Summary
우리는 2'-데옥시구아노신 처리 된 E18.5 흉선을 누드 마우스의 신장 캡슐로 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 방법은 흉선 상피 세포 기능과 T 세포 성숙 의 연구에서 보좌관해야한다.
Abstract
흉선은 T 세포의 발달 그리고 분화에 있는 필수적인 역할을 하는 중요한 중앙 면역 기관입니다. 흉선 이식은 생체 내에서 흉선 상피 세포 기능 및 T 세포 성숙을 조사하는 중요한 방법입니다. 여기에서 우리는 2'-deoxyguanosine (기증자의 림프구를 고갈하기 위하여) 심질 누드 마우스의 신장 캡슐로 처리된 배아 흉선을 이식하기 위하여 우리의 실험실 에서 이용된 실험적인 방법을 기술할 것입니다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 특별한 기술이나 장치가 필요하지 않습니다. 이 간단한 방법을 통해 얻은 결과는 이식된 흉선이 수령인의 T 세포 생산을 효과적으로 지원할 수 있음을 보여주었다. 또한 프로토콜과 관련하여 몇 가지 핵심 사항을 더 자세히 설명합니다.
Introduction
흉선은 중앙 면역 기관이며, 흉선 내 의 흉선 세포는 양성 및 음성 선택을 거치고 성숙한 T 세포1,2가됩니다. 비정상적인 양성 또는 음성 선택은 각각3,4.면역 결핍 또는 자가 면역 병리로 인해 발생합니다. 따라서 흉선 이식은 기증자의 흉선에서 T 세포 선택 과정을 연구하는 중요한 접근법이다. 이 방법은 돌연변이때배아 치명적인 표현형을 일으키는 원인이 되는 유전자 돌연변이에 의해 중재된 흉선 상피 기능을 분석할 때 특히 중요합니다 5.
이식 된 흉선에서 수령인의 T 세포의 성숙을 연구하기 위해서는 흉선 내의 기증자의 림프구가 고갈될 필요가 있습니다. 이를 위해, 배아 14-, 15- 또는 16일(E14, E15, E16) 흉선은 일반적으로6,7을선택한다. 더 성숙한 단계에서 흉선또한 성공적으로 2'-deoxyguanosine로 취급하여 기증자의 림프구의 고갈될 수 있습니다. 그러나, 림프구를 고갈시키고 오래된 흉선 배양을 사용하기 위한 상세한 프로토콜은 이전에8,9에기술되지 않았다. 이식 프로토콜은 여러 연구에 의해 도입된 동안10,11,이러한 프로토콜의 추가 수정 및 개선이 필요하다.
우리의 프로토콜은 두 부분으로 구분된다: (i) 2'-deoxyguanosine 함유 매체에서 배양에 의해 후기 발달 단계 E18.5 흉선에서 T 림프구의 고갈. (ii) 배양된 흉선의 이식. 이 절차에서는, 우리는 신장 상해의 감소된 기회를 가진 신장 캡슐로 큰 조직 (E18.5 흉선)를 전달하는 간단한 쪽을 개발했습니다. 나중 단계 흉선에 집중하는 동안, 우리의 프로토콜은 또한 다양한 발달 단계 또는 그밖 유사한 크기의 조직에서 흉선의 이식을 위한 수정으로 직접 또는 수정으로 이용될 수 있습니다.
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Protocol
제시된 의정서는 동물보호에 관한 진안대학교 윤리위원회의 지침을 준수한다.
참고: 사용되는 재질은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 배아 흉골의 분리
- 실험 전에 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 70% 에탄올로 벤치/후드를 살균합니다.
- 이산화탄소를 사용하여 임신한 암컷 마우스를 마취 및 안락사시한다(18.5일 후 성공적인 짝짓기). 그런 다음 70 % 에탄올로 복부 부위를 닦으하십시오.
참고 : 여기에서 우리는 Insm1+/lacZ 여성과 Insm1+/lacZ 수컷을 짝짓기했습니다. 펜토바르비탈의 인트라센트액 주사는 자궁으로부터 배아를 분리하기 전에 수행되었고 각 배아에 대해 참수가 수행되었다. - 가위를 사용하여 방광에서 시작하여 자궁의 각 뿔까지 달리는 복부에 "V"모양의 컷을 만듭니다.
