Summary
Мы предоставляем простой и эффективный метод для трансплантации 2'-деоксигуанозин лечение E18.5 тимуса в почечной капсуле обнаженной мыши. Этот метод должен помощник в изучении как тимоэпилитических клеток функции и Т-клеток созревания.
Abstract
Тимус является важным центральным иммунным органом, который играет важную роль в развитии и дифференциации Т-клеток. Трансплантация тимуса является важным методом для исследования функции тимических эпителиальных клеток и созревания Т-клеток in vivo. Здесь мы опишите экспериментальные методы, используемые в нашей лаборатории для трансплантации 2'-деоксигуанозин (для истощения лимфоцитов донора) лечение эмбрионального тимуса в почечную капсулу атимичной обнаженной мыши. Этот метод является простым и эффективным и не требует специальных навыков или устройств. Результаты, полученные с помощью этого простого метода показали, что пересаженный тимус может эффективно поддерживать производство Т-клеток реципиента. Кроме того, будут дополнительно прояснены некоторые ключевые моменты, касающиеся протокола.
Introduction
Тимус является центральным иммунным органом, в тимоцитах тимуса проходят положительныйи отрицательный отбор, и становятся зрелыми Т-клетками 1,2. Аномальный положительный или отрицательный отбор приводит киммунодефициту или аутоиммунным патологиям соответственно 3,4. Поэтому трансплантация органов тимуса является важным подходом к изучению процесса отбора Т-клеток в тимусе донора. Этот метод особенно важен при анализе тимической эпителиальной функции, опосредоченной геннымимутациями, которые вызывают эмбриональный смертельный фенотип при мутации 5.
Для изучения созревания Т-клеток реципиента в пересаженном тимусе необходимо истощение лимфоцитов донора в тимфоцитах. Для этой цели, эмбриональный 14-, 15- или 16-дневный (E14, E15,E16) тимуса обычно выбирается 6,7. Тимус из более зрелых стадий также может быть успешно истощены лимфоцитов донора путем лечения 2'-деоксигуанозина. Однако подробный протокол для истощения лимфоцитов и использования более старойкультуры тимуса ранее не был описан 8,9. В то время как протоколы трансплантации были введены несколькими исследованиями10,11, дальнейшее изменение и совершенствование этих протоколов необходимо.
Наш протокол разделен на две части: i) истощение Т-лимфоцитов от поздней стадии развития E18.5 thymus культурой в 2'-деоксигуанозин-содержащих средств массовой информации. ii) трансплантация культивированных тимуса получателям. В этой процедуре мы разработали простой способ доставки большой ткани (E18.5 thymus) в почечную капсулу с пониженной вероятностью травмы почек. Сосредоточившись на поздней стадии тимуса, наш протокол также может быть использован непосредственно или с модификациями для трансплантации тимуса на различных стадиях развития или других аналогичных размеров тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Представленный протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике Университета Цзинань в отношении ухода за животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые материалы перечислены в таблице материалов.
1. Изоляция эмбрионального тимуса
- Автоклав ировать все хирургические инструменты перед экспериментом и стерилизовать скамейку/капюшон с 70% этанола.
- Использование углекислого газа, анестезия и эвтаназии беременной женской мыши (18,5 дней после успешного спаривания). Затем протрите область брюшной полости с 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы спаривались Insm1q/lac' женщин и Insm1q/lac' мужчин. Интраплазальное введение пентобарбитала проводилось до изоляции эмбрионов из матки и обезглавливания для каждого эмбриона. - Используя ножницы, сделать "V" формы сократить на животе, начиная с мочевого пузыря и работает до каждого рога матки.
- Используя ножницы, вырезать мезометр и шейку матки / влагалище, и собирать матку. Поместите матку в чашку Петри, содержащую холодный фосфат-буферный солен (PBS) на льду. Далее, разоблачить эмбрионы, которые находятся в окутанной decidua, путем разрезания передней стенки матки от одного рога матки к другому. Используя тонкие пинцеты, очистить назад окутанные ткани decidua и сократить пуповину, чтобы освободить эмбрионы. Поместите все эмбрионы в новое блюдо Петри на льду до изоляции тимуса.
