Summary
Biz transplantasyon için basit ve verimli bir yöntem sağlamak 2 '-deoxyguanosine bir çıplak fare renal kapsül içine e 18.5 timus tedavi. Bu yöntem, hem timik epitelyal hücreler fonksiyon ve T hücrelerinin olgunlaşma çalışmada Yardımcısı olmalıdır.
Abstract
Timus, T hücrelerinin gelişiminde ve farklılaşması konusunda önemli bir rol oynayan büyük bir merkezi bağışıklık organıdır. Thymus transplantasyonu tymik epitelyal hücre fonksiyonunu ve T hücrelerinin olgunlaşma in vivo araştırılması için önemli bir yöntemdir. Burada laboratuvarımızda 2 '-deoksinozin (donör lenfositleri tüketmek için) nakli için kullanılan deneysel yöntemleri açıklayacağız bir korele çıplak fare renal kapsül içine embriyonik timus tedavi. Bu yöntem hem basit hem de etkilidir ve özel beceriler veya aygıtlar gerektirmez. Bu basit yöntem ile elde edilen sonuçlar, nakledilen timus 'un alıcının T hücrelerinin üretimini etkili bir şekilde destekleyebilildiğini göstermiştir. Ayrıca, protokole ilişkin birkaç önemli nokta daha da uzatın.
Introduction
Timus merkezi bağışıklık organı, timus timositleri içinde pozitif ve negatif seçim geçmesi, ve olgun T hücreleri olmak1,2. Anormal pozitif veya negatif seçim sonucu immünyetmezlik veya otoimmün patolojiler sırasıyla3,4. Bu nedenle, timus organ nakli, bağışçının timus 'ta T hücrelerinin seçimi sürecini incelemek için önemli bir yaklaşımdır. Bu yöntem özellikle mutasyona uğramış embriyonik ölümcül fenotip neden gen mutasyonlar tarafından aracılı thymik epitelyal fonksiyon analiz ederken önemlidir5.
Nakledilen timus bir alıcının T hücrelerinin olgunlaşma incelemek için, timus içinde donör lenfositlerin tükenmesi gereklidir. Bu amaçla, embryonik 14-, 15-veya 16-gün (E14, E15, E16) timus genellikle6,7seçilir. Daha olgun aşamalardan Thymus, 2 '-deoksiguanozin ile tedavi ederek donör lenfositlerinin de başarıyla tükenebilir. Ancak, lenfositlerin tüketen ve eski timus kültürünün kullanımı için ayrıntılı bir protokol daha önce8,9tarif edilmedi. Transplantasyon protokolleri birkaç çalışmada10,11, daha fazla değişiklik ve bu protokollerin iyileştirilmesi ile tanıtıldı iken gereklidir.
Protokolümüz iki bölüme ayrılır: (ı) geç gelişimsel aşama e 18.5 timus 'tan T lenfositlerinin 2 '-deoxyguanosine içeren medyada kültür tarafından tükenmesi. (ii) kültürlü timus 'un alıcılara nakli. Bu yordamda, renal kapsülün içine büyük doku (E 18.5 Thymus) teslim etmek için basit bir yol geliştirdik, böbrek yaralanması olasılığı azalır. Daha sonra aşama timus üzerinde odaklanırken, protokollerimiz de doğrudan veya çeşitli gelişimsel aşamalarında veya diğer benzer boyutlarda dokularda timus transplantasyonu için değişiklikler ile kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sunulan protokol, Jinan Üniversitesi 'nin hayvan bakımıyla ilgili etik komitesinin yönergelerine bağlıdır.
Not: kullanılan malzemeler malzeme tablosunda listelenir.
1. embriyonik timus izolasyonu
- Deney öncesi tüm cerrahi aletler otoklav ve 70% etanol ile Bench/Hood sterilize.
- Karbondioksit kullanarak, anestezi ve hamile kadın fare ötenize (18,5 gün başarılı çiftleşme sonrası). Ardından karın bölgesini% 70 etanol ile silin.
Not: burada Insm1+/lacz kadın ve Insm1+/lacz erkeklerde montaj ilişkili. Her embriyo için embriyonun uterusun izolasyonunda intraplacental enjeksiyonu yapıldı ve deapitasyon uygulandı. - Makası kullanarak, karnında mesane başlayan ve rahim her boynuz kadar çalışan bir "V" şeklinde kesilmiş olun.
