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Bioengineering

लंबे समय तक सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के संचालन के लिए एक बहुपरत Microfluidic मंच

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/59655
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 3, 1,2
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

एक PDMS आधारित, बहुपरत, microfluidic डिवाइस है कि इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद (IVTT) प्रतिक्रियाओं में लंबे समय तक प्रदर्शन किया जा करने की अनुमति देता है के निर्माण की प्रक्रिया का वर्णन किया है. इसके अलावा, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर की एक व्यापक सिंहावलोकन को स्वचालित और लंबे समय तक durations के लिए इन प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक प्रदान की जाती है.

Abstract

सेल आधारित सिंथेटिक जीव विज्ञान की सीमाओं तेजी से स्पष्ट होते जा रहे हैं के रूप में शोधकर्ताओं को बड़ा और अधिक जटिल सिंथेटिक आनुवंशिक नियामक सर्किट विकसित करने का लक्ष्य. विवो में सिंथेटिक आनुवंशिक नियामक नेटवर्क का विश्लेषण समय लगता है और पर्यावरण नियंत्रण की कमी से ग्रस्त है, exogenous सिंथेटिक घटकों मेजबान प्रक्रियाओं के साथ बातचीत अवांछित व्यवहार में जिसके परिणामस्वरूप के साथ. इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, उपन्यास circuitry के सेल मुक्त विशेषता अधिक प्रचलित होता जा रहा है. इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद (IVTT) मिश्रण प्रयोगात्मक पर्यावरण के विनियमन की अनुमति है और प्रत्येक अद्वितीय प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत एक बहुपरत microfluidic डिवाइस है कि लंबे समय तक durations के लिए IVTT प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जा सकता है के निर्माण का विस्तार. बैच प्रतिक्रियाओं के विपरीत, जहां संसाधनों समय के साथ समाप्त हो रहे हैं और (द्वारा) उत्पादों जमा, microfluidic उपकरणों के उपयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रिया उत्पादों को हटाने की भरपाई की अनुमति देता है. इस प्रकार, कोशिकीय वातावरण का अनुकरण एक बाह्य संतुलन वातावरण को बनाए रखते हुए किया जाता है जिसमें जीन परिपथों के गतिशील व्यवहार की विस्तारित अवधि में जांच की जा सकती है। पूरी तरह से बहुपरत microfluidic डिवाइस का दोहन करने के लिए, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर IVTT प्रतिक्रियाओं को स्वचालित करने के लिए एकीकृत किया गया है. यहाँ प्रस्तुत microfluidic मंच के साथ IVTT प्रतिक्रियाओं के संयोजन से, यह व्यापक जटिल नेटवर्क व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए संभव हो जाता है, तंत्र है कि सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित की हमारी समझ को आगे बढ़ाने.

Introduction

सेल जटिल गतिशील नियामक नेटवर्क1,2का उपयोग करके अपने पर्यावरण को समझ और प्रतिक्रिया करने में सक्षम होते हैं . संश्लेषित जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्राकृतिक रूप से होने वाले घटकों के बारे में हमारे ज्ञान का उपयोग किया जाता है जिसमें ये नेटवर्क जैविक प्रणालियों को इंजीनियर करने के लिए होते हैं जो कोशिकाओं की कार्यक्षमता का विस्तार कर सकते हैं3,4. इसके विपरीत, यह भी सरल डिजाइन द्वारा जीवन को नियंत्रित प्राकृतिक नेटवर्क की हमारी समझ को आगे करने के लिए संभव है, मौजूदा सर्किट के सिंथेटिक एनालॉग या आगे इंजीनियरिंग जैविक प्रणालियों जो स्वाभाविक रूप से होने वाली व्यवहार प्रदर्शन द्वारा. इस तरह के जैविक प्रणालियों के डी नोवो इंजीनियरिंग एक नीचे-अप फैशन में किया जाता है जहां उपन्यास आनुवंशिक सर्किट या संकेत पथ एक तर्कसंगत तरीके से इंजीनियर हैं, अच्छी तरह से परिभाषित भागों5,6का उपयोग कर. जैविक रूप से संगत प्रणालियों के डिजाइन के साथ नेटवर्कों के तर्कसंगत डिजाइन को संयोजित करने से जैविक विनियामक प्रणालियों की गहन विशेषता और अध्ययन अमूर्तन7के विभिन्न स्तरों के साथ हो जाता है।

Elowitz और Leibler8 और Gardner एटअल. 9 के अग्रणी काम करता है सेलुलर मेजबान में सिंथेटिक आनुवंशिक नेटवर्क के सफल परिचय प्रदर्शित करने के लिए पहले थे. निम्नलिखित दशक में, कई शोधकर्ताओं ने कोशिकाओंमेंसिंथेटिक सर्किट की शुरूआत के बारे में कई सीमाओं के उद्भव के बावजूद इन प्रारंभिक सफलताओं पर निर्माण जारी रखा है 7 ,10,11 ,12. आदर्श रूप में, सेलुलर मेजबान में सिंथेटिक सर्किट की शुरूआत एक मॉड्यूलर फैशन में होना चाहिए. दुर्भाग्य से, सेलुलर पर्यावरण की जटिलता यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बना देता है, कई भागों और नेटवर्क के समारोह के साथ अत्यधिक संदर्भ निर्भर किया जा रहाहै 12,13,14. परिणामस्वरूप, नेटवर्क अक्सर देशी मेजबान घटकता के साथ अवांछित बातचीत का अनुभव करते हैं जो सिंथेटिक सर्किट के कार्य को प्रभावित कर सकता है। इसी प्रकार, बहिर्जात नेटवर्क के घटक मेजबान प्रक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं, मेजबान के भीतर साझा संसाधनों के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं, और विकास गतिकी15,16,17को प्रभावित कर सकते हैं। नतीजतन, एक विवो वातावरण में सिंथेटिक नेटवर्क के व्यवहार को तर्कसंगत रूप से डिजाइन करने और भविष्यवाणी करने के लिए, सभी मेजबान और सर्किट-विशिष्ट गतिशीलता के एक व्यापक मॉडल की आवश्यकता है18।

सिंथेटिक नेटवर्क के लक्षण के लिए सेलुलर मेजबान के उपयोग के लिए एक व्यवहार्य विकल्प इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद (IVTT) प्रौद्योगिकियों के आवेदन है. संश्लेषित नेटवर्कों के लिए परीक्षण के रूप में कार्य करते हुए, उन समाधानों में प्रतिक्रियाएं की जाती हैं जिनमें जीन व्यंजक19,20,21को सक्षम करने के लिए आवश्यक सभी घटक होते हैं। इस प्रकार, जैविक रूप से प्रासंगिक, यद्यपि कृत्रिम, पर्यावरण का सृजन किया जाता है जिसके भीतर सिंथेटिक नेटवर्कों का परीक्षण किया जा सकता है22,23,24,25,26, 27,28. IVTT समाधानों का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट शर्तों के तहत प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करने की क्षमता है, जिसमें शोधकर्ता प्रत्येक अभिक्रिया2की सटीक संरचना को ट्यून करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, सेल मुक्त दृष्टिकोण सिंथेटिक नेटवर्क के उच्च throughput परीक्षण सक्षम बनाता है, क्योंकि यह समय लेने वाली सेलुलर क्लोनिंग कदम प्रदर्शन करने की आवश्यकता को हटा. परिणामस्वरूप , क्रमिक डिजाइन - निर्माण परीक्षण चक्र की अवधि काफी कम हो जाती है29,30,31,32. डिजाइन चक्र आगे सेल मुक्त क्लोनिंग तकनीक का उपयोग करके इस तरह के तेजी से इंजीनियर उपन्यास नेटवर्क के लिए गिब्सन विधानसभा के रूप में त्वरित किया जा सकता है, और रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स से नेटवर्क का निर्माण करके जो - विवो परीक्षण में के लिए आवश्यक प्लाज्मिड के विपरीत - बहुलक श्रृंखला अभिक्रियाओं (पीसीआर)33,34के माध्यम से प्रवर्धित किया जा सकता है।

बैच अभिक्रियाएँ सरलतम विधि है जिसके द्वारा IVTT अभिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा सकता है, जिसके लिए एक एकल अभिक्रिया पोत की आवश्यकता होती है जिसमें सभी अभिक्रियाघटकोंको संयुक्त किया जाता है। इस तरह की प्रतिक्रियाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति और बुनियादी सर्किट परीक्षण के लिए पर्याप्त हैं अभी तक अपर्याप्त साबित जब एक नेटवर्क की लंबी अवधि के गतिशील व्यवहार का अध्ययन करने का प्रयास. एक बैच प्रतिक्रिया के दौरान, अभिकर्मकों या तो समाप्त हो रहे हैं या गिरावट से गुजरना जिसके परिणामस्वरूप प्रतिलेखन और अनुवाद दरों की एक सतत कमी में. इसके अलावा, के रूप में प्रतिक्रियाओं प्रगति द्वारा उत्पादों जमा है कि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं - या पूरी तरह से बाधित - नेटवर्क के सही कामकाज. अंत में, बैच रिएक्टरों का उपयोग गतिशील व्यवहार है जो मनाया जा सकता है, नकारात्मक विनियमन के साथ विशेष रूप से 5,36कोलागू करने के लिए चुनौतीपूर्ण होने के साथ सीमा .

