Summary
Wir bieten eine einfache und effiziente Methode, um 2'-Deoxyguanosin behandelt E18.5 Thymus in die Nierenkapsel einer Nacktmaus zu transplantieren. Diese Methode sollte bei der Untersuchung sowohl der Funktion der thymischen Epithelzellen als auch der Reifung von T-Zellen helfen.
Abstract
Der Thymus ist ein wichtiges zentrales Immunorgan, das eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung von T-Zellen spielt. Thymus-Transplantation ist eine wichtige Methode zur Untersuchung der thymischen Epithelzellfunktion und der T-Zellreifung in vivo. Hier werden wir die experimentellen Methoden beschreiben, die in unserem Labor verwendet werden, um 2'-Deoxyguanosin (zur Erschöpfung der Spenderlymphozyten) zu transplantieren, die embryonalen Thymus in die Nierenkapsel einer athymischen Nacktmaus behandelt haben. Diese Methode ist einfach und effizient und erfordert keine besonderen Fähigkeiten oder Geräte. Die Ergebnisse, die mit dieser einfachen Methode erzielt wurden, zeigten, dass transplantierter Thymus die Produktion von T-Zellen des Empfängers effektiv unterstützen kann. Darüber hinaus werden einige Wichtige Punkte in Bezug auf das Protokoll weiter erläutert.
Introduction
Der Thymus ist das zentrale Immunorgan, innerhalb der Thymusthymosyten unterliegen positive und negative Selektion, und werden reife T-Zellen1,2. Abnormale positive oder negative Selektion führt zu Immunschwäche oder Autoimmunpathologien bzw.3,4. Daher ist die Thymusorgantransplantation ein wichtiger Ansatz, um den Prozess der T-Zellen-Selektion im Thymus des Spenders zu untersuchen. Diese Methode ist besonders wichtig bei der Analyse der thymischen Epithelfunktion, die durch Genmutationen vermittelt wird, die embryonalen tödlichen Phänotyp verursachen, wenn sie mutiert5.
Um die Reifung der T-Zellen eines Empfängers im transplantierten Thymus zu untersuchen, ist eine Erschöpfung der Spenderlymphozyten im Thymus erforderlich. Zu diesem Zweck wird embryonaler 14-, 15- oder 16-Tage-Thymus (E14, E15, E16) in der Regel6,7ausgewählt. Thymus aus reiferen Stadien kann auch erfolgreich von den Lymphozyten des Spenders durch die Behandlung mit 2'-Deoxyguanosin aufgebraucht werden. Ein detailliertes Protokoll zur Erschöpfung der Lymphozyten und zur Verwendung älterer Thymuskultur wurde jedoch bisher nicht beschrieben8,9. Während Transplantationsprotokolle durch mehrere Studien10,11eingeführt wurden, ist eine weitere Änderung und Verbesserung dieser Protokolle notwendig.
Unser Protokoll ist in zwei Teile unterteilt: (i) Erschöpfung der T-Lymphozyten aus dem späten Entwicklungsstadium E18.5 Thymus durch Kultur in 2'-deoxyguanosinhaltigen Medien. ii) Transplantation des kultivierten Thymus in Empfänger. In diesem Verfahren haben wir eine einfache Möglichkeit entwickelt, das große Gewebe (E18.5 Thymus) mit reduziertem Wahrscheinlichkeitsfall einer Nierenverletzung in die Nierenkapsel zu liefern. Während wir uns auf thymus im späteren Stadium konzentrieren, kann unser Protokoll auch direkt oder mit Modifikationen für die Transplantation von Thymus in verschiedenen Entwicklungsstadien oder anderen ähnlich großen Geweben verwendet werden.
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Protocol
Das vorgelegte Protokoll entspricht den Richtlinien der Ethikkommission der Jinan University in Bezug auf tiersorgliche Behandlung.
HINWEIS: Die verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Isolierung des embryonalen Thymus
- Autoclavalle chirurgische Instrumente vor dem Experiment, und sterilisieren Sie die Bank / Haube mit 70% Ethanol.