- Makas kullanarak, mesometrium ve serviks/vajina kesmek ve rahim toplamak. Buzun üzerinde soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) içeren bir petri tabak rahim yerleştirin. Sonra, bir uterus boynuz diğerine anterior uterus duvarı keserek, zarflı decidua olan embriyolar açığa. İnce Cımbız kullanarak, zarflı decidua dokularına geri soyma ve embriyoları serbest bırakmak için göbek kordonu kesti. Tüm embriyoları, Thymus izolasyonuna kadar buzda yeni bir petri tabağı içine yerleştirin.
- % 70 alkol ile bir embriyo silin ve yeni bir petri çanak yerleştirin. Bu adımda, steril koşulların korunduğundan emin olun.
- Makas ile alt çene yakın kesme, embriyonun kafasını çıkarın ve bir kağıt havlu ile kan drenaj. Sonra, aynı Petri tabağı üzerinde embriyo düzeltmek pozisyon.
Not: Biz Insm1 ve lacz genotyping için her embriyo kuyruğu bir parça kesti. - Makas kullanarak, yan göğüs duvarı aksiller ön boyunca yatay olarak kesti ve sonra göğsü açmak için diyafram kesti. Timus şimdi trakea ve kalp bitişik önünde bulunan iki beyaz lob olarak görünür olmalıdır.
- Timus arkasında bükülmüş uçlu forseps yerleştirin ve sonra yavaşça timus çekin. İki eklem lob içerdiğini onaylamak için timus bütünlüğünü kontrol ettiğinizden emin olun.
- 1 PBS ile timus yıkayın ve bir stereomicroscope altında bağ dokularını ve kan damarlarını kırpın.
2. izole embriyonik timus kültürü
- 500 μL kültür orta (RPMI1640 + 15% fetal sığır serumu (FBS) + 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) her bir 24-kuyu plakasının her bir kuyu ekleyin. İyi başına bir timus ile kuyuların içine temiz thymi aktarın. Şekil 1 , kültür medyasında yalıtılmış timus görüntüler.
- Her Thymus-iyi içeren için 2 '-deoxygranosine son konsantrasyon 1,25 mM ekleyin.
- Her iki günde bir kültür medyasını ve 2 '-deokgranosinin yenileniyor, sekiz gün boyunca izole timus kültürü.
3. böbrek kapsülünde subkapsülü alanı kurmak
- İğne ve kırpılmış infüzyon tüpü hazırlamak için (Şekil 2), makas kullanarak 45 ° açı tüp kısmında kafa derisi ven iğne kes.
- Çıplak fare tartmak ve sonra bir pentobarbital ile anestezize (1,5%) Enjeksiyon (75 μg/g vücut ağırlığı).
- Parmak tutam takipte hiçbir refleks görülmez, fareyi çalışma masasına sağ lateral pozisyonda yerleştirin.
- Bir 0,5% Povidon İyot Swab ile, cerrahi alanda vücudun dış iç iki kez cilt dezenfekte.
- Makas kullanarak, sol böbrek alanında (son kaburga ve iliak arması arasında) omurga paralel bir 5 – 9 mm Cilt kesi olun. Sonra, subkutan doku ve kas yoluyla kesme ve böbrek maruz karın boşluğu açın.
- Böbrek maruz, bir yandan bir çift cımbız kullanın kas ve omurga tarafı kesi kenarı kapalı yağ dokusu kaldırmak için. Öte yandan, yavaşça böbrek dışarı sıkmak (alternatif olarak, böbrek her iki elin parmaklarını kullanarak sıkılabilir).
- Böbrek kapsülünün cerrahi sırasında nemli olduğundan emin olmak için böbreğin yüzeyini tuzlu (0,9% NaCl) ile ıslatın.
- Böbrek kapsülü bir Nick oluşturun ve hafifçe adım 3,1 hazırlanan iğne ucu kullanarak sağ alt tarafında böbrek kapsülü çizilmeye. Nick büyüklüğü 1/2 – 2/3 böbrek genişlikleri olmalıdır; böbrek üzerinde çizik yok.
- Böbrek kapsülü Nick içine adım 3,1 hazırlanmış infüzyon tüpü kaydırın. Böbreğin uzun tarafında böbrek kapsülü içinde 3 – 4mm 'ye ulaşıncaya kadar böbrek kapsülünü yavaşça DISSOCIATE edilir. İnfüzyon tüpü geri çizin; böbrek subkapsüler alanı kurulmuştur.
4. embriyonik murine timus nakli
- Kültür medyasını tüketmek iki kez% 2,3 yılında kültürlü timus bitki yıkayın.
- 3,1 adımda hazırlanan kırpılmış infüzyon tüpünü, şırınga bağlayan arayüzünde bir şırıngaya bağlayın. Hazırlanmış timus 'un infüzyon tüpünü yavaşça aspirate.