- 가위를 사용하여 메소메아리움과 자궁 경부 / 질을 자르고 자궁을 수집하십시오. 차가운 인산완식염수(PBS)가 들어있는 페트리 접시에 자궁을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 한 자궁 경적에서 다른 자궁 경적으로 전방 자궁 벽을 절단하여 둘러싸인 데시두아에있는 배아를 노출하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 둘러싸인 데시두아 조직을 다시 껍질을 벗기고 탯줄을 잘라 배아를 풀어냅니다. 모든 배아를 새로운 페트리 접시에 얼음 위에 놓고 흉선이 분리될 때까지 놓습니다.
- 배아를 70% 알코올로 닦아 내고 새로운 페트리 접시에 놓습니다. 이 단계에서 멸균 조건이 유지되도록 하십시오.
- 가위로 아래턱에 가깝게 절단하여 배아의 머리를 제거하고 종이 타월로 혈액을 배출합니다. 다음으로, 같은 페트리 접시에 배아를 고정시고 척추 자세로 고정한다.
참고 : 우리는 Insm1 및 lacZ 지질 형질 티핑을 위해 각 배아의 꼬리 조각을 잘라냈습니다. - 가위를 사용하여 겨드랑이 앞을 따라 측면 흉부 벽을 수평으로 자른 다음 횡격막을 잘라 가슴을 엽니다. 흉선은 이제 기관 앞에 있고 심장에 인접한 두 개의 흰 엽으로 볼 수 있습니다.
- 구부러진 팁 집게를 흉선 뒤에 놓고 흉선을 부드럽게 당깁니다. 흉선에 두 개의 관절 로브가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 흉선을 1x PBS로 씻고 입체 현미경으로 결합 조직과 혈관을 다듬습니다.
2. 분리된 배아 흉선 배양
- 배양 배지 500 μL(RPMI1640 + 15% 태아 소 혈청 (FBS) + 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 24웰 플레이트의 각 우물에 추가합니다. 깨끗한 티미를 우물 당 하나의 흉선으로 우물로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 바치자. 도 1은 배양 배지에서 고립된 흉선(thymus)을 표시한다.
- 각 흉선-함유 잘 1.25 mM의 최종 농도에 2'-데옥시그라노신을 첨가한다.
- 8일 동안 고립된 흉선에 배양하고, 2일마다 배양 배지와 2'-데옥시그라노신을 모두 상쾌하게 한다.
3. 신장 캡슐에 캡슐 공간을 설정
- 바늘과 잘린 주입 튜브를 준비하려면 (그림2),가위를 사용하여 튜브 부분에 두피 정맥 바늘을 45 ° 각도로 잘라.
- 누드 마우스의 무게를 측정한 다음 펜토바르비탈(1.5%)으로 마취 주입 (75 μg / g 체중).
- 발가락 핀치를 따르는 반사가 관찰되지 않는 경우, 마우스를 오른쪽 측면 위치에 놓습니다.
- 0.5 % 포비딘 요오드 면봉으로 수술 부위에서 신체 외부로 피부를 두 번 소독하십시오.
- 가위를 사용하여 왼쪽 신장 부위의 척추에 5-9mm 피부 절개를 평행하게 만듭니다 (마지막 갈비뼈와 장골 문장 사이). 다음으로, 피하 조직과 근육을 절단하여 복강을 열고 신장을 노출시다.
- 신장이 노출된 경우 한 손에 핀셋을 사용하여 척추 측 절개 가장자리에서 근육과 지방 조직을 들어 올립니다. 다른 한편으로는, 부드럽게 신장을 짜내십시오 (또는, 신장은 양손의 손가락을 사용하여 밖으로 압착될 수 있습니다).
- 신장 캡슐이 수술 중에 촉촉한지 확인하기 위해 식염수로 신장 표면을 적시고 (0.9 % NaCl).
- 신장 캡슐에 닉을 만들고, 3.1단계에서 제조된 바늘 팁을 사용하여 오른쪽 하단에 신장 캡슐을 부드럽게 긁어냅니다. 닉의 크기는 신장의 1/2-2/3 너비여야합니다. 신장에 긁히지 마십시오.
- 3.1단계에서 제조된 주입 튜브를 신장 캡슐의 닉으로 밀어 넣는다. 신장 캡슐 안쪽에 3-4mm에 도달할 때까지 신장의 긴 측을 따라 신장으로 신장 캡슐을 부드럽게 해리하십시오. 주입 튜브를 다시 그립니다; 신장 잠복 공간이 설정됩니다.
4. 배아 뮤린 흉선 이식
- 식염수로 2.3단계에서 배양된 흉선을 두 번 씻어 배양 배지를 고갈시켰다.