- Mit Kohlendioxid, anästhesieren und einschläfern die schwangere weibliche Maus (18,5 Tage nach erfolgreicher Paarung). Dann wischen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol ab.
HINWEIS: Hier haben wir Insm1+/lacZ Weibchen und Insm1+/lacZ Männchen gepaart. Intraplazentale Injektion von Pentobarbital wurde durchgeführt, bevor die Isolierung von Embryonen aus der Gebärmutter und die Enthauptung für jeden Embryo durchgeführt wurden. - Mit der Schere, machen Sie einen "V" geformten Schnitt auf den Bauch ausgehend von der Blase und läuft bis zu jedem Horn der Gebärmutter.
- Schneiden Sie mit der Schere das Mesometrium und den Gebärmutterhals/Vagina und sammeln Sie die Gebärmutter. Die Gebärmutter in eine Petrischale mit kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) auf Eis legen. Als nächstes entlarven Sie die Embryonen, die sich in der umhüllten Decidua befinden, indem Sie die vordere Gebärmutterwand von einem Gebärmutterhorn zum anderen schneiden. Mit einer feinen Pinzette die umhüllten Decidua-Gewebe zurückschälen und die Nabelschnur schneiden, um die Embryonen freizusetzen. Legen Sie alle Embryonen in einer neuen Petrischale auf Eis bis zur Isolierung des Thymus.
- Wischen Sie einen Embryo mit 70% Alkohol ab und legen Sie ihn in eine neue Petrischale. Stellen Sie ab diesem Schritt sicher, dass die sterilen Bedingungen erhalten bleiben.
- Durch Schneiden in der Nähe des Unterkiefers mit der Schere, entfernen Sie den Kopf des Embryos und abtropfen des Blutes mit einem Papiertuch. Als nächstes, fixieren Sie den Embryo auf der gleichen Petrischale in Supine-Position.
HINWEIS: Wir schneiden ein Stück des Schwanzes jedes Embryos für Insm1 und lacZ Genotypisierung. - Schneiden Sie mit einer Schere die seitliche Brustwand horizontal entlang der Achselfront und schneiden Sie dann das Zwerchfell, um die Brust zu öffnen. Der Thymus sollte nun als zwei weiße Lappen sichtbar sein, die sich vor der Luftröhre und neben dem Herzen befinden.
- Biegen Sie die Zange hinter den Thymus und ziehen Sie den Thymus vorsichtig ab. Achten Sie darauf, die Integrität des Thymus zu überprüfen, um zu bestätigen, dass er zwei gelenkige Lappen enthält.
- Waschen Sie den Thymus mit 1x PBS und schneiden Sie das Bindegewebe und die Blutgefäße unter einem Stereomikroskop ab.
2. Kultur des isolierten embryonalen Thymus
- Fügen Sie jedem Brunnen einer 24-Well-Platte 500 l Kulturmedium (RPMI1640 + 15% fetales Rinderserum (FBS) + 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin hinzu. Den sauberen Thymi mit einem Thymus pro Brunnen in die Brunnen überführen. Abbildung 1 zeigt den isolierten Thymus in Kulturmedien.
- Zu jedem Thymus-haltigen Brunnen 2'-Deoxygranosin zu einer Endkonzentration von 1,25 mM hinzufügen.
- Den isolierten Thymus acht Tage lang bestofrischen und alle zwei Tage sowohl die Kulturmedien als auch 2'-Oxygranosin emiten.
3. Stellen Sie den subkapitären Raum in der Nierenkapsel
- Zur Vorbereitung der Nadel und des abgeschnittenen Infusionsrohrs (Abbildung 2) schneiden Sie die Kopfhautvenennadel auf dem Rohrteil in einem 45°-Winkel mit einer Schere.
- Wiegen Sie die Nackte Maus und befeuchten Sie sie dann mit einem Pentobarbital (1,5%) Injektion (75 g/g Körpergewicht).
- Wenn kein Reflex nach Zehenklemmung beobachtet wird, legen Sie die Maus auf den Operationstisch in eine rechte seitliche Position.