- Yavaşça böbrek kapsülü içine kırpılmış infüzyon tüp yerleştirin ve üstün kutup ulaşmak. Timus böbrek kapsülü içine teslim; aynı anda hafifçe şırınga pistonu itmek sırasında yavaşça tüp geri çekin.
- Bir alkol lambası kullanarak, adım 3,1 hazırlanmış iğne biraz ısı. Tüm timus subkapsüler alanı içinde olduğundan emin olduktan sonra, Nick dağlamak için ısıtmalı iğne kullanın.
- Cauterization sonra, abdominal boşlukta böbrek geri. Periton ve kas sütür.
- Modifiye kesilmiş dikey yatak sütür kullanarak, cilt kesi kapatın (en az üç knot kravat ve herhangi bir aşırı iplik kesti).
- Bir Povidon İyot çubuğu kullanarak, kesi dezenfekte. Ağrıyı hafifletmek için, cerrahi sırasında ve sonra ameliyattan 3 gün sonra fluniksin (2 μg/g vücut ağırlığı) Subkutan Enjeksiyon yapıldı.
- Tamamen anestezi kurtarılana kadar, kızılötesi lamba altında fare sıcak tutun.
- Daha önce5,8,9açıklandığı gibi nakledilen timus diseksiyon ve fenotipik Analizi yürüten önce 8 hafta boyunca alıcının böbrek kapsülünde timus tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada iki tam lob (Şekil 1) içeren izole e 18.5 timus gösterir. Ayrıca, biz infüzyon tüpü üzerinde bir eğim oluşturmak için kırpılmış olan kafa derisi ven iğne göstermek (Şekil 2). Sonra, aynı zamanda böbrek Kapsülü (Şekil 3A) ve timus (şekil3B) alıcı fareler içinde büyüme 8 hafta sonra nakledilen timus konumunun temsili bir görüntü göstermektedir. T hücrelerinin bir timus ile nakledilen çıplak farelerde üretilen olup olmadığını belirlemek için, hem nakledilen timus ve periferik kan, biz CD4 ve CD8 antikor boyama ve akış sitometri analizi kullanarak hücre nüfusu tespit. Periferik kan daha önce12açıklandığı gibi Retro-orbital sinüs toplanan. T hücrelerinin hem nakledilen timus hem de bir timus ile nakledilen çıplak farelerin periferik kanı içinde üretildiğini bulduk. Ancak, nakledilmemiş çıplak farelerin periferik kanında T hücresi algılanmadı (Şekil 4). T hücrelerinin kaynağını belirlemek için, laboratuvarımızda rutin olarak kullanılan ve daha önce13,14' ü tarif eden Genotipleme yöntemlerini kullanarak periferik beyaz kan hücrelerinde Insm1 ve lacz genlerini kontrol ettik. Donör embriyo Insm1 geni bir veya her iki alleles içinde lacz geni tarafından değiştirildi beri, t hücreleri birlikte donör timus ile nakledildi, biz t hücrelerinin genomu içinde lacz geni tespit olabilir periferik toplanan alıcı kan, onlar donör Thymus tarafından üretilen gösterir. Ayrıca, hiçbir lacz geni mevcut olduğu Için, T hücreleri alıcının hematopoetik hücrelerden üretildiğinde lacz algılanamaz. T hücrelerinin alıcıdan oluşturulduğunu gösteren Periferik T hücrelerinde Lacz geni algılamadı (Şekil 5).