- Протрите эмбрион с 70% алкоголя и поместите его в новое блюдо Петри. С этого шага убедитесь, что стерильные условия сохраняются.
- Разрезая ножницами нижнюю челюсть ножницами, снимите голову эмбриона и слейте кровь бумажным полотенцем. Затем зафиксировать эмбрион на той же чашке Петри в положении на спине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вырезали кусок хвоста каждого эмбриона для Insm1 и лака генотипирования. - С помощью ножниц, вырезать боковую стенку груди горизонтально вдоль подмышечной передней, а затем вырезать диафрагму, чтобы открыть грудь. Теперь тимус должен быть виден как две белые доли, расположенные перед трахеей и прилегающие к сердцу.
- Поместите согнутые наконечникщицы за тимуса, а затем снять тимуса осторожно. Обязательно проверьте целостность тимуса, чтобы подтвердить, что он содержит две объединенные доли.
- Вымойте тимус с 1x PBS и обрезать соединительные ткани и кровеносные сосуды под стереомикроскоп.
2. Культура изолированного эмбрионального тимуса
- Добавьте 500 зЛ культуры среды (RPMI1640 и 15% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 100 U/mL пенициллин и 100 мкг /мл стрептомицина) к каждой скважине из 24-хорошо пластины. Перенесите чистый тими в колодцы с одним тимусом на скважину. На рисунке 1 отображается изолированный тимус в культурных носителях.
- К каждому тимус-содержащему хорошо добавить 2'-деоксигранозин к окончательной концентрации 1,25 мМ.
- Культура изолированных тимуса в течение восьми дней, освежая как культуры средств массовой информации и 2'-деоксигранозин каждые два дня.
3. Установить подкапсулянное пространство в почечной капсуле
- Для подготовки иглы и обрезанной инфузионной трубки(рисунок2), вырезать иглу вены кожи головы на трубе часть под углом 45 "с помощью ножниц.
- Взвесить обнаженную мышь, а затем анестезируют ее пентобарбиталом (1,5%) инъекция (75 мкг/г массы тела).
- Когда не наблюдается рефлекс ажиотажа, поместите мышь на операционный стол в правом боковом положении.
- С 0,5% повидон йод мазок, дезинфицировать кожу в два раза в хирургической области изнутри на внешнюю сторону тела.
- Используя ножницы, сделайте разрез кожи на 5-9 мм параллельно позвоночнику в левой области почек (между последним ребром и подвздошным гребнем). Затем откройте брюшную полость, прорезая подкожную ткань и мышцы и разоблачить почки.
- С почками подвергаются, используйте пару пинцета в одной руке, чтобы поднять мышцы и жировой ткани от позвоночника стороне края разреза. С другой стороны, аккуратно выжать почки из (альтернативно, почки могут быть выдавлина с помощью пальцев обеих рук).
- Для обеспечения влажной почечной капсулы во время операции, мокрые поверхности почки с сольником (0,9% NaCl).
- Создайте ник в капсуле почки, и аккуратно поцарапать почечной капсулы на нижней правой стороне с помощью кончика иглы подготовлены в шаге 3.1. Размер ник должен быть 1'2-2/3 ширины почки; не царапайте почку.
- Сдвиньте инфузионную трубку, приготовленную в шаге 3.1 в ник на почечной капсуле. Аккуратно разъедините почечную капсулу с почечной почкой вдоль длинной стороны почки до достижения 3-4 мм внутри почечной капсулы. Нарисуйте инфузионную трубку; устанавливается подкапсулянное пространство почек.
4. Трансплантация эмбрионального тимина thymus
- Вымойте тимуса культивируется в шаге 2,3 в два раза в солин истощать культуры средств массовой информации.
- Подключите обрезанную инфузионную трубку, подготовленную в шаге 3.1, к шприцу в его интерфейсе для подключения шприца. Медленно аспирируйте подготовленный тимус в инфузионную трубку.
