Summary
Wij bieden een eenvoudige en efficiënte methode voor het transplantatie van 2 '-deoxyguanosine behandeld E 18.5 Thymus in de niercapsule van een naakt muis. Deze methode moet worden assistent in de studie van zowel Thymus epitheliale cellen functie en T-cellen rijping.
Abstract
De Thymus is een belangrijk centraal immuun orgaan, dat een essentiële rol speelt in de ontwikkeling en differentiatie van T-cellen. Thymus transplantatie is een belangrijke methode voor het onderzoeken van Thymus epitheliale celfunctie en T-cellen rijping in vivo. Hier zullen we de experimentele methoden beschrijven die in ons laboratorium worden gebruikt om 2 '-deoxyguanosine (om lymfocyten van donoren af te putten) behandeld embryonale Thymus in de niercapsule van een athymische naakt muis. Deze methode is zowel eenvoudig als efficiënt en vereist geen speciale vaardigheden of apparaten. De resultaten verkregen via deze eenvoudige methode toonden aan dat getransplanteerde Thymus de productie van de T-cellen van de ontvanger effectief kan ondersteunen. Daarnaast zullen verschillende belangrijke punten met betrekking tot het Protocol verder worden opgehelderd.
Introduction
De Thymus is het centrale immuunsysteem, binnen de thymus thymocyten ondergaan positieve en negatieve selectie, en uitgegroeid tot volwassen T cellen1,2. Abnormale positieve of negatieve selectie resulteert in immunodeficiëntie of auto-immuunpathologieën respectievelijk3,4. Daarom is Thymus-orgaantransplantatie een belangrijke benadering om het proces van de selectie van T-cellen in de Thymus van de donor te bestuderen. Deze methode is met name cruciaal bij het analyseren van de thymische epitheliale functie gemedieerd door genmutaties die embryonaal dodelijk fenotype veroorzaken bij gemuteerde5.
Om de rijping van de T-cellen van een ontvanger in de getransplanteerde Thymus te bestuderen, is uitputting van de lymfocyten van de donor binnen de thymus noodzakelijk. Voor dit doel, embryonale 14-, 15-of 16-daagse (E14, E15, e16) Thymus is meestal geselecteerd6,7. Thymus uit meer volwassen stadia kan ook met succes worden uitgeput van de lymfocyten van de donor door behandeling met 2 '-deoxyguanosine. Echter, een gedetailleerd protocol voor het afbreken van lymfocyten en het gebruik van de oudere Thymus cultuur is niet eerder beschreven8,9. Terwijl de transplantatie protocollen zijn geïntroduceerd door verschillende onderzoeken10,11, is verdere wijziging en verbetering van deze protocollen noodzakelijk.
Ons protocol is onderverdeeld in twee delen: (i) depletie van T-lymfocyten uit late ontwikkelingsfase E 18.5 Thymus door cultuur in 2 '-deoxyguanosine-bevattende media. (II) transplantatie van de gekweekte Thymus in ontvangers. In deze procedure ontwikkelden we een eenvoudige manier om het grote weefsel (E 18.5 Thymus) in de niercapsule te leveren met een verminderde kans op nierletsel. Terwijl de focus op latere fase Thymus, ons protocol kan ook worden gebruikt direct of met wijzigingen voor transplantatie van Thymus in verschillende ontwikkelingsstadia of andere vergelijkbare grootte weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gepresenteerde protocol houdt zich aan de richtlijnen van de ethische commissie van Jinan University met betrekking tot dierverzorging.
Opmerking: de gebruikte materialen staan in de tabel met materialen.
1. isolatie van de embryonale Thymus
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor het experiment, en steriliseren de Bank/kap met 70% ethanol.
- Met behulp van kooldioxide, anesthetiseren en euthaniëren de zwangere vrouwelijke muis (18,5 dagen na succesvolle paring). Veeg vervolgens de abdominale regio af met 70% ethanol.
Opmerking: hier hebben we Insm1+/lacz vrouwtjes en Insm1+/lacz mannetjes. Intraplacentale injectie van pentobarbital werd uitgevoerd vóór isolatie van embryo's uit de baarmoeder en onthoofding werden uitgevoerd voor elk embryo. - Maak met een schaar een "V"-vormige snede op de buik vanaf de blaas en loop tot elke Hoorn van de baarmoeder.
