseerd zal succesvolle beeldvorming van de poot zonder verstoring van de ademhaling mogelijk te maken. Bovendien is het kennen van de lokalisatie van cellen in het experiment een cruciale stap in het identificeren van het juiste focal plane om te visualiseren. Omdat we ervoor kozen om zich te concentreren op dermale fibroblasten, hoeven we alleen maar een relatief korte afstand in het Paw te maken om onze celtypen te visualiseren (~ 100-150 μm). In andere experimenten is het belangrijk om rekening te houden met de capaciteiten van de Microscoop en doelstelling die wordt gebruikt, omdat het uitvoeren van een experiment naar beeld cellen diep in het weefsel een uitdaging kan zijn om onmogelijk te zijn gezien de ingestelde gebruikers. Ten slotte is het kiezen van het benaderen van gegevensanalyse een belangrijke overweging in de laatste stappen van het experiment. Hier tonen we aan dat fibroblasten die TLR4 uitdrukken in staat zijn om fluorescently gelabelde LP'S op te maken en te binden, wat blijkt uit de robuuste co-lokalisatie van groen (LPS) en rood (Tdtomaat uitgedrukt door fibroblasten) in de Video's. Hoewel er geen kwantitatieve beeldanalyse wordt uitgevoerd in dit protocol, zijn er verschillende manieren waarop een gebruiker gegevens kan interpreteren die uit dit protocol zijn verzameld. De eerste is een eenvoudige co-lokalisatie-analyse met behulp van open-source software om de intensiteit van twee verschillende kleuren in een bepaalde pixel28te meten. Hierdoor kan de gebruiker nagaan of er twee opgewonden fluor Foren worden gedetecteerd op een bepaalde pixel in een verworven afbeelding of video en hoeveel van deze overlap is er in een bepaalde ruimte. Dit is handig bij het identificeren als de cellen van belang zijn interactie met een bepaalde capaciteit met het geïnjecteerde molecuul. Een alternatieve methode voor kwantitatieve analyse is fluorescentie intensiteit29. De gebruiker is in staat om informatie te verzamelen over de intensiteit van een bepaald signaal binnen een cel van belang. Gegevens die uit deze analyses worden verzameld, kunnen aangeven hoe cellen verschillende hoeveelheden van een molecuul in vergelijking met andere kunnen verwerken. Deze methoden voor gegevensanalyse zijn een voorbeeld van de manier waarop de gebruiker gegevens kan proberen te analyseren die zijn verzameld uit een experiment dat lijkt op de methode die in dit protocol wordt uitgevoerd.
Onze genetische modellen stellen ons in staat om selectief fluorescently tag (tdTomato) FSP1+ fibroblasten op een CRE/loxp-afhankelijke manier te maken, wat zorgt voor een snelle en eenvoudige visualisatie van cellen in de dermis van de huid. Hoewel dit het visualiseren van cellen gemakkelijk maakt vanwege hun inherente fluorescentie, is het mogelijk om 2-photon-beeldvorming zonder genetisch gelabelde cellen uit te voeren als de gebruiker ervaring heeft met het bepalen van de verschuiving van de epidermis naar de dermis. Het gebruik van de robuuste niveaus van autofluorescentie van het haar op de huid kan een nuttige indicator zijn van waar de gebruiker zich concentreert en de richting waarin men moet bewegen om het gewenste brandvlak te verkrijgen. Dit zal uiteraard alleen werken als het brandvlak van belang in de buurt van de huid en zal niet de cel van belang is diep in het weefsel.
Het volgen van een brandvlak tijdens het experiment is ideaal; echter, als gevolg van de ademhaling van een levend dier, het maakt het moeilijk om te voorkomen dat frame verschuivingen na verloop van tijd bij het opnemen van z-stapels in een time-lapse-experiment. Om dit probleem op te lossen, kan de gebruiker overwegen om de beeldkwaliteit te verminderen door de lijn gemiddelden te verlagen bij gebruik van een resonante scanner en de samplefrequentie te verhogen. Zoals eerder vermeld, is het bijna onmogelijk om een traditionele galvanometer scanner te gebruiken in een experiment waarbij een z-stack en time-lapse zijn opgenomen vanwege de langzamere samplefrequentie van de scanner.
Als u de duur van de beeld verwerving wijzigt, kan de gebruiker beter aan de behoeften van het experiment voldoen. Hoewel het dier gedurende langere tijd wordt geimaging, kan de gebruiker gegevens verzamelen in alle stappen van de endocytose van het molecuul en het metabolisme, waardoor de tijd tot het beeld wordt verkort alleen specifieke delen van het proces zullen de efficiëntie verhogen. Het is mogelijk om de afbeelding voor een kortere periode (~ 1-15 minuten) te identificeren molecuul Attachment, een langere periode van tijd (~ 15-30 minuten) om te visualiseren receptor-ligand endocytose30, en de volledige duur (~ 30-60 minuten) om cellulaire te visualiseren activering en mogelijke metabolisme van het molecuul. Dit is echter sterk afhankelijk van het geïnjecteerde molecuul en de cellen werden gevisualiseerd (Figuur 3).