IVTT सिस्टम की बहुमुखी प्रतिभा कई वैकल्पिक तरीकों जिसके द्वारा लंबे समय तक IVTT प्रतिक्रियाओं किया जा सकता है सक्षम बनाता है, निरंतर प्रवाह से छोटी बूंद आधारित तरीकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सरल डायलिसिस दृष्टिकोण2,30, 37,38,39,40. microfluidic उपकरणों के आवेदन उपयोगकर्ताओं को उनकी प्रतिक्रियाओं पर नियंत्रण में वृद्धि प्रदान करता है, जबकि प्रवाह में वृद्धि और कम से कम लागत35,41,42, प्रत्येक विशिष्ट दृष्टिकोण होने के साथ अपने अपने फायदे. सतत प्रवाह के उपयोग को अभिव्यक्ति की पैदावार बढ़ाने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है हालांकि, विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों को प्रभावी ढंग से हटाने में असमर्थता गतिशील व्यवहार गैर-trivial39का अध्ययन करती है। जबकि छोटी बूंद आधारित microfluidic प्रणालियों को रोजगार उपन्यास नेटवर्क के उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति देता है, प्रतिक्रिया के लिए ताजा अभिकर्मकों की आपूर्ति की कठिनाई छोटे मात्रा बैच प्रतिक्रियाओं43जैसी बूंदों में परिणाम . डायलिसिस आधारित रिएक्टरों ताजा अभिकर्मकों की शुरूआत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ प्रतिक्रिया उत्पादों को हटाने की अनुमति हालांकि, आरएनए अणुओं और बड़ा प्रोटीन रिएक्टर के भीतर जमा, झिल्ली pores के माध्यम से फैलाना करने के लिए बहुत बड़ा किया जा रहा है. इसके अलावा ,30,44की लंबी अवधि के लिए इन अभिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए बडी मात्रा में अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है . 2013 में, Maerkl एट अल एक बहुस्तरीय microfluidic डिवाइस विशेष रूप से लंबे समय तक IVTT प्रतिक्रियाओं36,45के संचालन के लिए डिजाइन प्रस्तुत किया. बहु-परतवाले माइक्रोफ्लूइडी उपकरणों का उपयोग तरल प्रवाह पर प्रत्यक्ष नियंत्रण की अनुमति देता है, जिससे प्रवाह के पुनर्निर्देशन के साथ-साथ उपकरण46,47के विशिष्ट क्षेत्रों में तरल पदार्थ के अलगाव की अनुमति होती है। इन अलग क्षेत्रों स्वतंत्र नैनोलीटर पैमाने पर प्रतिक्रिया कक्षों जिसमें IVTT प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में कार्य कर सकते हैं. एक भी IVTT प्रतिक्रिया के दौरान, रिएक्टर में ताजा अभिकर्मकों के आवधिक इंजेक्शन IVTT घटकों और डीएनए टेम्पलेट्स की भरपाई करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके साथ ही, पुराने अभिक्रिया विलयन का समसम आयतन विस्थापित हो जाता है, अभिक्रिया उत्पादों को हटा दिया जाता है। इस तरीके से, एक बाहर के संतुलन वातावरण बनाए रखा है, जहां बेसल प्रतिलेखन और अनुवाद दर स्थिर राज्य में रहते हैं, IVTT प्रतिक्रियाओं के जीवनकाल को लम्बा और अमीर गतिशील व्यवहार होने की अनुमति. इस दृष्टिकोण को लागू करने से, शोधकर्ताओं को एक विशिष्ट सर्किट के भीतर होने वाली व्यक्तिगत प्रक्रियाओं की गतिज दरों की जांच करने में सक्षम हैं, उपन्यास आनुवंशिक नेटवर्क के आगे इंजीनियरिंग में सहायता. उदाहरण के लिए, Niederholtmeyer एट अल. एक आनुवंशिक वलय थरथरानवाला के विभिन्न तत्वों की विशेषता के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया,उसके 36की गतिज दरों का निर्धारण. आगे के अध्ययनों में, Yelleswarapu एट अल. पता चला है कि सिग्मा कारक की गतिज दर 28 (जेड28) बैच शर्तों के तहत निर्धारित एक के व्यवहार का वर्णन करने के लिए अपर्याप्त थे $28- आधारित थरथरानवाला, और प्रवाह आधारित डेटा के अलावा नेटवर्क व्यवहार22के बेहतर मॉडल भविष्यवाणियों |

इस पांडुलिपि का लक्ष्य लंबी अवधि के IVTT प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने में सक्षम बहुपरत microfluidic उपकरणों के निर्माण के लिए एक पूरा प्रोटोकॉल पेश करने के लिए है। इसके अलावा, इस पांडुलिपि लंबे समय तक IVTT प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के सभी का वर्णन करेंगे. microfluidic डिवाइस के actuation - उसमें तरल पदार्थ के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक - वायवीय वाल्व जो ट्यूबिंग की लंबाई के माध्यम से microfluidic उपकरणों के लिए सीधे कनेक्ट की एक श्रृंखला का उपयोग कर हासिल की है. बदले में, वायवीय वाल्व एक कस्टम निर्मित आभासी नियंत्रण इंटरफ़ेस के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं. microfluidic उपकरणों के भीतर द्रव प्रवाह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दबाव विनियमन प्रणाली द्वारा प्रदान की जाती है जो निरंतर दबाव का उपयोग कर हासिल की है. IVTT अभिक्रियाओं का प्रयोग आमतौर पर 29 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच किया जाता है तथा प्रतिक्रियाओं के दौरान तापमान को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाता है। हालांकि, IVTT मिश्रण की कार्यक्षमता धीरे-धीरे कम हो जाती है जब 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर संग्रहीत. इस तरह के रूप में, इस पांडुलिपि बंद चिप शीतलन microfluidic डिवाइस में इंजेक्शन से पहले IVTT मिश्रण शांत करने के लिए इस्तेमाल प्रणाली पर विस्तार होगा. अंत में, इस पांडुलिपि सफलतापूर्वक एक microfluidic प्रवाह रिएक्टर का उपयोग कर लंबे समय तक IVTT प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है जैसे कि अन्य शोधकर्ताओं रिश्तेदार के साथ इस तकनीक को दोहराने में सक्षम हो जाएगा आसानी.

Protocol

1. वेफर तैयारी

नोट: हमारे प्रोटोकॉल इस शोध के दौरान इस्तेमाल किया 40 XT सकारात्मक photoresist और SU8 3050 नकारात्मक photoresist के लिए विशिष्ट हैं. वैकल्पिक photoresists इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन विशिष्ट स्पिन गति, पाक तापमान, और पाक बार अलग अलग होंगे. Niederholtmeyer एट अल36 द्वारा प्रदान की microfluidic डिवाइस डिजाइन सामग्री की तालिकामें जुड़ा हुआ है.

  1. दो साफ सिलिकॉन वेफर्स (100 मिमी व्यास, और lt;1-0-0 और उन्मुख, 525 डिग्री मीटर मोटाई) एक preheated ओवन में 250 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट जगह है और रात भर निर्जलित करने के लिए वेफर्स छोड़ दें ($16 ज)।
    नोट: यह भी HMDS वाष्प जमाव का उपयोग कर वेफर्स प्रधानमंत्री के लिए संभव है; हालांकि, यह आवश्यक नहीं है अगर वेफर्स पर्याप्त रूप से निर्जलित हैं।
  2. ओवन से एक सिलिकॉन वेफर निकालें और स्पिन कोटिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले इसे कमरे के तापमान को ठंडा करते हैं। वेफर के केंद्र में 40 XT photoresist के 3-4 एमएल लागू करें।
  3. 25 डिग्री की सुविधा ऊंचाई प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित स्पिन प्रोटोकॉल लागू: स्पिन के लिए 20 s पर 500 rpm (110 rpm/s), स्पिन की गति में वृद्धि 3100 आरपीएम (300 आरपीएम / microfiber ऊतक ध्यान से किसी भी बढ़त beading जो स्पिन कोटिंग के दौरान हुई हो सकता है हटा दें.
  4. निम्नलिखित तरीके से 70 डिग्री सेल्सियस और 120 डिग्री सेल्सियस पर सेट की गई दो अलग-अलग हॉट प्लेट्स का उपयोग करके नरम सेंकना: वेफर को 30 s के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बैठने की अनुमति दें। फिर वेफर को 120 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट में स्थानांतरित करें और वेफर को 70 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर लौटने से पहले 3.5 मिनट के लिए यहां आराम करने दें। हॉटप्लेट से वेफर निकालें और - अचानक तापमान के झटके से बचने - इसे कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें।
  5. प्रवाह परत photomask रखें (इमल्शन साइड नीचे) photoresist फिल्म पर और एक यूवी दीपक का उपयोग कर वेफर बेनकाब जब तक 200 mJ/cm2 की कुल जोखिम हासिल की है.
  6. निम्नलिखित तरीके से दो गर्म प्लेटों (70 डिग्री सेल्सियस और 105 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके पोस्ट-एक्सपोजर सेंकना: वेफर को 105 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट में स्थानांतरित करने से पहले 20 एस के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बैठने की अनुमति दें और इसे 40 एस के लिए यहां छोड़ दें। अंत में एक और 20 s के लिए 70 डिग्री सेल्सियस hotplate के लिए वेफर वापस करने के बाद जोखिम सेंकना पूरा करने के लिए.
  7. माइक्रोफाइबर ऊतकों के ढेर पर कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए वेफर को अनुमति दें। विकास की प्रक्रिया शुरू करने के लिए 726 MIF photoresist डेवलपर से भरा एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करके वेफर का विकास करें। विकास त्वरित है जब एक बेंचटॉप शेकर पर प्रदर्शन किया और पूरे वेफर डेवलपर में डूब जाता है।
  8. विखनिजीकृत पानी के साथ वेफर कुल्ला और किसी भी photoresist अवशेषों के लिए वेफर सतह की जांच करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यदि photoresist अवशेषों देखा जा सकता है, तो डेवलपर को वेफर वापस.
  9. 25 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म प्लेट पर वेफर रखकर सकारात्मक photoresist reflow. इस प्रक्रिया गोल सुविधाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किसी भी दरार है कि निर्माण प्रक्रिया के दौरान दिखाई दिया हो सकता है annealing में परिणाम होगा. चरण 1.17 में वर्णित के रूप में वेफर silanize करने के लिए आगे बढ़ें.
  10. यह स्पिन कोटिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति देता है, ओवन से दूसरा सिलिकॉन वेफर निकालें। वेफर के केंद्र में SU8 3050 photoresist के 5 एमएल लागू करें.
  11. 30 डिग्री की सुविधा ऊंचाई प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित स्पिन प्रोटोकॉल लागू: स्पिन के लिए 20 s पर 500 rpm (110 rpm/s), 4,000 rpm (330 rpm/s) के लिए स्पिन की गति में वृद्धि और 42 s के लिए यहाँ पकड़, और 200 rpm/s के aceleration के साथ 0 rpm को कम करने के लिए वेफर decelerate / microfiber ऊतक ध्यान से किसी भी बढ़त beading जो स्पिन कोटिंग के दौरान हुई हो सकता है हटा दें.
  12. निम्नलिखित तरीके से दो अलग-अलग हॉट प्लेट (65 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके नरम सेंकना: वेफर को 30 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बैठने की अनुमति दें। फिर वेफर को 95 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट में स्थानांतरित करें और वेफर को 65 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर लौटने से पहले 14 मिनट तक आराम करने दें। हॉटप्लेट से वेफर निकालें और कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें।
  13. जोखिम से पहले यूवी दीपक की तीव्रता को मापने और 260 mJ/cm2की कुल जोखिम खुराक प्राप्त करने के लिए आवश्यक जोखिम अवधि निर्धारित करने के लिए इस का उपयोग करें। photoresist फिल्म पर photomask (इमल्शन साइड नीचे) प्लेस और यूवी प्रकाश स्रोत के नीचे वेफर जगह है. 260 mJ/cm2 की कुल जोखिम हासिल की है जब तक एक यूवी दीपक का उपयोग कर वेफर का पर्दाफाश.
  14. पोस्ट-एक्सपोजर सेंकना दो गर्म प्लेटों (65 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करते हुए निम्नलिखित तरीके से: वेफर को 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बैठने की अनुमति दें, वेफर को 95 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट में स्थानांतरित करने से पहले और इसे 4.5 मिनट के लिए यहां छोड़ दें। वेफर को 30 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर वापस जाने की अनुमति दें। पोस्ट-एक्सपोजर सेंकना पूरा करने के लिए।
  15. माइक्रोफाइबर ऊतकों के ढेर पर कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए वेफर को अनुमति दें। विकास की प्रक्रिया शुरू करने के लिए mrDev-600 photodeveloper से भरा एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करके वेफर का विकास करना। विकास त्वरित है जब एक बेंचटॉप शेकर पर प्रदर्शन किया और पूरे वेफर डेवलपर में डूब जाता है।
  16. आइसोप्रोपेनोल के साथ वेफर कुल्ला और किसी भी photoresist अवशेषों के लिए वेफर सतह की जांच करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यदि photoresist अवशेषों देखा जा सकता है, तो डेवलपर को वेफर वापस. एक बार पूरी तरह से विकसित होने के बाद, 1 h के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म प्लेट पर वेफर रखकर फोटोप्रतिरोध को बेक करें।
  17. नरम-लिथोग्राफी प्रक्रियाओं के दौरान पीडीएमएस के आसंजन को रोकने के लिए दोनों वेफर्स को सिलनाइज करें। silanization प्रदर्शन करने के लिए, एक छोटे गिलास शीशी में silane के pipe 2-3 बूंदों (प्रति वेफर)। इस शीशी को एक शुष्कक में वेफर्स के साथ रखें और 5-10 मिनट के लिए वैक्यूम खींच लें। शुष्कक को सील करें और 12 - 16 ज की अवधि के लिए वेफर्स को वैक्यूम के तहत छोड़ दें।
    चेतावनी: silane विषाक्त है और साँस नहीं होना चाहिए. एक धूआं हुड में काम करने के लिए और silane से निपटने जब nitrile दस्ताने पहनने के लिए ध्यान रखना। यह जब desicator पर वैक्यूम खींच धूआं हुड में वैक्यूम पंप रखने भी शामिल है.
  18. शुष्कक से निर्वात को छोड़ दें और साइनेनाइज्ड वेफर्स को हटा दें। पानी के साथ कुल्ला और N2 की एक भाप का उपयोग करने के लिए वेफर्स सूखी. इस बिंदु पर वेफर्स भंडारण में रखा जा सकता है जब तक आवश्यक.