- Gebruik de schaar, snijd de mesometrium en cervix/vagina, en het verzamelen van de baarmoeder. Plaats de baarmoeder in een Petri schaaltje met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. Vervolgens, bloot de embryo's die in de omhulde decidua, door het snijden van de voorste baarmoederwand van de ene baarmoeder Hoorn naar de andere. Met behulp van fijne pincet, schil terug de omhulde Europese lork weefsels en snijd de navelstreng om de embryo's vrij te geven. Plaats alle embryo's in een nieuwe Petri schaal op ijs tot het isolement van de thymus.
- Veeg een embryo af met 70% alcohol en plaats het in een nieuwe Petri schaal. Zorg er vanaf deze stap voor dat steriele omstandigheden worden gehandhaafd.
- Door dicht bij de onderkaak te snijden met een schaar, verwijder het hoofd van het embryo en giet het bloed af met een papieren handdoek. Bevestig vervolgens het embryo op dezelfde Petri schaal in rugligging.
Opmerking: we snijden een stukje van de staart van elk embryo voor Insm1 en lacz genotypering. - Knip met een schaar de laterale borstwand horizontaal langs het oksel front en snijd vervolgens het diafragma om de borst te openen. De thymus moet nu zichtbaar zijn als twee witte lobben gelegen tegenover de luchtpijp en grenzend aan het hart.
- Plaats gebogen-Tip Tang achter de thymus en trek de thymus zachtjes. Zorg ervoor dat u de integriteit van de thymus te controleren om te bevestigen dat het bevat twee jointed lobben.
- Was de thymus met 1x PBS en trim de bindweefsels en bloedvaten af onder een stereomicroscoop.
2. cultuur van de geïsoleerde embryonale Thymus
- Voeg 500 μL kweekmedium (RPMI1640 + 15% foetaal runderserum (FBS) + 100 U/mL peniciline en 100 μg/mL streptomycine) toe aan elk goed van een 24-put plaat. Breng de schone thymi in de putten met één Thymus per put. Figuur 1 toont de geïsoleerde Thymus in cultuur media.
- Aan elke Thymus-bevattende goed toevoegen 2 '-deoxygranosine tot een eindconcentratie van 1,25 mM.
- Cultuur de geïsoleerde Thymus voor acht dagen, het vernieuwen van zowel de cultuur media en 2 '-deoxygranosine elke twee dagen.
3. Stel de subcapsulaire ruimte in de niercapsule in
- Om de naald en de geknipte infusie buis (Figuur 2) voor te bereiden, snijd de hoofdhuid ader naald op het buis gedeelte in een hoek van 45 ° met behulp van een schaar.
- Weeg de naakt muis en vervolgens anesthetiseren met een pentobarbital (1,5%) injectie (75 μg/g lichaamsgewicht).
- Wanneer er geen reflex na teen knijpen wordt waargenomen, plaatst u de muis op de bedienings tafel in een rechter laterale positie.
- Met een 0,5% Povidon jodium wattenstaafje, Desinfecteer de huid tweemaal in het chirurgische gebied van binnenuit naar de buitenkant van het lichaam.
- Maak met een schaar een 5 – 9 mm huid incisie parallel aan de wervelkolom in het linker niergebied (tussen de laatste rib en de iliacale kam). Open vervolgens de buikholte door het subcutane weefsel en de spieren te snijden en de nier bloot te leggen.
- Met de nier blootgesteld, gebruik van een paar pincet in de ene hand te heffen van de spier en vetweefsel van de rand van de wervelkolom kant incisie. Met de andere hand, knijp voorzichtig de nier uit (als alternatief kan de nier worden geperst met behulp van vingers van beide handen).
- Om ervoor te zorgen dat de niercapsule vochtig is tijdens de operatie, nat het oppervlak van de nier met zoutoplossing (0,9% NaCl).
- Maak een Nick in de niercapsule en kras de niercapsule zachtjes op de rechterbenedenhoek met behulp van de naaldpunt voorbereid in stap 3,1. De grootte van de Nick moet 1/2 – 2/3 breedtes van de nier; niet krassen op de nier.
- Schuif de infusie buis bereid in stap 3,1 in de Nick op de niercapsule. Verwijder voorzichtig de niercapsule met de nier langs de lange zijde van de nier tot u 3 – 4mm in de niercapsule bereikt. Trek de infusie buis terug; de subcapsulaire nierruimte wordt vastgesteld.
4. transplantatie van de embryonale Murine Thymus
- Was de thymus gekweekt in stap 2,3 tweemaal in zoutoplossing om de cultuur media af te putten.
