Summary
我々は、ヌードマウスの腎カプセルに2'-デオキシグアノシン処理E18.5胸腺を移植するための簡単かつ効率的な方法を提供する。この方法は、甲状腺上皮細胞機能とT細胞の成熟の両方の研究に付加されるべきである。
Abstract
胸腺は重要な中央免疫器官であり、T細胞の発達と分化に不可欠な役割を果たしている。胸腺移植は、生体内の甲状腺細胞機能およびT細胞の成熟を調るための重要な方法である。ここでは、2'デオキシグアノシン(ドナーのリンパ球を枯渇させる)をアチミックヌードマウスの腎カプセルに移植するために当研究室で使用される実験方法について説明します。この方法は、シンプルかつ効率的であり、特別なスキルやデバイスを必要としません。この簡易方法を用いられた結果は、移植された胸腺がレシピエントのT細胞産生を効果的にサポートできることを示した。さらに、プロトコルに関するいくつかの重要なポイントがさらに解明されます。
Introduction
胸腺は中央免疫器官であり、胸腺胸腺細胞内では陽性および陰性の選択を受け、成熟したT細胞1、2になる。異常な陽性または陰性の選択は、それぞれ3、4の免疫不全または自己免疫病理をもたらす。したがって、胸腺臓器移植は、ドナーの胸腺におけるT細胞選択の過程を研究するための重要なアプローチである。この方法は、変異時に胚致死表現型を引き起こす遺伝子変異によって媒介される胸腺上皮機能を分析する場合に特に重要である5.
移植された胸腺におけるレシピエントのT細胞の成熟を研究するためには、胸腺内のドナーリンパ球の枯渇が必要である。この目的のために、胚14-、15-または16日(E14、E15、E16)胸腺は、通常6、7を選択される。より成熟した段階からの胸腺はまた、2'-デオキシグアノシンで治療することによってドナーのリンパ球を正常に枯渇させることができる。しかし、リンパ球を枯渇させ、古い胸腺培養の使用のための詳細なプロトコルは、以前に記載されていない8,9.移植プロトコルは、いくつかの研究10、11によって導入されているが、これらのプロトコルのさらなる改変および改善が必要である。
我々のプロトコルは2つの部分に分かれています:(i)2'-デオキシグアノシン含有培地における培養による後期発達段階E18.5胸腺からのTリンパ球の枯渇。(ii) 培養胸腺をレシピエントに移植する。この手順では、腎臓損傷の可能性を減らした腎カプセルに大きな組織(E18.5胸腺)を届ける簡単な方法を開発しました。後の段階の胸腺に焦点を当てながら、私たちのプロトコルはまた、様々な発達段階または他の同様のサイズの組織で胸腺の移植のための変更で直接または使用することができます。
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Protocol
提示されたプロトコルは、動物のケアに関する済南大学の倫理委員会のガイドラインに準拠しています.
注:使用する材料は、材料の表に記載されています。
1.胚性胸腺の分離
- 実験の前にすべての外科器具をオートクレーブし、70%のエタノールでベンチ/フードを殺菌する。
- 二酸化炭素を使用して、妊娠中の雌マウスを麻酔し、安楽死させる(18.5日後に交配に成功した)。その後、70%のエタノールで腹部領域を拭きます。
注:ここでは、Insm1+/lacZメスとInsm1+/lacZオスを合致しました。ペントバルビタールの内皮注射は、子宮からの胚の単離および各胚に対して切断が行われる前に行った。 - はさみを使って、膀胱から始まり、子宮の各角まで走る腹部に「V」の形のカットを行います。
- はさみを使って、体膜と子宮頸部/膣を切り、子宮を採取する。冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を含むペトリ皿に子宮を氷の上に置きます。次に、封入された決定器内にある胚を、一方の子宮角からもう一方の子宮角に切り取ることによって露出する。細かいピンセットを使用して、封筒に入れたデシドア組織を剥がし、臍帯を切って胚を放出する。胸腺の分離まで氷の上に新しいペトリ皿にすべての胚を置きます。
- 70%のアルコールで胚を拭き、新しいペトリ皿に入れます。この手順から、滅菌条件が維持されていることを確認します。
- はさみで下顎を切り取り、胚の頭部を取り除き、ペーパータオルで血液を排出します。次に、同じペトリ皿に胚を上の位置に固定します。
注:Insm1とlacZジェノタイピングのために各胚の尾部を切り取りました。 - はさみを使って、軸前に沿って横胸壁を水平に切り、横隔膜を切って胸を開きます。胸腺は気管の前にあり、心臓に隣接する2つの白い葉として見えるはずです。
- 胸腺の後ろに曲がった先端の鉗子を置き、胸腺をそっと引き抜きます。胸腺の完全性を確認し、2つの接合葉が含まれていることを確認してください。
- 胸腺を1x PBSで洗浄し、立体顕微鏡下で結合組織と血管を切り取ります。
2. 単離胚性胸腺の培養