2. Microfluidic डिवाइस निर्माण

नोट: नरम-लिथोग्राफी प्रक्रिया PDMS आधारित बहुपरत microfluidic उपकरणों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया तीन अलग चरणों में अलग किया जा सकता है: 1) दोनों प्रवाह और नियंत्रण परतों की PDMS तैयारी, 2) संरेखण और दो PDMS परतों के संबंध, 3) डिवाइस का पूरा होना.

  1. पीडीएमएस की तैयारी
    1. एक प्लास्टिक बीकर में आधार और इलाज एजेंटों के संयोजन और पूरी तरह से मिश्रित जब तक दो घटकों हलचल करने के लिए एक मिश्रण रॉड का उपयोग करके दो PDMS अग्रदूत समाधान तैयार करें। नियंत्रण परत के लिए 20 ग्राम बेस एजेंट और 1 ग्राम के इलाज एजेंट (20:1 अनुपात) की आवश्यकता होती है। प्रवाह परत के लिए 40 ग्राम आधार एजेंट और 8 ग्राम के उपचार एजेंट (5:1 अनुपात) की आवश्यकता होती है। एक desiccator में समाधान Degas.
    2. एक पेट्री डिश में प्रवाह परत वेफर प्लेस और वेफर पर 5:1 अनुपात PDMS मिश्रण डालना. हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए PDMS Degas.
    3. स्पिन कोट नियंत्रण परत वेफर (नकारात्मक SU8 3050photoresist का उपयोग कर के साथ तैयार) 20:1 अनुपात PDMS के साथ. वेफर के केंद्र पर PDMS के 5-10 एमएल डालो और निम्नलिखित स्पिन प्रोटोकॉल चलाने (बाद में उपयोग के लिए PDMS पर छोड़ दिया बनाए रखने): 15 s (100rpm/s) के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन, 1450 आरपीएम (300 आरपीएम / , और फिर वेफर को 0 आरपीएम (200 आरपीएम/
    4. एक सजातीय PDMS फिल्म मोटाई सुनिश्चित करने के लिए, एक बंद पेट्री डिश में एक स्तर की सतह पर PDMS लेपित वेफर जगह (धूल संदूषण से बचने के लिए). वेफर को 30 मिनट के लिए बैठने दें।
    5. desiccator से प्रवाह परत निकालें और एक ओवन (80 डिग्री सेल्सियस) में प्रवाह और नियंत्रण परतों दोनों जगह है। 28-30 मिनट के लिए दोनों परतों का इलाज और हटाने जब PDMS काफी आघात करने योग्य है हेरफेर करने के लिए, whilst थोड़ा चिपचिपा शेष. संरेखण प्रक्रिया के साथ तुरंत आगे बढ़ें।
  2. संरेखण और आबंधन
    1. एक स्केलपेल का उपयोग करना, प्रवाह परत वेफर पर PDMS से चार उपकरणों में से प्रत्येक को हटा दें. सिलिकॉन वेफर से PDMS परत को हटाने पर, तुरंत धूल कण संदूषण से बचने के लिए स्कॉच टेप के साथ सुविधा पक्ष को कवर।
    2. मोटे तौर पर आंख से नियंत्रण परत पर प्रवाह परत ब्लॉक संरेखित करें, नियंत्रण परत PDMS के साथ संपर्क में डिवाइस की सुविधा पक्ष रखकर. बाद में, समायोजन के दृश्य में सहायता करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, नियंत्रण परत चैनलों के साथ प्रवाह परत चैनलों के चैनलों संरेखित करने के लिए प्रवाह परत ब्लॉकों में से प्रत्येक की स्थिति के लिए ठीक समायोजन करते हैं।
    3. दो PDMS परतों के बीच हवा जेब को दूर करने के लिए दबाव लागू करें। शेष 20:1 अनुपात PDMS पहले गठबंधन प्रवाह परत ब्लॉक के आसपास बचाया डालो. बंधन प्रक्रिया के दौरान पर्याप्त संपर्क सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक डिवाइस पर 100 ग्राम वजन रखें।
    4. 80 डिग्री सेल्सियस ओवन के लिए गठबंधन उपकरणों (भार सहित) लौटें और उन्हें कम से कम 1.5 एच के लिए बांड के लिए छोड़ दें और अब से 6 एच.
  3. डिवाइस समाप्त कर रहा है
    1. ओवन से वेफर निकालें और स्कॉच टेप के साथ प्रत्येक डिवाइस की सुविधा पक्ष को कवर, नियंत्रण परत वेफर से अलग-अलग उपकरणों में से प्रत्येक को निकालने।
    2. इसके अलावा, 9 प्रवाह परत inlets, 24 नियंत्रण परत चैनल inlets, और प्रत्येक डिवाइस के एकल प्रवाह परत आउटलेट में से प्रत्येक के लिए एक एकल छेद पंच. पंच सुविधा पक्ष का सामना करना पड़ रहा है, छेद सुविधा सीमाओं के भीतर छिद्रित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक कैमरा का उपयोग कर.
    3. प्रत्येक डिवाइस के लिए, आइसोप्रोपेनोल और एसीटोन के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड को साफ करें और N2की धारा के नीचे स्लाइड को सुखा लें। इसके बाद, 15 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म प्लेट पर माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें।
    4. पीडीएमएस उपकरणों को कांच की स्लाइडों में जोड़ने के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा एशिंग का उपयोग करें, 45 s के लिए 50 W की एक राख शक्ति लागू करते हुए सुनिश्चित करें कि डिवाइस की सुविधा की ओर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है जब ashing. एक बार पूरा हो जाने पर, डिवाइस सुविधा की ओर कांच स्लाइड पर नीचे रखें, सतहों के बीच फंस गैस को हटाने के लिए दबाव लागू करना।
    5. 1 h. भार डिवाइस के आसंजन में सुधार करने के लिए उपकरणों के शीर्ष पर रखा जा सकता है के लिए 110 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म प्लेट पर बंधुआ उपकरणों प्लेस।

3. हार्डवेयर सेटअप

नोट: microfluidic चिप्स पर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए, हार्डवेयर के कई टुकड़े स्थापित करने और एक दूसरे के साथ जुड़े होने की जरूरत है. हार्डवेयर के तीन अलग समूहों की आवश्यकता है: 1) नियंत्रण चैनलों के लिए वायवीय नियंत्रण प्रणाली, 2) डिवाइस के भीतर प्रतिक्रिया अभिकर्मकों के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक वायवीय दबाव नियामक, और 3) IVTT प्रतिक्रिया समाधान से पहले शांत करने के लिए एक शीतलन प्रणाली माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में इंजेक्शन। चित्र 1में हार्डवेयर सेटअप का ओवरव्यू प्रदान किया गया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल यहाँ प्रदान की संभव के रूप में सामान्य होने का प्रयास है, लेकिन हमारे अनुसंधान भर में इस्तेमाल उपकरणों के कुछ विशिष्ट टुकड़े संदर्भित कर रहे हैं. सभी हार्डवेयर एक ही समारोह करने में सक्षम विकल्प द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, यहाँ प्रोटोकॉल प्रणाली और घटकों में से प्रत्येक की आवश्यकताओं को स्थापित करने के लिए आवश्यक सामान्य चरणों की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक हार्डवेयर setups ब्रोवर एट अल48 और व्हाइट और सड़कों49द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं.