- Sluit de geknipte infusie buis die in stap 3,1 is bereid op een spuit aan op een spuit verbindingsinterface. Aspireren de bereide Thymus langzaam in de infusie buis.
- Plaats de geknipte infusie buis voorzichtig in de niercapsule en bereik de superieure pool. Lever de Thymus in de niercapsule; Trek de buis langzaam uit terwijl u tegelijkertijd de zuiger van de spuit zachtjes duwt.
- Gebruik een alcohol lamp, Verwarm de naald lichtjes in stap 3,1. Nadat je ervoor hebt gezorgd dat de hele thymus zich in de subcapsulaire ruimte bevindt, gebruik je de verwarmde naald om de Nick te cauteriseren.
- Na cauterisatie, herstel de nier in de buikholte. Hechting van het peritoneum en de spier.
- Met behulp van een gemodificeerde onderbroken verticale matras hecht, sluit de huid incisie (binden ten minste drie knopen en wegknippen van eventuele overtollige draad).
- Met behulp van een Povidon jodium wattenstaafje, desinfecteren de incisie. Om pijn te verlichten, werd subcutane injectie van flunixine (2 μg/g lichaamsgewicht) uitgevoerd tijdens de operatie en vervolgens gedurende 3 dagen na de operatie.
- Totdat volledig hersteld van anesthesie, houd de muis warm onder de infraroodlamp.
- Houd de thymus 8 weken in de niercapsule van de ontvanger voordat u de getransplanteerde Thymus ontleed en fenotypische analyse uitvoert zoals eerder beschreven op5,8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we de geïsoleerde E 18.5 Thymus met twee volledige lobben (Figuur 1). Daarnaast tonen we de hoofdhuid ader naald die werd geknipt om een schuine kant op de infusie buis te vormen (Figuur 2). Vervolgens tonen we ook een representatief beeld van de positie van de thymus die werd getransplanteerd in de niercapsule (Figuur 3a) en de thymus na 8 weken groei binnen de ontvangende muizen (Figuur 3b). Om te bepalen of de T-cellen werden geproduceerd in naakt muizen getransplanteerd met een Thymus, in zowel de getransplanteerde thymus en het perifere bloed, we gedetecteerd de celpopulaties met behulp van CD4 en CD8 antilichaam kleuring en flow cytometrie analyse. Het perifere bloed werd verzameld uit de retro-orbitale sinus zoals eerder beschreven12. We vonden dat de T-cellen werden geproduceerd in zowel de getransplanteerde thymus en het perifere bloed van naakt muizen getransplanteerd met een Thymus. Er werden echter geen T-cellen aangetroffen in perifeer bloed van niet-getransplanteerde naakt muizen (Figuur 4). Om de bron van T-cellen te bepalen, hebben we Insm1 -en lacz -genen in de perifere witte bloedcellen gecontroleerd met behulp van genoom methoden die routinematig in ons laboratorium worden gebruikt en eerder werden beschreven13,14. Aangezien het donor embryo Insm1 gen in één of beide allelen werd vervangen door het lacz -gen, konden we, wanneer de t-cellen met Thymus van donor werden getransplanteerd, het lacz -gen opsporen in het genoom van de t-cellen die worden opgevangen uit perifere bloed van de ontvanger, die aangeeft dat ze zijn geproduceerd door de donor Thymus. Bovendien, omdat er geen Lacz -gen aanwezig was, zou lacz niet worden gedetecteerd wanneer de T-cellen werden gegenereerd op hematopoietische cellen van de ontvanger. We hebben Lacz -gen niet gedetecteerd in de perifere t-cellen die aangeven dat de t-cellen zijn gegenereerd op basis van de ontvanger (Figuur 5).