- 3.1단계에서 준비된 잘린 주입 튜브를 주사기 연결 인터페이스의 주사기에 연결합니다. 준비된 흉선을 주입 튜브에 천천히 흡인합니다.
- 잘린 주입 튜브를 신장 캡슐에 부드럽게 삽입하고 우수한 극에 도달하십시오. 흉선을 신장 캡슐에 전달; 동시에 부드럽게 주사기의 플런저를 밀어하면서 천천히 튜브를 철회.
- 알코올 램프를 사용하여 3.1 단계에서 준비된 바늘을 약간 가열합니다. 흉선 전체가 잠복 공간 안에 있는지 확인 한 후 가열 된 바늘을 사용하여 닉을 소작하십시오.
- 소작 후 복강 내 신장을 복원하십시오. 후막과 근육을 봉합.
- 수정 된 중단 된 수직 매트리스 봉합사를 사용하여 피부 절개를 닫습니다 (적어도 3 개의 매듭을 묶고 여분의 실을 잘라냅니다).
- 포비딘 요오드 면봉을 사용하여 절개를 소독하십시오. 통증을 완화하기 위해, 플루니신의 피하 주사 (체중의 2 μg / g)는 수술 중 수술 후 3 일 동안 수행되었습니다.
- 마취에서 완전히 회복 될 때까지 적외선 램프 아래에 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.
- 이식된 흉선과 표현형 분석을 수행하기 전에 8주 동안 수령인의 신장 캡슐에 흉선 보관5,8,9.
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Representative Results
여기서 우리는 2개의 완전한 로브를 포함하는 고립된 E18.5 흉선(그림 1)을 보여준다. 또한, 주입 튜브에 경사를 형성하기 위해 잘린 두피 정맥바늘을 보여줍니다 (그림 2). 다음으로, 우리는 또한 수용자 마우스 내에서 8주 성장 한 후 신장캡슐 (도 3A)과 흉선에 이식 된 흉선위치의 대표적인 이미지를 보여 준다 (도3B). T 세포가 흉선으로 이식된 누드 마우스에서 생산되었는지 여부를 확인하기 위해 이식된 흉선과 말초 혈액 모두에서 CD4 및 CD8 항체 염색 및 유세포 분석 분석을 사용하여 세포 집단을 검출했습니다. 말초 혈액은 앞서 설명한 바와 같이 레트로 궤도 부비동으로부터 수집되었다12. 우리는 T 세포가 이식된 흉선과 흉선으로 이식된 누드 마우스의 말초 혈액 모두에서 생성된 것을 발견했습니다. 그러나, 이식되지 않은 누드 마우스의 말초 혈액에서T 세포가 검출되지 않았다(도 4). T 세포의 근원을 결정하기 위하여는, 우리는 우리의 실험실에서 일상적으로 이용되는 유전자형 검사 방법을 사용하여 말초 백혈구에 있는 Insm1 그리고 lacZ 유전자를 검사하고 이전에 기술한13,14. 공여자 배아 Insm1 유전자가 하나 또는 두 개의 대두에서 lacZ 유전자로 대체되었기 때문에, T 세포가 공여자로부터 흉선과 병용 이식되었을 때, 말초로부터 수집된 T 세포의 게놈에서 lacZ 유전자를 검출할 수 있었다. 기증자 흉선에 의해 생산되었다는 것을 나타내는 수령인의 혈액. 추가적으로, 아무 lacZ 유전자가 존재하지 않기 때문에, lacZ는 수령인의 조혈 세포에서 T 세포가 생성될 때 검출되지 않을 것입니다. 우리는 T 세포가 수용자로부터 생성되었음을 나타내는 말초 T 세포에서 lacZ 유전자를 검출하지 않았다(도 5).