  1. वायवीय नियंत्रण प्रणाली (चित्र 2देखें )
    1. निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर, fieldbus नियंत्रक और उपयोगकर्ता कार्यस्थान के बीच एक TCP कनेक्शन स्थापित करें। नियंत्रण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान की) MODBUS आदेश जो नियंत्रक के लिए टीसीपी कनेक्शन के माध्यम से भेजा जाता है रचना करने के लिए, और परिनालिका वाल्व actuate.
    2. आठ 4-चैनल डिजिटल आउटपुट मॉड्यूल, प्रत्येक solenoid वाल्व के लिए एक इस्तेमाल किया जा रहा है के साथ fieldbus नियंत्रक का विस्तार करें. प्रत्येक परिनालिका वाल्व एक जोड़ने पिन पर अध्यक्षता. डिजिटल आउटपुट मॉड्यूल के जमीन बंदरगाहों में से एक के लिए नकारात्मक तार को जोड़ने whilst डिजिटल आउटपुट मॉड्यूल में से एक पर चार सकारात्मक outputs में से एक के लिए सकारात्मक तार कनेक्ट.
      नोट: सही ढंग से काम करने के लिए प्रणाली प्राप्त करने के लिए, solenoids व्यवस्थित रूप से कनेक्ट किया जाना चाहिए, पहले परिनालिका के साथ पहले आउटपुट पोर्ट से कनेक्ट किया जा रहा, दूसरा एकमात्रन दूसरे आउटपुट पोर्ट के लिए और इतने पर. हमारे सिस्टम में, दो वाल्व arrays क्रमशः 8 और 22 solenoid वाल्व के साथ उपयोग किया जाता है. आउटपुट पोर्ट 1-8 8-वाल्व सरणी से कनेक्ट करें, और आउटपुट पोर्ट 9-30 22-वाल्व सरणी से कनेक्ट करें।
    3. दोनों वाल्व सरणियों को 1"4" ट्यूबिंग का उपयोग करके एक संपीड़ित वायु स्रोत से कनेक्ट करें. दबाव नियामकों का उपयोग करने के लिए 3 बार करने के लिए 22 वाल्व सरणी का दबाव सेट, और 1 पट्टी करने के लिए 8 वाल्व सरणी.
  2. प्रवाह दाब विनियमन (चित्र 3देखें )
    नोट: microfluidic डिवाइस के प्रवाह परत के माध्यम से तरल पदार्थ प्रवाह करने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4-पोर्ट दबाव नियामक प्रयोग किया जाता है। प्रत्येक बंदरगाह के उत्पादन दबाव दबाव नियंत्रक के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर के माध्यम से विनियमित है. दबाव नियामक आपूर्ति की गई USB-कनेक्टर का उपयोग कर किसी कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    1. दबाव नियामक को संपीड़ित वायु स्रोत से कनेक्ट करें, यह सुनिश्चित करना कि आपूर्ति का दबाव नियामक द्वारा अनुमत अधिकतम दबाव से अधिक न हो।
    2. दबाव नियामक के चार महिला Luer ताला उत्पादन बंदरगाहों में से प्रत्येक के लिए 3/32" कंबार संबंधक के लिए एक पुरुष Luer कनेक्टकरें कनेक्ट करें। नरम टयूबिंग की लंबाई से कनेक्ट करें (ओडी: 3 मिमी, आईडी: 1 मिमी, एल: 10 सेमी) कंटक के लिए।
    3. 3/32 करने के लिए एक दूसरे पुरुष Luer कनेक्ट करें" नरम टयूबिंग के खुले अंत करने के लिए कंबाइन संबंधक और तरल जलाशय संबंधक बंदरगाहों के लिए इस देते हैं।
    4. प्रवाह नियामक के प्रत्येक आउटलेट के वांछित दबाव सेट करने के लिए प्रदान किए गए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, microfluidic डिवाइस में अभिकर्मकों के प्रवाह में परिणाम करने के लिए जलाशयों के भीतर संग्रहीत अभिकर्मकों दबाव. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के लिए जलाशयों के कनेक्शन पर खंड 4.2 में चर्चा की जाएगी।
  3. ऑफ-चिप कूलिंग सेटअप (चित्र ााा ं ं ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ा ाा ा ा ा ा ा ा
    1. संपीड़न फिटिंग का उपयोग कर ठंड प्लेट पानी ब्लॉक करने के लिए पानी ठंडा प्रणाली से कनेक्ट करने के लिए पीवीसी ट्यूबिंग (ओडी: 10 मिमी, आईडी: 6 मिमी) का उपयोग करें। एक शीतलक के साथ पानी ठंडा प्रणाली के तरल जलाशय भरें और धीरे से किसी भी फंस हवा विस्थापित करने के लिए इकाई झुकाव, लगातार जलाशय में शीतलक जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि यह पूरा रहता है. जब सभी गैस प्रणाली से हटा दिया जाता है, अपनी अधिकतम मात्रा के लगभग 90-95% के लिए जलाशय भरें.
    2. कुंडल PTFE टयूबिंग (ओडी: 0.042", आईडी: 0.022") Peltier तत्व के ठंडे चेहरे पर और टेप के साथ इस सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि PTFE ट्यूबिंग का एक अंत प्रवाह परत दबाव नियंत्रण प्रणाली के जलाशयों से जुड़ा हुआ है (जैसा कि अनुभाग 4.3 में वर्णित है). PTFE ट्यूबिंग के दूसरे छोर Peltier सतह से कोई अधिक से अधिक 1 सेमी बाहर निकलना चाहिए. पीके ट्यूबिंग की एक 5 - 10 सेमी लंबाई डालें (ओडी: 0.794 मिमी, आईडी: 0.127 मिमी) PTFE टयूबिंग के फैला अंत में. ट्यूबिंग और microfluidic डिवाइस के लिए कनेक्शन के भरने आगे अनुभाग 4.3 में समझाया गया है.
    3. पानी ब्लॉक की ठंड प्लेट पर Peltier तत्व के गर्म चेहरा प्लेस, दो चेहरे के लिए पर्याप्त थर्मल यौगिक लागू. सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग, Peltier तत्व, और ठंडा ब्लॉक हर समय एक दूसरे के साथ सीधे संपर्क में हैं.
    4. तापमान नियंत्रक करने के लिए Peltier तत्व कनेक्ट (एक सीरियल बस कनेक्टर के माध्यम से), इस तरह है कि Peltier करने के लिए आपूर्ति की वोल्टेज विनियमित किया जा सकता है. सुरक्षित रूप से तापमान नियंत्रक के लिए उत्पादन को जोड़ने, Peltier सतह पर एक thermistor जगह है। वाटर कूलर को चालू करने के बाद, पेल्टियर को आपूर्ति किए गए वोल्टेज को तब तक अनुकूलित करें जब तक कि तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर न हो जाए।
      नोट: इस सेटअप के साथ, Peltier तापमान मैन्युअल रूप से आपूर्ति वोल्टेज अनुकूलन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जबकि thermistor केवल तापमान की निगरानी करने के लिए कार्य करता है.

4. एक प्रयोग की तैयारी

नोट: एक प्रयोग शुरू करने से पहले, microfluidic डिवाइस तैयार किया जाना चाहिए, और प्रतिक्रिया अभिकर्मकों डिवाइस में इंजेक्शन के लिए सही ट्यूबिंग में डाला जाना चाहिए. इस खंड पर चर्चा करेंगे: 1) डिवाइस के लिए नियंत्रण चैनल टयूबिंग के कनेक्शन, 2) डिवाइस के लिए uncooled अंतर्वाह अभिकर्मकों के कनेक्शन, और 3) डिवाइस के लिए ठंडा प्रवाह अभिकर्मकों के कनेक्शन.

  1. नियंत्रण चैनल ट्यूबिंग कनेक्ट कर रहा है
    1. microfluidic डिवाइस के नियंत्रण चैनलों में से प्रत्येक के लिए, ट्यूबिंग की लंबाई में कटौती (OD: 0.06", ID: 0.02"). एक छोर पर, एक 23 जी की पिन डालने, 1/2" Luer स्टब और अन्य डालने पर एक स्टेनलेस स्टील जोड़ने पिन (ओडी: 0.65 मिमी, आईडी: 0.35 मिमी, एल: 8 मिमी).
    2. 3/32 करने के लिए एक पुरुष Luer करने के लिए Luer स्टब कनेक्ट करें" कंटक नायलॉन संबंधक. कनेक्टर के कंटक को पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग की लंबाई में डालें (ओडी: 4 मिमी, आईडी: 2.5 मिमी)। इस polyurethane ट्यूबिंग सीधे परिनालिका वाल्व में से एक में डालें.
    3. एक 23 जी, 1/2" Luer स्टब एक सिरिंज करने के लिए संलग्न करें और ट्यूबिंग के एक छोटे (3-4 सेमी) टुकड़ा में इस डालने (ओडी: 0.06", आईडी: 0.02"). इस ट्यूबिंग के खुले सिरको अल्ट्राप्योर पानी के एक जलाशय में रखें और अल्ट्राप्यूर पानी से सिरिंज भरें।
    4. चित्र 5में दर्शाए अनुसार माइक्रोफ्लूइडी उपकरण के प्रत्येक नियंत्रण चैनल की संख्या। प्रत्येक चैनल के लिए (नियंत्रण चैनलों को छोड़कर 1 के माध्यम से 3, जो पानी से भर नहीं रहे हैं), इसी टबिंग (Solenoid वाल्व से जुड़ा) खोजने के लिए और सिरिंज से जुड़ी टयूबिंग के खुले अंत में एक धातु पिन डालें. नियंत्रण चैनल ट्यूबिंग में पानी इंजेक्शन जब तक आधा लंबाई भर दिया गया है.
    5. सिरिंज से ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट करें और स्टेनलेस स्टील कनेक्टर पिन को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के इसी छेद में डालें। सभी नियंत्रण चैनलों के लिए दोहराएँ.
    6. सभी परिनालिका वाल्व खोलने के लिए नियंत्रण इंटरफ़ेस का उपयोग करें। यह नियंत्रण चैनल टयूबिंग के भीतर तरल पदार्थ दबाव होगा, यह microfluidic डिवाइस में मजबूर और डिवाइस के भीतर सभी झिल्ली आधारित वाल्व बंद. डिवाइस के भीतर खुली और बंद झिल्ली का एक उदाहरण चित्र 6में दिया गया है।
  2. डिवाइस से अकूल्ड अभिकर्मकों को कनेक्ट करना
    1. uncooled अभिकर्मकों में से प्रत्येक के लिए, ट्यूबिंग की लंबाई में कटौती (ओडी: 0.06", आईडी: 0.02") microfluidic डिवाइस inlets के लिए जलाशय आउटलेट कनेक्ट करने के लिए.
    2. ट्यूबिंग के एक छोर ले लो और जलाशय में इस डालने, यह सुनिश्चित करना है कि ट्यूबिंग जलाशय के आधार तक पहुँचता है. जलाशय ट्यूबिंग आउटलेट को इस तरह से मजबूत किया जाना चाहिए कि एक हवा तंग मुहर हासिल की जाती है। एक स्टेनलेस स्टील कनेक्शन पिन डालें (ओडी: 0.65 मिमी, आईडी: 0.35 मिमी, एल: 8 मिमी) टयूबिंग के खुले अंत में.
    3. एक छोटे (1 एमएल) सिरिंज के अंत करने के लिए एक 23 जी, 1/2"ल्यूर स्टब संलग्न करें। ट्यूबिंग की एक छोटी लंबाई जोड़ें (ओडी: 0.06", आईडी: 0.02") Luer स्टब करने के लिए. वांछित अभिकर्मक समाधान में ट्यूबिंग के अंत रखने, अभिकर्मक के साथ सिरिंज भरें।
    4. सिरिंज से जुड़े पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग में स्टेनलेस स्टील कनेक्टर पिन डालें और अभिकर्मक के साथ ट्यूबिंग भरें। जब छोटी प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग कर, अभिकर्मक जलाशय में प्रवेश नहीं करेगा, और ट्यूबिंग ही जलाशय के रूप में कार्य करेगा. सिरिंज डिस्कनेक्ट करें और कनेक्टर पिन को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के प्रवाह परत इनलेट छेद में से एक में डालें।
    5. दबाव नियामक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जलाशयों में से प्रत्येक के लिए दबाव लागू करने के लिए microfluidic डिवाइस में अभिकर्मकों मजबूर.
  3. ठंडा तरल पदार्थ microfluidic डिवाइस से कनेक्ट
    1. सुनिश्चित करें कि वाटर कूलर और Peltier तत्व पर दिया गया है, Peltier की सतह के तापमान के साथ 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट. संभव के रूप में microfluidic डिवाइस के करीब के रूप में ठंडा सेटअप माउंट, Peltier और डिवाइस इनलेट के बीच uncooled मात्रा को कम करने.
    2. तरल पदार्थ जलाशयों में से एक से जुड़े ट्यूबिंग के लिए PTFE ट्यूबिंग के खुले अंत कनेक्ट (के रूप में अनुभाग 4.2 में वर्णित) एक स्टेनलेस स्टील संबंधक पिन का उपयोग कर (ओडी: 0.65 मिमी, आईडी: 0.35 मिमी, एल: 8 मिमी).
    3. एक छोटा सी सिरिंज (1 एमएल) एक Luer स्टब करने के लिए कनेक्ट (23 जी, 1/2") ट्यूबिंग की एक छोटी लंबाई के साथ (OD: 0.06", आईडी: 0.02") अंत करने के लिए संलग्न. करने के लिए ठंडा अभिकर्मक (यहाँ, IVTT प्रतिक्रिया समाधान) के साथ सिरिंज भरें।
    4. संयोजी ट्यूबिंग के माध्यम से सिरिंज के लिए PEEK ट्यूबिंग कनेक्ट और सिरिंज करने के लिए लगातार दबाव लागू होते हैं, PEEK ट्यूबिंग के माध्यम से और PTFE ट्यूबिंग में अभिकर्मक मजबूर. सिरिंज से PEEK ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट करें और इसे सीधे माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के प्रवाह चैनल इनलेट्स में से एक में डालें। जब दबाव नियामक सॉफ्टवेयर के माध्यम से लागू किया जाता है ठंडा अभिकर्मक microfluidic डिवाइस में मजबूर हो जाएगा.