- 培養培地の500 μL(RPMI1640 + 15% 胎児ウシ血清(FBS)+100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を24ウェルプレートの各ウェルに加えます。きれいな胸腺を井戸ごとに1つの胸腺で井戸に移します。図1は、培養培養培養における単離された胸腺を表示する。
- 各胸腺含有によく1.25 mMの最終濃度に2'-デオキシグラノシンを追加します。
- 単離された胸腺を8日間培養し、培養培養培養剤と2'-デオキシグラノシンの両方を2日ごとにリフレッシュする。
3. 腎カプセル内のサブカプセル空間の確立
- 針と切り抜いた注入管(図2)を準備するには、はさみを使ってチューブ部分の頭皮静脈針を45°の角度で切ります。
- ヌードマウスの重量を量り、ペントバルビタール(1.5%)で麻酔注入(75 μg/gのボディ重量)。
- つま先のピンチに続く反射が見られなかった場合は、手術台の上にマウスを右横の位置に置きます。
- 0.5%のポビドネヨウ素綿棒で、外科領域で内側から外側に2回皮膚を消毒する。
- はさみを使用して、左腎領域(最後の肋骨と腸骨の頂点の間)の脊椎に平行な5〜9ミリメートルの皮膚切開を行います。次に、皮下組織と筋肉を切断して腹腔を開き、腎臓を露出させる。
- 腎臓が露出したら、片手にピンセットを使用して、脊椎側切開エッジから筋肉と脂肪組織を持ち上げます。一方、腎臓をそっと絞り出す(あるいは、腎臓は両手の指を使って絞り出すことができる)。
- 腎カプセルが手術中に湿っていることを確認するには、生理食液(0.9%NaCl)で腎臓の表面を濡らします。
- 腎臓カプセルにニックを作成し、ステップ3.1で調製した針先を使用して、右下の腎カプセルを静かに傷つける。ニックのサイズは、腎臓の1/2-2/3幅でなければなりません。腎臓に傷をつけないで下さい。
- ステップ3.1で調製した注入チューブを腎カプセルのニックにスライドさせます。腎臓カプセル内の3~4mmに達するまで、腎臓の長い側に沿って腎臓と腎臓を穏やかに解離します。注入チューブを引き戻します。腎臓のサブカプセル空間が確立される。
4. 胚性マウス胸腺移植
- 培養物を枯渇させるために生理生理生理のためにステップ2.3で培養胸腺を2回洗う。
- ステップ3.1で調製したクリップされた注入チューブを、シリンジ接続インターフェースの注射器に接続します。準備された胸腺を注入管にゆっくりと吸引する。
- 切り抜いた注入管を腎カプセルにそっと挿入し、優れたポールに到達します。胸腺を腎カプセルに入れ、注射器のプランジャーを静かに押しながらチューブをゆっくりと引き込みます。
- アルコールランプを使用して、ステップ3.1で調製した針をわずかに加熱します。胸腺全体がサブカプセル空間内であることを確認した後、加熱された針を使用してニックを焼きます。
- 焼灼後、腹腔内の腎臓を復元する。骨膜と筋肉を縫合する。
- 変更された中断された垂直マットレス縫合糸を使用して、皮膚切開を閉じます(少なくとも3ノットを結び、余分な糸を切り取ります)。
- ポビドンヨウ素綿棒を用いて、切開部を消毒する。痛みを和らげるために、フラニキシン(体重2μg/g)の皮下注射を手術中に行い、手術後3日間行った。
- 麻酔から完全に回復するまで、赤外線ランプの下でマウスを暖かく保ちます。
- 移植された胸腺を解剖し、前述の5、8、9と同じように表現性分析を行う前に、8週間レシピエントの腎臓カプセルに胸腺を保管してください。
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Representative Results
ここでは、2つの完全な葉を含む単離されたE18.5胸腺を示します(図1)。さらに、注入管に斜地を形成するために切り取られた頭皮静脈針を示す(図2)。次に、レシピエントマウス内で8週間の増殖後に腎カプセル(図3A)と胸腺に移植した胸腺の位置の代表的な画像も示す(図3B)。胸腺を移植したヌードマウスでT細胞が産生されたかどうかを判定するために、移植された胸腺と末梢血の両方において、CD4およびCD8抗体染色およびフローサイトメトリー分析を用いて細胞集団を検出した。末梢血は、前述の12としてレトロ軌道部間から採取した。移植された胸腺と胸腺を移植したヌードマウスの末梢血の両方でT細胞が産生されたことがわかった。しかし、移植されていないヌードマウスの末梢血にはT細胞は検出されなかった(図4)。T細胞の供給源を決定するために、我々は、我々の研究室で日常的に使用されるジェノタイピング法を用いて末梢白血球のInsm1およびlacZ遺伝子をチェックし、前述の13,14を説明した。ドナー胚Insm1遺伝子は一方または両方のアレンレでlacZ遺伝子に置き換えられたため、T細胞をドナーから胸腺と共移植した場合、末梢から採取したT細胞のゲノム中のlacZ遺伝子を検出することができた。レシピエントの血液は、ドナー胸腺によって産生されたことを示す。さらに、lacZ遺伝子が存在しなかったため、T細胞がレシピエントの血行細胞から生成されたときにlacZは検出されなかった。末梢T細胞のlacZ遺伝子は、T細胞がレシピエントから生成されたことを示す(図5)。