- Mit einem 0,5% Povidon-Jod-Tupfer, desinfizieren Sie die Haut zweimal im chirurgischen Bereich von innen nach außen des Körpers.
- Mit der Schere, machen Sie einen 5-9 mm Hautschnitt parallel zur Wirbelsäule im linken Nierenbereich (zwischen der letzten Rippe und dem Iliaskamm). Als nächstes öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie das subkutane Gewebe und den Muskel durchschneiden und die Niere freilegen.
- Wenn die Niere exponiert ist, verwenden Sie eine Pinzette in einer Hand, um den Muskel und das Fettgewebe von der Wirbelsäulen-Seiten-Schnittkante zu heben. Mit der anderen Hand, drücken Sie die Niere vorsichtig heraus (alternativ kann die Niere mit den Fingern beider Hände ausgepresst werden).
- Um sicherzustellen, dass die Nierenkapsel während der Operation feucht ist, befeuchten Sie die Oberfläche der Niere mit Saline (0,9% NaCl).
- Erstellen Sie einen Nick in der Nierenkapsel, und kratzen Sie vorsichtig die Nierenkapsel auf der unteren rechten Seite mit der Nadelspitze in Schritt 3.1 vorbereitet. Die Größe des Nicks sollte 1/2–2/3 Breiten der Niere sein; nicht an der Niere kratzen.
- Schieben Sie die in Schritt 3.1 hergestellte Infusionsröhre in den Nick auf der Nierenkapsel. Dissoziieren Sie die Nierenkapsel vorsichtig mit der Niere entlang der langen Seite der Niere, bis sie 3–4 mm in der Nierenkapsel erreicht. Zeichnen Sie das Infusionsrohr zurück; der subkapituläre Raum der Niere eingerichtet ist.
4. Transplantieren Sie den embryonalen murinen Thymus
- Waschen Sie den Thymus kultiviert in Schritt 2.3 zweimal in der Saline, um die Kulturmedien zu erschöpfen.
- Schließen Sie das in Schritt 3.1 hergestellte abgeschnittene Infusionsrohr an eine Spritze an der Spritzenverbindungsschnittstelle an. Den vorbereiteten Thymus langsam in das Infusionsrohr aspirieren.
- Setzen Sie die abgeschnittene Infusionsröhre vorsichtig in die Nierenkapsel ein und erreichen Sie den oberen Pol. Den Thymus in die Nierenkapsel geben; Ziehen Sie das Rohr langsam zurück, während Sie gleichzeitig den Kolben der Spritze sanft drücken.
- Mit einer Alkohollampe, leicht erhitzen Sie die Nadel in Schritt 3.1 vorbereitet. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich der gesamte Thymus im subkapitularen Raum befindet, verwenden Sie die beheizte Nadel, um den Nick zu kauterisieren.
- Nach der Kauterisierung, stellen Sie die Niere in der Bauchhöhle. Naht das Peritoneum und Muskel.
- Mit einer modifizierten unterbrochenen vertikalen Matratzennaht den Hautschnitt schließen (mindestens drei Knoten binden und überschüssiges Gewinde abschneiden).
- Mit einem Povidon-Jod-Tupfer, desinfizieren Sie den Schnitt. Zur Linderung der Schmerzen wurde während der Operation und dann 3 Tage nach der Operation eine subkutane Injektion von Flunixin (2 g/g Körpergewicht) durchgeführt.
- Bis vollständig von der Anästhesie erholt, halten Sie die Maus warm unter der Infrarotlampe.
- Bewahren Sie den Thymus 8 Wochen in der Nierenkapsel des Empfängers auf, bevor Sie den transplantierten Thymus sezieren und eine phänotyptische Analyse durchführen, wie zuvor beschrieben5,8,9.