5. प्रयोग

नोट: सभी हार्डवेयर और ट्यूबिंग कनेक्शन प्रोटोकॉल वर्गों 3 और 4 में विस्तृत प्रदर्शन करने से पहले पूरा किया जाना चाहिए, और सभी अभिकर्मकों डिवाइस से जुड़ा होना चाहिए. प्रयोगात्मक प्रक्रिया तो चार अलग भागों में विभाजित किया जा सकता है: 1) microfluidic डिवाइस की लोडिंग, 2) माइक्रोस्कोप की तैयारी, 3) डिवाइस के अंशांकन, और 4) प्रयोग प्रदर्शन. कस्टम आभासी नियंत्रण इंटरफ़ेस (चित्र 7देखें ) इस शोध के दौरान इस्तेमाल सामग्री सूची के माध्यम से एक पूरक संसाधन के रूप में प्रदान की जाती है)

  1. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस लोड हो रहा है
    1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस रखें, जिसमें माइक्रोस्कोप चरण में संलग्न सभी नियंत्रण और प्रवाह परत टयूबिंग के साथ और इनक्यूबेटर पर किसी भी उद्घाटन को बंद करें। इनक्यूबेटर के परिवेश ी ताप को 29 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि कूलिंग सिस्टम चालू किया गया है और प्रयोग शुरू करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है।
    2. सुनिश्चित करें कि सभी प्रवाह और नियंत्रण चैनलों दबाव रहे हैं. 1 बार पर नियंत्रण चैनलों 1-3 का दबाव सेट करें, और 3 बार पर नियंत्रण चैनलों 9-29 दबाव. अभिकर्मकों को दबाव नियामक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तरल जलाशयों पर लागू करने के लिए 20 से 100 मीटर के बीच के दबाव की आवश्यकता होती है।
    3. अभिकर्मकों में से एक का उपयोग कर microfluidic डिवाइस से हवा निकालें. डिवाइस के आउटलेट बंद करें (दबाव नियंत्रण चैनल 29) और एक साथ नियंत्रण चैनल 1-3, और 15-28 depressurize. फिर चुनिंदा बहुसंकेतक के नियंत्रण चैनलों को निष्क्रिय कर देते हैं ताकि चयनित अभिकर्मक को डिवाइस में प्रवाहित किया जा सके। हवा को हटाने की निगरानी करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: अभिकर्मकों डिवाइस में सही ढंग से लोड नहीं कर रहे हैं, या हवा के बुलबुले नहीं निकाला जा रहा है कि मामले में, दबाव 350 mbar करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
    4. सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मकों हवा शुरू करने के बिना सही ढंग से प्रवाह - नियंत्रण सॉफ्टवेयर में फ्लश समारोह का उपयोग कर. तरल प्रवाह की निगरानी पहले एक fluorophore लोड हो रहा है और व्यक्तिगत अभिकर्मकों द्वारा अपने विस्थापन की निगरानी द्वारा सरल किया जा सकता है.
  2. माइक्रोस्कोप की तैयारी
    1. माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, ब्याज के किसी भी अंक का पता लगाने (प्रत्येक रिएक्टर के भीतर एक बिंदु पर्याप्त है) microfluidic डिवाइस के भीतर, और उसके निर्देशांक की दुकान. इन बिंदुओं अंशांकन और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान छवि बनाई जाएगी.
      नोट: नियंत्रण सॉफ्टवेयर के भीतर शामिल अंशांकन और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान, माइक्रोस्कोप समय-समय पर पहले से संग्रहीत निर्देशांक पर छवियों पर कब्जा करने के लिए निर्देश दिया है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, नियंत्रण सॉफ्टवेयर माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ संचार, यह नई छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए सूचित. यह संचार प्रत्येक माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए अद्वितीय है, और इस तरह के रूप में इस कार्यक्षमता प्रदान की सॉफ्टवेयर इंटरफेस के भीतर संशोधित किया गया है. बशर्ते एक डमी निष्पादन योग्य है, जिसे अपने माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ संगतता के लिए एंड-यूज़र द्वारा संशोधित किया जा सकता है।
  3. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस को कैलिब्रेट करना
    1. एक एकल अंतर्वाह चरण के दौरान प्रत्येक रिएक्टर से विस्थापित द्रव मात्रा निर्धारित करें (peristaltically actuating नियंत्रण चैनलों द्वारा प्रदान की पंप अनुक्रम, जिसमें 6 MODBUS आदेश क्रमिक रूप से निष्पादित), अंशांकन प्रोटोकॉल को क्रियान्वित करके सॉफ्टवेयर पैकेज में प्रदान की.
    2. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के भीतर निम्नलिखित डेटा क्षेत्रों सेट करें: Elution बफर चैनल, Fluorophore चैनल, Dilution चक्र की संख्या (डिफ़ॉल्ट 10 कमजोर पड़ने है), प्रवाह कदम की संख्या (डिफ़ॉल्ट 15 कदम है), मिश्रण चक्र की संख्या (डिफ़ॉल्ट 4 चक्र है), और चक्र मिश्रण के बीच समय (डिफ़ॉल्ट 0 सेकंड है)। अंशांकन प्रयोग करें दबाकर अंशांकन प्रारंभ करें.
      नोट: अंशांकन प्रक्रिया के दौरान, सभी रिएक्टरों एक फ्लोरोफोर से भर रहे हैं और छवियों को दर्ज कर रहे हैं। बाद में, कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला प्रदर्शन कर रहे हैं जहां एक eluent रिएक्टरों में मीटर है (प्रवाह कदम के सेट संख्या के आधार पर), इस प्रकार fluorophore विस्थापित. अच्छी तरह से मिश्रण के बाद, नए चित्र ले रहे हैं. इस प्रक्रिया को Dilution चक्रके सेट संख्या के लिए दोहराता है.
    3. अंशांकन के पूरा होने पर, नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रस्तुत चरणों का पालन करें, अंशांकन प्रयोग के विश्लेषण को पूरा.
      नोट: विश्लेषण प्रत्येक Dilution चक्रके दौरान दर्ज की गई फ्लोरोसेंट कमी के आधार पर प्रत्येक रिएक्टर के लिए ताज़ा अनुपात के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करेगा। यह मान इनफ्लो स्टेप्सके सेट संख्या से विस्थापित रिएक्टर आयतन आयतन के अंश को इंगित करता है . बदले में, यह मान एक विशिष्ट रिएक्टर मात्रा विस्थापित करने के लिए कितने अंतर्वाह चरणों की आवश्यकता है यह निर्धारित करने के लिए प्रयोगों के दौरान उपयोग किया जाएगा।
  4. प्रयोग कर रहा है
    1. वर्चुअल नियंत्रण इंटरफ़ेस में इच्छित प्रयोग के लिए आवश्यक मान सेट करें. महत्वपूर्ण ताज़ा अंश है [%] जो रिएक्टर मात्रा प्रयोगात्मक चक्र के अनुसार विस्थापित निर्धारित करता है और के बीच सेट किया जाना चाहिए 15 और 40%.
      नोट: विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल यह निर्धारित करेगा कि प्रयोग शुरू करने से पहले नियंत्रण इंटरफ़ेस के कौन से फ़ील्ड सेट किए जाने चाहिए. कुछ मामूली कोडिंग उपन्यास प्रयोगों के लिए नियंत्रण इंटरफ़ेस अनुकूल करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    2. नियंत्रण इंटरफ़ेस में प्रयोग करें बटन दबाकर प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आरंभ करें।
      नोट: Unaltered, प्रदान की सॉफ्टवेयर एक साधारण प्रोटीन अभिव्यक्ति शुरू करता है. रिएक्टरों 1 और 8 नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, जबकि रिएक्टरों 2-7 घर समान प्रयोगों. यहाँ, रिएक्टर मात्रा के 75% IVTT समाधान शामिल हैं, और 25% या तो ultrapure पानी या एक 2.5 एनएम रैखिक डीएनए समाधान है. Dilutions हर 15 मिनट में होते हैं, रिएक्टर मात्रा के 30% के साथ कमजोर पड़ने प्रति विस्थापित किया जा रहा है. छवियाँ प्रत्येक कमजोर पड़ने चक्र के अंत में दर्ज कर रहे हैं.

6. डेटा विश्लेषण

नोट: छवियों के विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट प्रदान की गई है (पूरक फाइलें या सामग्री की तालिकादेखें), 'bfopen' विश्लेषण पैकेज का उपयोग कर, जो की समीक्षा के लिए आवश्यक है '.nd2' फ़ाइलों (हमारे द्वारा प्रदान की सूक्ष्मदर्शी सेटअप)

  1. विश्लेषण स्क्रिप्ट 'अंशांकनScript.m' चलाएँ और एक बार वांछित का चयन करें' .nd2' फ़ाइल के लिए प्रेरित किया। एक एकल रिएक्टर छवि जिसके साथ सही छवि तीव्रता निर्धारित किया जा सकता है दिखाया जाएगा. इस तरह कि microfluidic चैनल के किनारों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं छवि तीव्रता का अनुकूलन करने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें।
  2. रिएक्टर की एक छवि दिखाई जाएगी। इस छवि के भीतर, रिएक्टर चैनल के अंदर एक क्षेत्र है जो फ्लोरोसेंट तीव्रता निर्धारित किया जाना चाहिए का चयन करें.
    नोट: प्रत्येक दर्ज की गई छवि के लिए प्रत्येक रिएक्टर के फ्लोरोसेंट तीव्रता एक साधारण साजिश में प्रदर्शित परिणामों के साथ निर्धारित किया जाएगा, परिणामों के visualisation की अनुमति.