図1:E18.5胚から単離された胸腺。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:頭皮静脈針から作られたツールを提供する胸腺。頭皮静脈針を45°の角度で針に近い注入管部分で切断し、斜角を作成した。針と注入管の両方を手順で使用した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:胸腺を腎カプセルに移植した。(A) 腎カプセルに新たに移植されたE18.5胸腺。(B)レシピエントにおける8週間の成長後の腎カプセル中の胸腺。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:移植された胸腺から単離されたT細胞のフローサイトメトリー分析は、胸腺移植および非移植ヌードマウスの血液である。CD4およびCD8α抗体は、T細胞染色に用いた。CD4+CD8+二重陽性細胞、CD4+単一陽性およびCD4-CD8-二重陰性細胞は、示されているように各象限に示されている。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:胸腺移植ヌードマウスにおける末梢血T細胞の供給源を同定する。末梢血白血中のlacZ遺伝子およびInsm1遺伝子の遺伝子タイピングが示されている。はしご: DNAマーカー, + : 陽性対照DNA, -: 陰性対照DNA, Anim1: Insm1lacZ/lacZ胸腺で移植されたヌードマウスの末梢白血球由来DNA, Anim2: ヌードマウス移植の末梢白血球由来DNAInsm1+/lacZ胸腺を使用します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
胚性胸腺の腎皮下移植は、子宮上皮細胞機能および生体内でのT細胞成熟の過程を研究する重要な方法である。胚性胸腺臓器培養と移植に関するいくつかの実験的研究があるが、我々のプロトコルは、マウス胚性胸腺培養および腎皮下に関する簡単な代替手順を提供する古い胸腺組織の移植。
私たちのプロトコルは、いくつかの異なる変更を組み込むことによって、以前のプロトコルを改善します6,7,10,11.まず、E14-E16胸腺の代わりに、移植のためにE18.5から単離された胸腺を利用した。利点は、この後の発達段階で胸腺が比較的成熟した胸膜構造および上皮細胞集団を含むことです。新生児または成体マウスは成熟した胸腺の代替源であるが、Jmjd6またはInsm1遺伝子5、13の変異などの遺伝子操作の結果として周産期致死表現型が生じる場合、この方法は成熟した胸腺の研究のための実行可能な代替手段を提供します。第2の改変は、移植前のE18胸腺の培養方法の予見である。さらに、移植手順では3回目の改変が起こり、ピンセットとはさみで腎カプセルを摘み取って切断する代わりに、針先を使って腎臓カプセルにニックを作成しました。この修飾は、腎臓の腎カプセル損傷と損傷の両方を減少させた.最終的な変更の 1 つは縫合工程です。変更された中断された縦のマットレスの縫合は皮の外側の縫合線を除去し、従って噛みによる切開の開始を防ぐ。
このプロトコルは、腎臓カプセルへのE18.5胸腺移植に使用されますが、他の発達段階での胸腺の移植または同様のサイズの他の組織のために改変することができます。さらに、使用される材料は、特に現地の法律によって制限される可能性のある麻酔試薬に関して、異なる領域からの異なるユーザーによってそれに応じて変更することができます。私たちのプロトコルで使用されるペントバルビタールの投与量は75 μg/g体重です。しかし、最大投与量は、麻酔動物の死を防ぐために100 μg/g以下の体重でなければなりません。腎カプセルへの胸腺の移植は、生体内の胸腺の機能的研究のための効率的な方法であるが、上記の方法にはいくつかの制限が存在する。これらの制限には、生体内成長期の8週間(12分1)の間に胸腺が腎臓カプセルから脱落するリスクが含まれる。第二に、もう一つの制限は、手術後のマウスの死(30の6)である。しかし、この死は主にペントバルビタールの過剰摂取によって引き起こされる。したがって、他の許容麻酔方法を採用することができる。
要約すると、我々はE18.5胸腺を分離し、培養し、その後、腎カプセルに胸腺を移植するための簡単で効率的なプロトコルを提供する。これにより、胸腺上皮細胞機能の解析とT細胞の成熟過程が可能になります。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
この研究は、済南大学のS.J.へのスタートパッケージと広州中国科学技術プログラム(助成金第201704020209号からS.J.)によって支援されました。私たちは、原稿の校正と編集のためにエイミー・ボッタ(ヨーク大学、トロント、ON M3J 1P3、カナダ)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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