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Representative Results
Hier zeigen wir den isolierten E18.5 Thymus mit zwei kompletten Lappen (Abbildung 1). Zusätzlich zeigen wir die Kopfhautvenennadel, die abgeschnitten wurde, um eine Abschrägung auf dem Infusionsrohr zu bilden (Abbildung 2). Als nächstes zeigen wir auch ein repräsentatives Bild der Position des Thymus, der in der Nierenkapsel transplantiert wurde (Abbildung 3A) und des Thymus nach 8 Wochen Wachstum innerhalb der Empfängermäuse (Abbildung 3B). Um festzustellen, ob die T-Zellen in Nacktmäusen produziert wurden, die mit einem Thymus transplantiert wurden, sowohl im transplantierten Thymus als auch im peripheren Blut, entdeckten wir die Zellpopulationen mittels CD4- und CD8-Antikörperfärbung und Durchflusszytometrieanalyse. Das periphere Blut wurde aus der retro-orbitalen Sinus entnommen, wie zuvor beschrieben12. Wir fanden heraus, dass die T-Zellen sowohl im transplantierten Thymus als auch im peripheren Blut von Nacktmäusen produziert wurden, die mit einem Thymus transplantiert wurden. Im peripheren Blut von nicht transplantierten Nacktmäusen wurden jedoch keine T-Zellen nachgewiesen (Abbildung 4). Um die Quelle der T-Zellen zu bestimmen, überprüften wir Insm1- und lacZ-Gene in den peripheren weißen Blutkörperchen mit Genotypisierungsmethoden, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wurden und zuvor13,14beschrieben. Da das Spenderembryo-Insm1-Gen durch das lacZ-Gen in einem oder beiden Allelen ersetzt wurde, konnten wir, wenn die T-Zellen mit Thymus vom Spender kotransplantiert wurden, das lacZ-Gen im Genom der T-Zellen, die aus peripheren Blut des Empfängers, was darauf hinweist, dass sie vom Spender Thymus produziert wurden. Da kein lacZ-Gen vorhanden war, wurde lacZ nicht nachgewiesen, wenn die T-Zellen aus den hämatopoetischen Zellen des Empfängers erzeugt wurden. Wir haben das lacZ-Gen in den peripheren T-Zellen nicht erkannt, was darauf hindeutet, dass die T-Zellen vom Empfänger erzeugt wurden ( Abbildung5).
Abbildung 1: Thymus isoliert aus E18.5-Embryonen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Thymus liefert Werkzeuge aus der Kopfhautvene Nadel. Die Kopfhautvenennadel wurde am Infusionsrohrteil in einem Winkel von 45° nahe der Nadel geschnitten, um eine Abschrägung zu erzeugen. Sowohl die Nadel als auch das Infusionsrohr wurden bei dem Verfahren verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Thymus in die Nierenkapsel transplantiert. (A) Frisch transplantierter E18.5 Thymus in der Nierenkapsel. (B) Thymus in der Nierenkapsel nach 8-wöchigem Wachstum des Empfängers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrieanalyse der T-Zellen, die aus dem transplantierten Thymus isoliert sind, Blut von Thymus-transplantierten und nicht transplantierten Nacktmäusen. Für die Färbung von T-Zellen wurden CD4- und CD8-Antikörper verwendet. CD4+CD8+ doppel positive Zellen, CD4+ Single positive, CD8+ Single positive und CD4-CD8- Doppelnegativzellen werden in jedem der Quadranten wie angegeben angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Identifizierung der Quelle der peripheren Blut-T-Zellen in Thymus transplantierten Nacktmäusen. Genotypisierung des lacZ-Gens und des Insm1-Gens in peripheren blutweißen Zellen wird gezeigt. Leiter: DNA-Marker, + : Positivkontroll-DNA, -: Negativkontroll-DNA, Anim1: DNA aus peripheren weißen Blutkörperchen der nackten Maus transplantiert mit Insm1lacZ/lacZ thymus, Anim2: DNA aus peripheren weißen Blutkörperchen der Nacktmaus transplantiert mit Insm1+/lacZ Thymus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die renale subkapsuläre Transplantation von embryonaischem Thymus ist eine wichtige Methode, um die Funktion der thymischen Epithelzellen und den Prozess der T-Zellenreifung in vivo zu untersuchen. Obwohl es mehrere experimentelle Studien über embryonale Thymus-Organkultur und Transplantation6,7gibt, bietet unser Protokoll ein einfaches alternatives Verfahren zur murinen embryonalen Thymuskultur und renalen subkapsulären Transplantation für älteres Thymusgewebe.