Representative Results

IVTT प्रयोगों के चालन के लिए बहुपरत microfluidic मंच की प्रभावशीलता प्रदर्शित करने के लिए, वर्णित सेटअप deGFP प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रयोग एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध30 IVTT प्रतिक्रिया मिश्रण में आयोजित किया गया था - सभी आवश्यक प्रतिलेखन और अनुवाद घटक शामिल - प्रतिक्रिया substrates और डीएनए टेम्पलेट्स के साथ पूरक. प्रयोग 29 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर किए गए थे; प्रोटीन की IVTT अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम पाया जाने वाला तापमान।

माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में नौ अद्वितीय इनलेट होते हैं, जिनमें से चार का उपयोग इस प्रयोग के दौरान किया गया था। पहले वाणिज्यिक रूप से प्राप्त IVTT प्रतिक्रिया मिश्रण निहित. IVTT प्रतिक्रिया मिश्रण सफलतापूर्वक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए आवश्यक सभी घटकों को समायोजित हालांकि, शुद्ध GamS प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था - 1.3 डिग्री की एक अंतिम एकाग्रता पर - microfluidic डिवाइस में लोड करने से पहले. GamS प्रोटीन के अलावा रैखिक डीएनए प्रजातियों की गिरावट को कम करने के लिए कार्य करता है जब प्रयोगों प्रदर्शन. महत्वपूर्ण बात यह है कि आईवीटीटी मिश्रण को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में इंजेक्शन से पहले समाधान को ठंडा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के सतह तापमान के साथ एक Peltier तत्व पर coiled polytetrafluoroethylene (PTFE) ट्यूबिंग में इंजेक्ट किया गया था; इसके उपयोग से पहले प्रतिक्रिया समाधान की गिरावट को रोकने. माइक्रो-बोर polyether ईथर कीटोन (PEEK) ट्यूबिंग microfluidic डिवाइस के साथ Peltier तत्व सतह छोड़ने PTFE ट्यूबिंग कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, IVTT प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा को ठंडा नहीं किया जा रहा है. डिवाइस में डाला दूसरा समाधान deGFP के लिए रैखिक डीएनए टेम्पलेट कोडिंग निहित - ultrapure पानी में भंग - 10 एनएम की एकाग्रता पर. तीसरा समाधान, अल्ट्राप्यूर पानी, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान कई प्रयोजनों की सेवा की। मुख्य रूप से, ultrapure पानी यह सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि कमजोर पड़ने प्रति विस्थापित मात्रा सभी रिएक्टरों के लिए बराबर थी, नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में डीएनए के लिए एक प्रतिस्थापन के रूप में कार्य. इसके अतिरिक्त, अल्ट्राप्यूरे पानी भी डिवाइस अंशांकन के दौरान फ्लोरोफोर को कमजोर करने के लिए और अभिकर्मकों के बीच स्विच करते समय डिवाइस की मृत मात्रा फ्लश करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डिवाइस में सम्मिलित अंतिम समाधान प्रारंभिक डिवाइस अंशांकन करने के लिए आवश्यक एक शुद्ध FITC-dextran समाधान (25 डिग्री सेल्सियस) था। डीएनए, पानी, और फ्लोरोफोर समाधान ट्यूबिंग में इंजेक्ट किए गए थे (0.02 "आईडी, 0.06" ओडी) जो बाद में प्रोटोकॉल की धारा 4.2 के अनुसार microfluidic डिवाइस के प्रवाह चैनलों में से एक में डाला जा सकता है. इस प्रकार, इन समाधानों को प्रयोगों की संपूर्णता के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया गया था।

microfluidic डिवाइस के नियंत्रण चैनलों के actuation कस्टम नियंत्रण सॉफ्टवेयर जहां नियंत्रण चैनलों में से प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से actuated किया जा सकता है के माध्यम से हासिल की है. लंबे समय तक IVTT प्रतिक्रियाओं के निष्पादन इस मैनुअल प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है और नियंत्रण सॉफ्टवेयर के भीतर शामिल स्वचालित प्रोटोकॉल के उपयोग की आवश्यकता है. प्रयोगों के लिए एक microfluidic डिवाइस की तैयारी करते समय, इसी तरह स्वचालित प्रोटोकॉल उपयोगी प्रक्रियाओं की एक संख्या को निष्पादित करने के लिए उपयोग किया जा सकता: एक नया अभिकर्मक के साथ डिवाइस मृत मात्रा के फ्लशिंग, अंगूठी रिएक्टर के भीतर अभिकर्मकों के मिश्रण, और की लोडिंग रिएक्टर में एक नया अभिकर्मक वर्तमान समाधान के एक बराबर मात्रा displacing whilst. इसके अलावा, दो जटिल प्रक्रिया उपलब्ध हैं: एक डिवाइस अंशांकन के चालन, और एक लंबे समय तक सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति के निष्पादन. ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाओं के सभी आसानी से मुख्य अंतरफलक से निष्पादित किया जा सकता है, इस तरह के प्रवाह चैनल, अंतर्प्रवाह मात्रा, और मिश्रण अवधि के रूप में विशिष्ट प्रक्रिया सेटिंग्स भिन्न करने के लिए कई मापदंडों विन्यस्त करने की क्षमता के साथ।

microfluidic डिवाइस निर्माण के दौरान दबाव और खामियों में उतार चढ़ाव के कारण, एक इंजेक्शन चक्र के दौरान विस्थापित तरल पदार्थ की मात्रा उपकरणों के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस प्रकार, IVTT प्रयोगों के निष्पादन से पहले, प्रति इंजेक्शन चक्र विस्थापित रिएक्टर मात्रा (रिफ्रेश अंश) निर्धारित किया गया था. इस अंशांकन एक फ्लोरोसेंट संदर्भ समाधान के साथ सभी आठ रिएक्टरों के भरने की आवश्यकता है. इस स्थिति में, एक शुद्ध FITC-dextran समाधान (25 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग किया गया था। इसके बाद, रिएक्टरों को अल्ट्राप्योर पानी से 10 बार पतला किया जाता है। प्रत्येक रिएक्टर के लिए कमजोर पड़ने चक्र प्रति फ्लोरोसेंट में कमी को मापने के द्वारा, एक इंजेक्शन चक्र के दौरान विस्थापित तरल पदार्थ की मात्रा निर्धारित किया गया था. नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के भीतर, यह मान IVTT प्रयोग के दौरान उपयोग के लिए रिकॉर्ड किया गया था. महत्वपूर्ण बात, डिवाइस भर में प्रवाह दर में बदलाव के लिए खाते में, साथ ही व्यक्तिगत रिएक्टर संस्करणों में विसंगतियों, ताज़ा अनुपात निर्धारित किया जाता है और प्रत्येक व्यक्ति रिएक्टर के लिए संग्रहीत. रिएक्टरों को भरने और कम करने का अनुक्रम स्वचालित रूप से परफॉर्म कैलिब्रेशन प्रोग्राम का उपयोग करके आयोजित किया गया था जो नियंत्रण सॉफ्टवेयर का हिस्सा है। अंशांकन प्रयोग के परिणाम चित्र 8 में दर्शाएगए हैं।

सबसे जटिल पूर्व क्रमादेशित प्रक्रिया एक लंबी अवधि IVTT प्रयोग निष्पादित करता है, उपयोगकर्ताओं को प्रयोग आरंभ करने की अनुमति है और बाद में इसे पूरा होने तक उपेक्षित संचालित करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रयोग के दौरान, रिएक्टरों 1 और 5 रिक्त स्थान के रूप में इस्तेमाल किया गया, केवल पानी के साथ कमजोर पड़ने के दौरान रिएक्टरों में जोड़ा जा रहा है. रिएक्टरों 2 और 6 नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया और केवल IVTT प्रतिक्रिया समाधान और ultrapure पानी निहित. शेष रिएक्टरों (3, 4, 7, और 8) IVTT प्रतिक्रिया समाधान और deGFP जीन के लिए रैखिक डीएनए कोडिंग के 2.5 एनएम निहित. रिएक्टरों का प्रारंभीकरण पूरी तरह से सभी रिएक्टरों को भरने के द्वारा प्राप्त किया जाता है (1 और 5 को छोड़कर) IVTT प्रतिक्रिया समाधान के साथ, इससे पहले कि रिएक्टर मात्रा का 25% अल्ट्रापुरे पानी से विस्थापित किया गया था। इसके बाद, रिएक्टरों में अभिकर्मकों का आवधिक इंजेक्शन शुरू किया गया था। प्रयोग इस तरह से किया गया था कि नए अभिकर्मकों रिएक्टरों में हर 14.7 मिनट इंजेक्शन थे, रिएक्टर मात्रा का 30% प्रत्येक कमजोर पड़ने चक्र के दौरान विस्थापित किया जा रहा है के साथ. प्रत्येक इंजेक्शन की संरचना ऐसी थी कि इंजेक्शन तरल पदार्थ के 75% ताजा IVTT समाधान शामिल थे, जबकि शेष 25% या तो डीएनए या ultrapure पानी से मिलकर. नए अभिकर्मकों के प्रत्येक इंजेक्शन के बाद रिएक्टरों लगातार मिश्रित किया गया, जिसके बाद प्रत्येक रिएक्टर के एक फ्लोरोसेंट छवि माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज किया गया था। प्रतिक्रिया बाद में 68 चक्र के लिए लगातार चलाने के लिए अनुमति दी गई थी, 16.5 घंटे की एक प्रयोगात्मक अवधि में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रयोग के परिणाम चित्र 9में दिए गए हैं।