그림 1: E18.5 배아로부터 분리된 흉선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 두피 정맥 바늘로 만든 도구를 전달하는 흉선. 두피 정맥 바늘을 45° 각도로 바늘에 가까운 주입 튜브 부분에서 절단하여 경사를 생성하였다. 바늘과 주입 튜브를 모두 시술에서 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 흉선 캡슐에 이식. (A) 신장 캡슐에 E18.5 흉선을 갓 이식하였다. (B) 8주 간 신장 캡슐에 흉선을 시무스를 수취인으로 성장시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 이식된 흉선으로부터 분리된 T 세포의 유세포분석, 흉선 이식 및 비이식 누드 마우스의 혈액. CD4 및 CD8α 항체는 T 세포 염색에 사용하였다. CD4+ CD8+ 이중 양성 세포, CD4+ 단일 양성, CD8+ 단일 양성 및 CD4-CD8-이중 음성 세포는 지시된 바와 같이 각각의 사분면에 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 흉선 이식된 누드 마우스에서 말초 혈액 T 세포의 출처를 확인하였다. 말초 혈액 백혈구에서 lacZ 유전자 및 Insm1 유전자의 유전자형 질성 세포가 나타내고 있다. 사다리: DNA 마커, + : 양성 대조군 DNA, -: 음성 대조군 DNA, Anim1: Insm1lacZ/lacZ 흉선으로 이식된 누드 마우스의 말초 백혈구에서 DNA, Anim2: 이식된 누드 마우스의 말초 백혈구에서 DNA Insm1+/lacZ 흉선과 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
배아 흉골의 신장 탈캡슐 이식은 생체 내에서 흉선 상피 세포 기능 및 T 세포의 성숙 과정을 연구하는 중요한 방법이다. 배아 흉선 장기 배양 및 이식에대한 여러 실험 연구가 있지만 6,7,우리의 프로토콜은 뮤린 배아 흉선 배양 및 신장 subcapsular에 대한 간단한 대체 절차를 제공합니다 이전 흉선 조직에 대한 이식.
우리의 프로토콜은 여러 가지 수정 6, 7,10,11을통합하여 이전 프로토콜을 개선합니다. 첫째, E14-E16 흉선 대신, 우리는 이식을 위해 E18.5에서 분리된 흉선에 이용했습니다. 장점은 이 후기 발달 단계에서 흉선이 상대적으로 성숙한 흉선 구조와 상피 세포 집단을 포함한다는 것입니다. 신생아 또는 성인 마우스가 성숙한 흉선의 대체 공급원이지만, 주산기 치명적인 표현형이 Jmjd6 또는 Insm1 유전자5,13의 돌연변이와 같은 유전자 조작의 결과로 발생하는 경우,이방법은 성숙한 흉선 연구를위한 실행 가능한 대안을 제공합니다. 두 번째 수정은 이식 전에 E18 흉골의 배양 방법의 수정이다. 추가적으로, 세 번째 수정은 우리가 핀셋과 가위로 신장 캡슐을 따기와 절단 하는 대신 신장 캡슐에 닉을 만들기 위해 바늘 끝을 사용 하는 이식 절차에서 발생 합니다. 이 수정 은 신장 캡슐 손상 및 신장의 부상을 모두 감소시켰습니다. 하나의 최종 수정은 봉합사 단계에 있습니다. 수정 된 중단 된 수직 매트리스 봉합사는 피부의 외부 봉합사 라인을 제거하므로 물기로 인한 절개가 방지됩니다.
이 프로토콜은 신장 캡슐로 E18.5 흉선 이식에 사용되지만, 다른 발달 단계에서 흉선 이식 또는 비슷한 크기의 다른 조직에 대해 수정할 수 있습니다. 또한, 사용되는 물질은 특히 현지 법률에 의해 제한 될 수있는 마취 시약과 관련하여 다른 영역에서 다른 사용자가 그에 따라 수정 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜에 사용 되는 pentobarbital의 복용량은 75 μg/g 체중. 그러나, 최대 복용량 은 마취 된 동물의 죽음을 방지하기 위해 100 μg / g 체중이어야합니다. 흉선을 신장 캡슐내로 이식하는 것은 생체 내에서 흉선에 대한 기능적 연구를 위한 효율적인 방법이지만, 위에 제시된 방법에는 몇 가지 한계가 존재한다. 이러한 제한은 생체 내 성장 기간 8 주 동안 신장 캡슐에서 중하하는 흉선의 위험을 포함 (1 에 12). 둘째로 또 다른 제한은 수술 후 마우스의 죽음 (6 에서 30). 그러나,이 죽음은 주로 펜토 바르 비탈의 과다 복용에 의해 발생합니다. 따라서, 마취의 다른 허용 된 방법을 사용할 수 있습니다.
요약하면, 우리는 E18.5 흉선을 분리하고 배양한 다음 흉선을 신장 캡슐로 이식하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 이것은 그 때 흉선 상피 세포 기능및 T 세포 성숙의 프로세스의 분석을 허용합니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 진안대학의 S.J.와 광저우 중국 과학 기술 프로그램(그랜트 번호 201704020209 ~ S.J.)에 의해 지원되었습니다. 우리는 에이미 보타 (생물학과, 요크 대학, 토론토, ON M3J 1P3, 캐나다) 원고의 교정 및 편집에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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