Şekil 1: e 18.5 embriyolar tarafından izole edilen Thymus. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Thymus saç derisi ven iğnesinden yapılmış araçları teslim. Kafa derisi ven iğne bir eğim oluşturmak için 45 ° bir açıyla iğne yakın infüzyon tüp bölümünde kesildi. Prosedürde hem iğne hem de infüzyon tüpü kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Thymus böbrek kapsülü içine nakledildi. (A) böbrek kapsülünde taze nakledilen e 18.5 timus. (B) böbrek kapsülündeki Thymus 8 haftalık büyüme sonrası alıcıda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: nakledilen Thymus, Thymus-nakledilen ve olmayan nakledilmiş Çıplak fareler kan Izole T hücrelerinin akış sitometri analizi. T hücreleri boyama için CD4 ve CD8α antikorları kullanılmıştır. CD4+ CD8+ çift pozitif hücreler, CD4+ tek pozitif, CD8+ tek pozitif ve CD4-CD8- çift negatif hücreler belirtildiği gibi her kadran gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: timus nakledilen çıplak farelerde periferik kan T hücrelerinin kaynağını belirleme. Periferik kan beyaz hücrelerde Lacz geni ve Insm1 geni Genotipleme gösterilir. Merdiven: DNA Marker, +: pozitif kontrol DNA,-: negatif kontrol DNA, Anim1: Insm1lacz/lacz Thymus ile nakledilen çıplak fare periferik beyaz kan hücrelerinden DNA, Anim2: çıplak fare nakledilen periferik beyaz kan hücrelerinden DNA Insm1+/lacz Thymus ile. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embriyonik timus renal subkapsüler transplantasyonu, thymik epitelyal hücrelerin fonksiyonunun ve T hücrelerinin olgunlaşma sürecinin içinde vivo olarak incelenmesi için önemli bir yöntemdir. Embriyonik timus organ kültürü ve transplantasyon6,7üzerinde çeşitli deneysel çalışmalar olmasına rağmen, protokolümüz, murin embriyonik timus kültürü ve renal subkapsüler üzerinde basit bir alternatif prosedür sağlar. Eski timus dokusu için transplantasyon.
Protokollerimiz, birkaç farklı modifikasyon 6,7,10,11ekleyerek önceki protokoller üzerinde gelişir. İlk olarak, yerine E14-E16 timus, biz transplantasyon için e 18.5 izole timus kullanılmıştır. Avantajı bu daha sonra gelişimsel aşamada timus nispeten olgun timik yapıları ve epitelyal hücre nüfus içerir. Yenidoğan veya yetişkin fareler olgun Thymus alternatif bir kaynak olmasına rağmen, perinatal ölümcül fenotip gen manipülasyon sonucunda ortaya çıkarsa, Jmjd6 veya Insm1 genler mutasyonlar gibi5,13, bu yöntem Olgun Thymus çalışması için uygulanabilir bir alternatif sağlar. İkinci bir değişiklik,, transplantasyondan önce E18 timus kültür yönteminin önvizyonudur. Ayrıca, bir üçüncü değişiklik transplantasyon prosedürü oluşur, hangi biz yerine böbrek kapsülü bir Nick oluşturmak için iğne ucu kullanılan ve cımbız ve makas ile böbrek kapsülü kesme. Bu değişiklik renal kapsül hasarını ve böbreğin yaralanmasını azaltmıştır. Son bir değişiklik sütür adımında. Değiştirilmiş kesilmiş dikey yatak sütür deride dış dikiş hattını ortadan kaldırır ve bu nedenle ısırma nedeniyle kesi açılmasını önler.
Bu protokol, e 18.5 tymus transplantasyonu için böbrek kapsülüne kullanıldığında, timus 'un diğer gelişimsel aşamalarında veya benzer boyutlarda diğer dokularda nakli için değiştirilebilir. Ayrıca, kullanılan malzemeler farklı alanlardan farklı kullanıcılar tarafından, özellikle yerel yasalar tarafından kısıtlanabilir anestezi reaktiflerine göre değiştirilebilir. Protokolünde kullanılan pentobarbital dozajı 75 μg/g vücut ağırlığıdır. Ancak, maksimal dozaj anestezize hayvanların ölümü önlemek için 100 μg/g vücut ağırlığı daha fazla olmalıdır. Timus 'un böbrek kapsülüne nakli, timus in vivo fonksiyonel çalışması için etkili bir yöntemdir, ancak yukarıda sunulan yöntemde bazı sınırlamalar var. Bu sınırlamalar, 8 hafta içinde vivo büyüme döneminde (1 ' de 12) böbrek kapsülü dışarı bırakarak timus riskini içerir. İkincisi başka bir sınırlama ameliyat sonrası fareler ölümü (6 içinde 30). Ancak, bu ölüm özellikle pentobarbital aşırı dozda kaynaklanır. Bu nedenle, diğer anestezi yöntemleri istihdam edilebilir.
Özetle, biz izole etmek ve kültür e 18.5 timus ve daha sonra daha sonra böbrek kapsülüne timus nakli için basit ve verimli bir protokol sağlar. Bu da timik epitelyal hücrelerin fonksiyonunun analizine ve T hücrelerinin olgunlaşma sürecine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir ilgi çakışması ilan edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma, Jinan Üniversitesi başlangıç paketi ile S.J. ve bilim ve teknoloji programı Guangzhou Çin (Grant No 201704020209 için S.J.) tarafından desteklenmektedir. Biz yazma redaksiyon ve düzenleme için Amy botta (Biyoloji bölümü, York Üniversitesi, Toronto, on M3J 1p3, Kanada) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