लंबे समय तक IVTT प्रयोगों प्रदर्शन करते समय, प्रतिक्रिया की विफलता के दो मुख्य कारण हैं; माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में हवा का परिचय या IVTT प्रतिक्रिया समाधान की गिरावट। microfluidic डिवाइस के भीतर हवा की घटना अक्सर प्रवाह समाधान है, जो बाद में microfluidic डिवाइस में इंजेक्शन रहे हैं में मौजूदा छोटे हवा बुलबुले का प्रत्यक्ष परिणाम है. डिवाइस में प्रवेश करने पर, हवा की उपस्थिति तरल पदार्थ के उचित प्रवाह को रोकता है, जिससे प्रतिक्रियाओं अब समय-समय पर रिएक्टर के छल्ले के भीतर बैच प्रतिक्रियाओं के गठन के लिए अग्रणी ताजा कर रहे हैं। कुछ मामलों में, अभिकर्मकों की बार-बार फ्लशिंग द्वारा वायु को धीरे-धीरे डिवाइस से निकाल दिया जाता है, जिसके बाद अभिक्रिया अभिप्रेत के अनुसार जारी रहती है (जैसा कि चित्र 9में दिखाया गया है)। अन्य मामलों में हवा फंस रहता है, और केवल प्रयोग निरस्त और बाद में microfluidic डिवाइस के प्रवाह परत के लिए निरंतर (उच्च) दबाव लागू करने से हटाया जा सकता है, प्रोटोकॉल की धारा 5.1 में वर्णित भरने की प्रक्रिया के अनुरूप. हमारे प्रयोगों के दौरान सेल lysate एक Peltier तत्व पर PTFE टयूबिंग में संग्रहीत किया जाता है 4 डिग्री सेल्सियस ठंडा. दोनों उपायों समय के साथ IVTT प्रतिक्रिया समाधान की गिरावट को सीमित करने में सहायता, निष्क्रिय PTFE ट्यूबिंग ट्यूबिंग और प्रतिक्रिया समाधान और ठंडे तापमान कार्यात्मक (जैव) आणविक संरक्षण के बीच सीमित बातचीत सुनिश्चित करने के साथ घटक IVTT प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। प्रतिक्रिया समाधान की गिरावट होती है - प्रतिक्रिया समाधान और भंडारण पर्यावरण के बीच अपर्याप्त ठंडा या अवांछित बातचीत के परिणाम के रूप में - तो यह खुद को प्रयोगात्मक प्रोटीन की एक क्रमिक कमी के रूप में प्रदर्शित करेगा समय के साथ अभिव्यक्ति. एक बार निम्नीकृत होने के बाद, IVTT प्रतिक्रिया समाधान को पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता और एक नया प्रयोग तैयार किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्र 1. निरंतर IVTT प्रतिक्रियाओं को करने के लिए आवश्यक हार्डवेयर सेटअप. एक) हार्डवेयर सेटअप के Schematic. ख) इस पांडुलिपि भर में इस्तेमाल सेटअप की तस्वीर. सतत IVTT प्रतिक्रियाओं के लिए एक बहुपरत microfluidic डिवाइस के कार्यान्वयन प्रवाह दबाव को विनियमित करने के लिए एक व्यापक हार्डवेयर सेटअप की आवश्यकता है, नियंत्रण चैनलों, गर्मी और शांत प्रतिक्रियाओं और अभिकर्मकों, स्टोर तरल पदार्थ, और छवि के दौरान डिवाइस प्रयोगों. प्रयोग 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर किए जाते हैं, जो इस तापमान पर एक इन्क्यूबेटर सेट के भीतर माइक्रोस्कोप रखकर प्राप्त किया जाता है। IVTT प्रतिक्रिया समाधान की गिरावट को रोकने के लिए, यह PTFE ट्यूबिंग के भीतर संग्रहीत किया जाता है एक Peltier तत्व के ठंडे चेहरे पर coiled. Peltier तत्व का तापमान 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट किया गया है, एक पानी कूलर और पानी ब्लॉक के साथ इस तापमान को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. अभिकर्मकों को जो ठंडा करने की आवश्यकता नहीं होती है, माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर के बाहर तरल जलाशयों में संग्रहीत की जाती हैं। एक कंप्यूटर नियंत्रित दबाव नियामक द्वारा इन जलाशयों पर लगातार दबाव लागू किया जाता है। इस तरह, तरल पदार्थ जलाशयों के आउटलेट ट्यूबिंग के माध्यम से मजबूर कर रहे हैं, जो microfluidic डिवाइस के प्रवाह चैनलों से सीधे कनेक्ट. microfluidic डिवाइस के नियंत्रण चैनलों में से प्रत्येक एक वायवीय वाल्व से जुड़ा हुआ है. पूरे वाल्व सरणी लगातार दबाव में है. वाल्व खोलने, microfluidic डिवाइस के नियंत्रण चैनल के लिए वायवीय वाल्व को जोड़ने ट्यूबिंग के भीतर तरल पदार्थ के दबाव के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार खोलने और microfluidic डिवाइस के भीतर पाया PDMS झिल्ली बंद. वायवीय वाल्व खोला और एक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस जो एक fieldbus नियंत्रक आदेश के माध्यम से बंद कर रहे हैं (नहीं दिखाया) खोलने के लिए और विशिष्ट वायवीय वाल्व बंद करने के लिए. येलेश्वरपु एट अल22से अनुकूलित चित्र । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. वायवीय वाल्व सेटअप और नियंत्रण चैनल कनेक्शन का अवलोकन. एक 8 वाल्व सरणी वाल्व 1, 2, और 3 के लिए फिट तीन नियंत्रण चैनल कनेक्शन के साथ दिखाया गया है। संपीड़ित हवा वाल्व सरणी के लिए आपूर्ति की जा सकती है के माध्यम से 1 "4" ट्यूबिंग. नियंत्रण चैनलों के actuations के लिए दो दबाव का उपयोग किया जाता है: कम दबाव नियंत्रण चैनलों के लिए 1 बार (1, 2, और 3) और उच्च दबाव नियंत्रण चैनलों के लिए 3 बार (9 के माध्यम से 30, यहाँ नहीं दिखाया). ट्यूबिंग ultrapure पानी से भरा जा सकता है और एक स्टेनलेस स्टील संबंधक पिन का उपयोग कर नियंत्रण चैनल inlets में से एक में डाला. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. वाणिज्यिक प्रवाह दबाव नियामक और जलाशय प्रणाली का अवलोकन. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दबाव नियामक का उपयोग बहुपरत माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के प्रवाह परत में तरल पदार्थ इंजेक्ट करने के लिए किया जाता है। एक कंप्यूटर के लिए दबाव नियंत्रक कनेक्ट तरल पदार्थ इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया दबाव के मॉडुलन के लिए अनुमति देता है। अभिकर्मकों को एक द्रव जलाशय में संग्रहित किया जा सकता है, जो सीधे दबाव नियामक से जुड़ा होता है। जलाशय के लिए दबाव के आवेदन आउटलेट ट्यूबिंग के माध्यम से जलाशय से बाहर तरल पदार्थ बलों. इस आउटलेट टयूबिंग एक स्टेनलेस स्टील कनेक्टर पिन का उपयोग microfluidic डिवाइस के तरल पदार्थ inlets में से एक के लिए सीधे जोड़ा जा सकता है. घटना में है कि अभिकर्मक मात्रा तरल जलाशय तक पहुँचने में असमर्थ है, आउटलेट टयूबिंग अभिकर्मक के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. प्रतिक्रिया अभिकर्मकों को ठंडा करने के लिए उपयोग किया जाने वाले कूलिंग सिस्टम का अवलोकन। (बाएं)अलग ठंडा सेटअप और (दाएं) शीतलक सेटअप माइक्रोस्कोप के भीतर रखा और microfluidic डिवाइस से जुड़ा. एक Peltier तत्व microfluidic डिवाइस में इंजेक्शन से पहले IVTT प्रतिक्रिया समाधान शांत करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अभिकर्मक PTFE ट्यूबिंग के भीतर संग्रहीत किया जाता है Peltier तत्व के ठंडे चेहरे पर coiled. PEEK ट्यूबिंग की लंबाई microfluidic डिवाइस के लिए ठंडा तरल पदार्थ हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, छोटे आंतरिक व्यास के साथ (0.005") अभिकर्मक मात्रा को कम करने अब ठंडा किया जा रहा है. coiled PTFE ट्यूबिंग के साथ, एक thermistor रखा गया है, Peltier तत्व की सतह पर वास्तविक समय तापमान की निगरानी के लिए अनुमति देता है. Peltier के लिए लागू वोल्टेज इस तरह सेट किया गया है कि Peltier की सतह का तापमान 0 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस के बीच रहता है। Peltier तत्व द्वारा उत्पादित अतिरिक्त गर्मी को दूर करने के लिए, Peltier के गर्म चेहरा एक पानी ठंडा ब्लॉक के खिलाफ रखा गया है, सिलिकॉन मुक्त गर्मी सिंक तेल के अलावा दो चेहरे के बीच इष्टतम गर्मी हस्तांतरण सुनिश्चित करने के साथ. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. microfluidic डिवाइस डिजाइन का अवलोकन. सतत IVTT प्रतिक्रियाओं के लिए microfluidic प्रवाह रिएक्टर आठ रिएक्टर के छल्ले के होते हैं, 10.7 एनएल की एक मात्रा के साथ प्रत्येक. नौ inlets डिवाइस में नौ अद्वितीय प्रतिक्रिया समाधान के प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं. 24 नियंत्रण चैनल ों को डिवाइस के भीतर तरल पदार्थ के प्रवाह को विनियमित. नियंत्रण चैनल 9 से 14 फार्म एक बहुसंकेतक. इन नियंत्रण चैनलों डिवाइस में तरल पदार्थ के प्रवाह को बाधित करने के लिए हर समय दबाव डाला जाना चाहिए. एक साथ दो नियंत्रण चैनलों के निराशाजनक एक एकल अभिकर्मक के प्रवाह के लिए अनुमति देता है. नियंत्रण चैनल 15, 16, और 17 peristaltically एक नियंत्रित तरीके से डिवाइस में अभिकर्मकों पंप करने के लिए उपयोग किया जाता है. नियंत्रण चैनल 18 से 25 प्रत्येक डिवाइस के भीतर पाया आठ रिएक्टरों में से एक के प्रवेश नियंत्रण. नियंत्रण चैनल 26 फ्लश चैनल बंद कर सकते हैं, इस प्रकार रिएक्टरों में तरल पदार्थ मजबूर. नियंत्रण चैनल 27 रिएक्टरों के सजातीय भरने में एड्स. नियंत्रण चैनल 28 और 29 क्रमशः रिंग रिएक्टर आउटलेट और एकमात्र डिवाइस आउटलेट को विनियमित करते हैं। अंत में, नियंत्रण चैनल 1, 2, और 3 peristaltically अंगूठी रिएक्टरों के भीतर तरल पदार्थ पंप करने के लिए उपयोग किया जाता है, अभिकर्मकों के मिश्रण में जिसके परिणामस्वरूप. इस microfluidic डिवाइस और आंकड़ा के डिजाइन दोनों Neiderholtmeyer एट अल29से अनुकूलित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के भीतर झिल्ली आधारित वाल्व. A) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के भीतर प्रवाह चैनल। दो नियंत्रण चैनलों पृष्ठभूमि में देखा जा सकता है. इन चैनलों दबाव नहीं कर रहे हैं और इस तरह के वाल्व के रूप में खुले हैं (प्रवाह प्रवाह कर सकते हैं). बी) प्रवाह परत चैनलों को एक दूसरे को काट दो नियंत्रण चैनलों दबाव डाला गया है, वाल्व बंद (यानी, तरल प्रवाह बाधित है). नियंत्रण चैनलों के दबाव पर, प्रवाह और नियंत्रण परत चैनलों को अलग पतली PDMS झिल्ली ऊपर की ओर मोड़दिया है (नियंत्रण परत प्रवाह परत के नीचे निहित है) जो प्रवाह परत चैनल बंद कर देता है. प्रवाह परत चैनल का गोलाई यह सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण है कि विक्षेपित झिल्ली प्रवाह चैनल को पूरी तरह से बंद कर देती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7. माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाने वाला यूजर इंटरफेस। इस शोध के दौरान, एक कस्टम नियंत्रण इंटरफ़ेस microfluidic उपकरणों के भीतर तरल पदार्थ के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इंटरफ़ेस उपयोगकर्ताओं को व्यक्तिगत रूप से नियंत्रण चैनलों में से प्रत्येक (संख्या 1-3 और 9-29) का पता लगाने के लिए, या अभिकर्मकों के फ्लशिंग और लोड हो रहा है में जिसके परिणामस्वरूप विस्तृत प्रोटोकॉल निष्पादित करने के लिए अनुमति देता है, microfluidic डिवाइस के अंशांकन, और के निष्पादन प्रयोगों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8. अंशांकन प्रयोग के परिणाम. एक अंशांकन प्रयोग के दौरान, रिएक्टरों एक फ्लोरोफोर (25 डिग्री फिट-Dextran) जिसके बाद फ्लोरोसेंट तीव्रता दर्ज की गई है से भर रहे हैं। बाद में, कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का पालन करें, जहां एक सेट संख्या में अंतर्वाह कदम (15) रिएक्टरों में अल्ट्राप्यूर पानी इंजेक्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक कमजोर पड़ने के बाद, अभिकर्मकों मिश्रित कर रहे हैं और फ्लोरोसेंट मापा जाता है. कमजोर पड़ने प्रति फ्लोरोसेंट तीव्रता में कमी अंतर्वाह कदम के सेट संख्या के लिए विस्थापित रिएक्टर अंगूठी की मात्रा का पता चलता है; एक मान जिसे ताज़ा अनुपातकहा जाता है, अ)सभी आठ रिएक्टरों की औसत तीव्रता और मानक विचलन लाल रंग में दिखाया गया है, जिसमें अलग-अलग तीव्रता के निशान धूसर दिखाई देते हैं। ख) औसत ताज़ा अनुपात और मानक विचलन लाल रंग में प्रत्येक कमजोर पड़ने कदम के लिए दिखाया गया है. प्रत्येक रिएक्टर के व्यक्तिगत ताज़ा अनुपात ग्रे में दिखाए जाते हैं। यह देखा जा सकता है कि आठ रिएक्टरों में से सात बहुत समान व्यवहार दिखाते हैं, हालांकि एक रिएक्टर सातवें कमजोर पड़ने चक्र के बाद ताज़ा अनुपात में उतार-चढ़ाव दिखाता है। यह रिएक्टरों में अभिकर्मकों के इंजेक्शन के लिए एक औसत ताज़ा अनुपात का उपयोग करने के लिए विरोध के रूप में प्रत्येक रिएक्टरों के लिए अद्वितीय ताज़ा अनुपात की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9. deGFP प्रोटीन व्यक्त एक IVTT प्रयोग के परिणाम. एक लंबे समय तक IVTT प्रतिक्रिया इस तरह शुरू की गई थी कि रिएक्टर मात्रा का 30% हर 14.6 मिनट में विस्थापित हो जाता है। प्रतिक्रिया समाप्त होने से पहले 16 घंटे से अधिक के लिए चलाने के लिए अनुमति दी गई थी. microfluidic डिवाइस के दो रिएक्टरों रिक्त स्थान के रूप में इस्तेमाल किया गया, केवल ultrapure पानी प्रयोग के दौरान रिएक्टरों के माध्यम से भेजा जा रहा है के साथ (रिएक्टर्स 1 और 5). अन्य सभी रिएक्टरों 75% IVTT प्रतिक्रिया समाधान और या तो ultrapure पानी का 25% शामिल (reactors 2 और 6) या 2.5 एनएम रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स deGFP की अभिव्यक्ति के लिए कोडिंग (रिएक्टर्स 3, 4, 7, और 8). सभी चार रिएक्टरों में जहां डीएनए जोड़ा गया था, वहाँ स्पष्ट deGFP अभिव्यक्ति है. चार रिएक्टरों में से तीन इसी तरह की फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रदान करते हैं, एक रिएक्टर कम फ्लोरोसेंट संकेत प्रदर्शित करने के साथ। यह कम डीएनए रिएक्टर में प्रवेश करने में जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह में असमानता के कारण हो सकता है, या रिएक्टर आयामों में बदलाव के कारण. 14 घंटे के बाद, डीएनए युक्त रिएक्टरों के संकेत में अचानक वृद्धि देखी जाती है। यह एक हवा के बुलबुले microfluidic डिवाइस के प्रवाह परत में प्रवेश के कारण होता है, संभवतः प्रवाह समाधान में से एक से शुरू. microfluidic डिवाइस में हवा के फँसाने काफी चैनलों के माध्यम से तरल पदार्थ के प्रवाह को सीमित करता है, जिससे कोई ताजा अभिकर्मकों को जोड़ा जा सकता है या रिएक्टरों से हटा दिया जब तक हवा पारित कर दिया है. प्रवाह की बहाली पर, प्रयोग अपने पिछले फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए रिटर्न. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइलें. कृपया इन फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Discussion