Figuur 1: Thymus geïsoleerd uit e 18,5 embryo's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Thymus levert gereedschappen gemaakt van de hoofdhuid ader naald. De hoofdhuid ader naald werd gesneden in het infuus buis deel dicht bij de naald onder een hoek van 45 ° om een schuine kant te maken. Zowel de naald als de infusie buis werden in de procedure gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Thymus getransplanteerd in de niercapsule. A) vers getransplanteerde e 18.5 Thymus in de niercapsule. (B) Thymus in de niercapsule na een groei van 8 weken in de ontvanger. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Flowcytometrie analyse van de T-cellen geïsoleerd van de getransplanteerde Thymus, bloed van Thymus-verplant en niet-getransplanteerde naakt muizen. CD4-en CD8α-antilichamen werden gebruikt voor de kleuring van T-cellen. CD4+CD8+ dubbele positieve cellen, CD4+ enkele positieve, CD8+ enkele positieve en CD4-CD8- dubbele negatieve cellen worden weergegeven in elk van de kwadranten zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: identificatie van de bron van de perifere bloedcellen in Thymus getransplanteerde naakt muizen. Genotyping van Lacz gen en Insm1 gen in perifere bloed witte cellen wordt getoond. Ladder: DNA marker, +: positief controle DNA,-: negatief controle-DNA, Anim1: DNA van perifere witte bloedcellen van naakt muis getransplanteerd met Insm1lacz/lacz Thymus, Anim2: DNA van perifere witte bloedcellen van naakt muis getransplanteerd met Insm1+/Lacz Thymus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Renale subcapsulaire transplantatie van embryonale Thymus is een belangrijke methode om de thymus epitheelcellen functie en het proces van T-cellen rijping in vivo te bestuderen. Hoewel er verschillende experimentele studies zijn over de embryonale Thymus-orgel cultuur en transplantatie6,7, biedt ons protocol een eenvoudige alternatieve procedure voor de muriene embryonale Thymus cultuur en renale subcapsulaire transplantatie voor oudere Thymus weefsel.
Ons protocol verbetert de vorige protocollen door het opnemen van verschillende wijzigingen 6,7,10,11. Ten eerste, in plaats van E14-e16 Thymus, gebruikten we de thymus geïsoleerd van E 18.5 voor transplantatie. Het voordeel is dat de Thymus in deze latere ontwikkelingsfase relatief volwassen thymische structuren en epitheliale celpopulaties bevat. Hoewel de pasgeborenen of volwassen muizen een alternatieve bron van rijpe Thymus zijn, als perinatale dodelijke fenotype optreedt als gevolg van genmanipulatie, zoals mutaties in Jmjd6 of Insm1 genen5,13, deze methode biedt een haalbaar alternatief voor de studie van volwassen Thymus. Een tweede wijziging is het voordeel van een cultuur methode van E18 Thymus vóór transplantatie. Daarnaast vindt een derde wijziging plaats in de transplantatie procedure, waarbij we de naaldpunt gebruikten om een Nick op de renale capsule te maken in plaats van de niercapsule te plukken en te snijden met een pincet en een schaar. Deze wijziging verminderde zowel niercapsule schade en letsel van de nier. Een laatste wijziging is in de stap van de hechting. De aangepaste onderbroken verticale matras hechting elimineert de buiten hecht lijn op de huid en voorkomt daarom de opening van de incisie als gevolg van bijten.
Terwijl dit protocol wordt gebruikt voor E 18.5 Thymus transplantatie in de nier-capsule, het kan worden aangepast voor transplantatie van de Thymus in andere ontwikkelingsstadia of voor andere weefsels met vergelijkbare maten. Bovendien kunnen de gebruikte materialen dienovereenkomstig worden aangepast door verschillende gebruikers uit verschillende gebieden, vooral met betrekking tot anesthesie reagentia die kunnen worden beperkt door lokale wetten. De dosering van pentobarbital gebruikt in ons protocol is 75 μg/g lichaamsgewicht. Echter, de maximale dosering mag niet meer dan 100 μg/g lichaamsgewicht om te voorkomen dat de dood van de verdoken dieren. Hoewel de transplantatie van de Thymus in de niercapsule een efficiënte methode is voor de functionele studie van de Thymus in vivo, bestaan er enkele beperkingen in de hierboven gepresenteerde methode. Deze beperkingen omvatten het risico van de thymus die uit de niercapsule valt tijdens de 8 weken in vivo groeiperiode (1 op 12). Ten tweede is een andere beperking de dood van muizen na de operatie (6 in 30). Echter, deze dood wordt voornamelijk veroorzaakt door de overdosis van de pentobarbital. Als zodanig, andere toegestane methoden van anesthesie kunnen worden gebruikt.
Kortom, we bieden een eenvoudig en efficiënt protocol om de E 18.5-Thymus te isoleren en te kweken en vervolgens de Thymus in de niercapsule te transplantaties. Dit maakt het mogelijk voor de analyse van de thymus epitheelcellen functie en het proces van T-cellen rijping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten gedeclareerd.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Start pakket van Jinan University naar S.J. en door Science and Technology Program van Guangzhou China (Grant No. 201704020209 tot S.J.). We danken Amy Botta (departement biologie, York University, Toronto, op M3J 1P3, Canada) voor het naleden en bewerken van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