Unser Protokoll verbessert frühere Protokolle, indem es mehrere verschiedene Modifikationen enthält 6,7,10,11. Zunächst haben wir anstelle von E14-E16 Thymus den von E18.5 isolierten Thymus für die Transplantation verwendet. Der Vorteil ist, dass Thymus in diesem späteren Entwicklungsstadium relativ reife thymische Strukturen und Epithelzellpopulationen enthält. Obwohl die neugeborenen oder erwachsenen Mäuse eine alternative Quelle für reifen Thymus sind, tritt ein perinalatialer letaler Phänotyp als Folge von Genmanipulation enden, wie Mutationen in den Genen Jmjd6 oder Insm1 5,13, diese Methode bietet eine praktikable Alternative für die Untersuchung von reifen Thymus. Eine zweite Änderung ist die Vorarbeit einer Kulturmethode von E18 Thymus vor der Transplantation. Zusätzlich tritt eine dritte Modifikation im Transplantationsverfahren auf, bei der wir die Nadelspitze verwendet haben, um einen Nick auf der Nierenkapsel zu erzeugen, anstatt die Nierenkapsel mit Einer Pinzette und einer Schere zu pflücken und zu schneiden. Diese Modifikation reduzierte sowohl Nierenkapselschäden als auch Verletzungen der Niere. Eine letzte Änderung befindet sich im Nahtschritt. Die modifizierte unterbrochene vertikale Matratzennaht eliminiert die äußere Nahtlinie auf der Haut und verhindert somit das Öffnen des Einschnitts durch Beißen.
Während dieses Protokoll für Die E18.5-Thymustransplantation in die Nierenkapsel verwendet wird, kann es zur Transplantation des Thymus in anderen Entwicklungsstadien oder für andere Gewebe mit ähnlichen Größen modifiziert werden. Darüber hinaus können die verwendeten Materialien von verschiedenen Anwendern aus verschiedenen Bereichen entsprechend modifiziert werden, insbesondere in Bezug auf Anästhesierezizizien, die durch lokale Gesetze eingeschränkt werden können. Die Dosierung von Pentobarbital, die in unserem Protokoll verwendet wird, beträgt 75 g/g Körpergewicht. Die maximale Dosierung sollte jedoch nicht mehr als 100 g/g Körpergewicht betragen, um den Tod der anästhesierten Tiere zu verhindern. Obwohl die Transplantation des Thymus in die Nierenkapsel eine effiziente Methode zur funktionellen Untersuchung des Thymus in vivo ist, gibt es einige Einschränkungen in der oben vorgestellten Methode. Zu diesen Einschränkungen gehört das Risiko, dass der Thymus während der 8-wöchigen In-vivo-Wachstumsphase aus der Nierenkapsel fällt (1 von 12). Zweitens ist eine weitere Einschränkung der Tod von Mäusen nach der Operation (6 von 30). Dieser Tod wird jedoch hauptsächlich durch die Überdosierung des Pentobarbitals verursacht. Als solche können andere zulässige Methoden der Anästhesie angewendet werden.
Zusammenfassend bieten wir ein einfaches und effizientes Protokoll, um den E18.5-Thymus zu isolieren und zu kultikulturen und anschließend den Thymus in die Nierenkapsel zu transplantieren. Dies ermöglicht dann die Analyse der Funktion der thymischen Epithelzellen und den Prozess der T-Zellenreifung.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Start Package der Jinan University to S.J. und das Science and Technology Program of Guangzhou China (Grant No. 201704020209 to S.J.) unterstützt. Wir danken Amy Botta (Department of Biology, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Kanada) für das Korrekturlesen und Bearbeiten des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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