एक PDMS आधारित बहुपरत microfluidic डिवाइस प्रस्तुत किया गया है, और समय की लंबी अवधि के लिए IVTT प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया गया है. हालांकि अच्छी तरह से इस विशिष्ट उदाहरण के लिए अनुकूल है, इस तकनीक conceivably कई अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तरल पदार्थ के प्रवाह पर अतिरिक्त नियंत्रण - लगातार प्रतिक्रिया अभिकर्मकों को हटाने whilst (द्वारा) उत्पादों की भरपाई करने की क्षमता के साथ युग्मित - निरंतर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के लिए आदर्श है, विभिन्न गतिशील व्यवहार की जांच, और एक साथ एक प्रतिक्रिया के कई रूपों का चालन.

PDMS आधारित उपकरणों के अपेक्षाकृत सरल निर्माण प्रक्रिया के बावजूद, उसके उपयोग के लिए एक व्यापक हार्डवेयर सेटअप की आवश्यकता होती है। वाल्व सरणियों, दबाव नियामकों, दबाव पंप, इनक्यूबेटर, और ठंडा इकाइयों को शामिल करते हुए, निर्माण से उपयोग करने के लिए संक्रमण प्राथमिक नहीं है, और एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक निवेश की आवश्यकता है। इसके अलावा, इन डिवाइस के साथ लगातार सेट-अप करने और सफल प्रयोग करने की क्षमता के लिए एक महत्वपूर्ण समय-निवेश की आवश्यकता होती है; एक बिंदु है जो इस पांडुलिपि को संबोधित करना है. हालांकि, एक बार जगह में, पूरे सेटअप प्रयोजनों की एक श्रृंखला के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, हार्डवेयर सेटअप कई मॉड्यूलर तत्वों, जिनमें से प्रत्येक और अधिक जटिल microfluidic डिवाइस डिजाइन नियोजित किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए विस्तार किया जा सकता शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, मॉड्यूलर डिजाइन हार्डवेयर घटकों के प्रतिस्थापन इसी तरह कार्य विकल्प द्वारा सक्षम बनाता है, जैसे कि उपयोगकर्ताओं को विशिष्ट सेटअप यहाँ वर्णित करने के लिए सीमित नहीं हैं48,49.

अलग-अलग डिवाइस के बीच भिन्नता, और बाहरी स्थितियों में (जैसे दबाव में उतार-चढ़ाव) इन उपकरणों का उपयोग करते हुए प्रयोग करते समय अशुद्धि में परिणाम कर सकते हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, प्रत्येक प्रयोग से पहले सिस्टम का एक अंशांकन किया जाना चाहिए, प्रत्येक रिएक्टरों के लिए एक अद्वितीय ताज़ा अनुपात प्रदान. अंशांकन डिवाइस से डिवाइस और प्रयोग करने के लिए प्रयोग विविधताओं पते Whilst, यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया है और निर्दोष नहीं है. भिन्न विस्कोसकेवियों के साथ द्रव समान दबाव के संपर्क में आने पर समान दर के साथ प्रवाह नहीं होगा, और इस तरह के कई अभिकर्मकों के साथ अंशांकन प्रदर्शन समान ताज़ा अनुपातउपज नहीं हो सकताहै। इस प्रभाव को तीन नियंत्रण चैनलों का उपयोग करके क्षीण किया जाता है ताकि अभिकर्मकों को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में पंप किया जा सके, जैसा कि केवल आपूर्ति किए गए दबाव को अलग करके प्रवाह को विनियमित करने का विरोध किया गया था। मामलों में एक अंतिम उपाय के रूप में जहां चिपचिपापन में असमानता बहुत बड़ी है, एक अद्वितीय ताज़ा अनुपात एकाधिक अंशांकन प्रयोगों के प्रदर्शन के द्वारा प्रत्येक व्यक्ति अभिकर्मक के लिए लागू किया जा सकता है.

माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में अभिकर्मकों को इंजेक्ट करने के लिए एक peristaltic पंप का उपयोग अलग-अलग विस्कोसिटी के साथ समाधान का उपयोग करने के प्रभाव को कम करता है, हालांकि यह एक माध्यमिक समस्या भी पैदा करता है। माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में तरल पदार्थ पंप करने के लिए असतत चरणों का उपयोग करना, इसका मतलब है कि एक रिएक्टर में इंजेक्शन के संकल्प, एक एकल पंप चक्र प्रदर्शन करते समय इंजेक्शन मात्रा द्वारा सीमित है. हमारे शोध के भीतर इस मूल्य - अंशांकन के दौरान निर्धारित - लगभग 1% के बराबर है, यह दर्शाता है कि एक एकल पंप चक्र रिएक्टर मात्रा के लगभग 1% विस्थापित (के बारे में 0.1 nL). इस तरह के रूप में, रिएक्टर मात्रा के 30% displacing 30 पंप चक्र के निष्पादन की आवश्यकता है, IVTT प्रतिक्रिया समाधान के 23 पंप चक्र के साथ जोड़ा जा रहा है, और डीएनए या ultrapure पानी के केवल 7 पंप चक्र जोड़ा जा रहा है. हालांकि हमारे शोध के लिए पर्याप्त, वैकल्पिक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल समस्याओं का सामना कर सकते हैं जब अद्वितीय अभिकर्मकों की बड़ी संख्या में जोड़ने का प्रयास, एक कम ताज़ा अंशका उपयोग करें, या एक रिएक्टर के लिए एक एकल अभिकर्मक की छोटी मात्रा में जोड़ें. ऐसे मामलों में, microfluidic डिवाइस डिजाइन एक बड़ी मात्रा के साथ रिएक्टरों प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस तरह का एक उदाहरण Niederholtmeyer एट अल36में सूचना दी है.

महत्वपूर्ण बात, इस पांडुलिपि के भीतर उल्लिखित डिवाइस प्रतिक्रियाओं स्थिर राज्य प्रतिलेखन और अनुवाद दरों में जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक के लिए निरंतर किया जा करने के लिए अनुमति देता है. समय-समय पर रिएक्टरों में नए अभिकर्मकों इंजेक्शन द्वारा - और प्रतिक्रिया को हटाने (द्वारा) उत्पादों - प्रतिक्रियाओं निरंतर और जटिल गतिशील व्यवहार की निगरानी की जा सकती है. इस तरह, एक मंच बनाया गया है कि - कुछ हद तक - सेलुलर वातावरण mimics. इसके अलावा, इस मंच इंजेक्शन और इंजेक्शन की विशिष्ट संरचना के बीच की अवधि के अनुकूल द्वारा, प्रणाली गतिशीलता के अन्वेषण में सक्षम बनाता है। नतीजतन, इन बहुपरत microfluidic उपकरणों की विशेषता और जटिल गतिशील व्यवहार प्रदर्शित जो उपन्यास सिंथेटिक नेटवर्क के अनुकूलन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं.

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद, ईआरसी (परियोजना एन 677313 BioCircuit) वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन से एक NWO-VIDI अनुदान (NWO, 723.016.003), शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान मंत्रालय से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेविटी कार्यक्रम, 024.001.035 और 024.003.013), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुदान RGP0032/2015, यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम अनुदान 723106 के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद, और एक स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

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