Een belangrijke opmerking in het experimentele protocol zoals beschreven in dit manuscript is dat we op dit moment niet in staat zijn om identieke monster gebieden voor en na de injectie te beelden. Dit is te wijten aan de aard van de opzet en de methode van de levering van geneesmiddelen. Echter, we zijn in staat om cellen te volgen vanaf een tijd vroege post-injectie voor enkele uren. Hoewel het belangrijk is om individuele cellen in de loop van het experiment bij te houden, zijn regionale verschuivingen in cellulaire activering even belangrijk en kunnen deze worden vastgelegd met behulp van deze methode. Het visualiseren van meer dan twee fluor Foren op een multiphoton-Microscoop tegelijkertijd is onmogelijk gezien de opzet, daarom is een beperking van deze methode dat gebruikers slechts twee fluor Foren kunnen afbeelden in tegenstelling tot andere beeldvormingsapparatuur waar 4 of meer fluoroforen kunnen gelijktijdig worden gevisualiseerd31. Over het algemeen is het beschreven protocol specifiek voor de doelstellingen van ons lab en biedt het een handig hulpmiddel bij het identificeren van cellulaire activering waarbij de experimentele mogelijkheden opwegen tegen de beperkingen van het protocol.
De methoden die in dit manuscript worden beschreven, bieden een aantal voordelen ten opzichte van bestaande methoden om de activering van cellen te visualiseren. De eerste is dat de hier uitgevoerde experimenten in vivo zijn, waardoor real-time visualisatie van cellen binding en up nemen van moleculen die direct indicatief voor activering specifiek met betrekking tot een belediging. Dit biedt voordelen ten opzichte van andere methoden, zoals traditionele live-celbeeldvormings technieken omdat we in staat zijn om de omgeving van de cellen te behouden die de kans op verstorende resultaten aanzienlijk vermindert als gevolg van hyperexcitability en buitenbaarmoederlijke activiteit van cellen in verband met het trauma van dissociatie32. Bovendien verlaagt het gebruik van een multiphoton-Microscoop in deze experimentele setting de snelheid waarmee fluoroforen-foto-bleekmiddel een continue en aanzienlijk langere beeldvormings sessie mogelijk maakt, wat belangrijk is als de gebruiker deze methode toepast op studies onderzoek van de snelheid van metabolisme of op lange termijn activering33. Ten slotte, als de celtypen die zich diep in het weefsel bevinden (> 100 mm) met behulp van een multiphoton-Microscoop nodig is om een optimaal signaal34te verkrijgen. In het algemeen, als het doel van het experiment van een gebruiker is om real-time opname en activering van cellen te bestuderen in reactie op een belediging dan is het gebruik van twee-photon microscopie in combinatie met transgene reporter lijnen meer geschikt voor andere conventionele imagingtechnieken.
Deze techniek stelt gebruikers in staat om longitudinale studies uit te voeren op een breed scala van celtypen met betrekking tot activering, beweeglijkheid, en cel-naar-cel interacties. Het voordeel van deze techniek is dat het gebruikers in staat stelt om hun eigen genetisch gelabelde dieren te gebruiken en het fluorescently-gelabelde molecuul te vervangen door hun onderzoeksinteresses (bijv. Tie2cre voor epitheelcellen). Dit protocol is niet beperkt tot de specifieke instellingen die worden weergegeven in onze experimenten en kan sterk worden aangepast aan de behoeften van een Lab met behulp van genetische reporter lijnen en 2-photon huid beeldvorming in hun studies. We zijn van plan om deze aanpak te gebruiken om activering en werving van immuuncellen op de plaats van letsel na perifeer trauma te identificeren en te bepalen wat de specifieke tijdsduur van activering en werving is, zodat we beter kunnen begrijpen wat de beste aanpak is voor preventieve Therapeutics is met betrekking tot verschillende vormen van pijn.
Concluderend hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld waarmee gebruikers beeldopname van fluorescentiel gelabelde LPS door tdTomato-Tagged dermale fibroblasten die TLR4 uitdrukken met behulp van 2-photon microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de subsidie NS096030 (MDB). We willen ook de Imaging Core Manager ved Prakash bedanken. We willen ook Olympus Discovery Center/Imaging Core Facility van UT Dallas bedanken voor het leveren van apparatuur en ondersteuning
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