- Аккуратно вставьте обрезанную инфузионную трубку в почечную капсулу и достигните верхнего полюса. Доставьте тимус в почечную капсулу; медленно втягивайте трубку, одновременно нажимая поршень шприца.
- Используя алкогольную лампу, слегка нагрейте иглу, приготовленную в шаге 3.1. После обеспечения того, чтобы весь тимус находится внутри подкапсулянного пространства, используйте нагретую иглу, чтобы прижречь ник.
- После прижь, восстановить почки в брюшной полости. Шов перитонеума и мышцы.
- Используя модифицированный прерванный вертикальный шв матраса, закройте разрез кожи (свяжите не менее трех узлов и отрежьте излишки нити).
- Используя мазок йода, дезинфицировать разрез. Для облегчения боли во время операции была проведена подкожная инъекция флинкина (2 мкг/г массы тела), а затем в течение 3 дней после операции.
- До полного оправившись от анестезии, держите мышь теплой под инфракрасной лампой.
- Держите тимус в капсуле почки реципиента в течение 8 недель, прежде чем вскрыть пересаженный тимус и проведение фенотипического анализа, как ранее описано5,8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы покажем изолированные E18.5 тимуса, содержащие две полные доли(Рисунок 1). Кроме того, мы показываем иглы вены кожи головы, которая была обрезана, чтобы сформировать скобы на инфузионной трубке(рисунок 2). Далее мы также показываем репрезентативное изображение положения тимуса, который был пересажен в почечную капсулу(рисунок 3A) и тимуса после 8 недель роста в мышах-реципиентах (рисунок3B). Чтобы определить, были ли Т-клетки были произведены в обнаженных мышей, пересаженных с тимуса, как в пересаженной тимус и периферической крови, мы обнаружили популяции клеток с помощью CD4 и CD8 антитела окрашивания и потока цитометрии анализа. Периферическая кровь была собрана из ретро-орбитальной синусовой, как ранее описано12. Мы обнаружили, что Т-клетки были произведены как в пересаженном тимусе, так и в периферической крови обнаженных мышей, пересаженных тимусом. Однако, никакие Т-клетки не были обнаружены в периферической крови непересаженных обнаженных мышей(рисунок 4). Чтобы определить источник Т-клеток, мы проверили гены Insm1 и lac' в периферических белых кровяных клетках, используя методы генотипирования, обычно используемые в нашей лаборатории и описанные ранее13,14. Так как ген донорского эмбриона Insm1 был заменен геном лака в одном или обоих аллелях, когда Т-клетки были совместно пересажены тимусом от донора, мы смогли обнаружить ген лака в геноме Т-клеток, собранных из периферических кровь реципиента, что указывает на то, что они были произведены донором тимуса. Кроме того, поскольку ни один ген лака не присутствовал, лак не будет обнаружен, когда Т-клетки были получены из гематопоэтиных клеток реципиента. Мы не обнаружили ген акве в периферических Т-клетках, указывающих на то, что Т-клетки были получены из реципиента(рисунок 5).
Рисунок 1: Тимус изолирован от эмбрионов E18.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Thymus доставки инструментов, изготовленных из иглы вены кожи головы. Игла вен ы головы была вырезана на инфузионной трубе часть близко к игле под углом 45 ", чтобы создать скобы. И игла, и инфузионная трубка были использованы в процедуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Тимус пересажен в почечную капсулу. (A) Свежепересадошная железная кишать в почечную капсулу E18.5 thymus. (B) Тимус в почечной капсуле после 8-недельного роста реципиента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ цитометрии потока Т-клеток, изолированных от пересаженного тимуса, крови тимуса-пересаженных и не пересаженных обнаженных мышей. Антитела CD4 и CD8 были использованы для окрашивания Т-клеток. Cd4-CD8- двойные положительные клетки, CD4- одиночный позитив, CD8- одиночный положительный и CD4 - CD8-двойные отрицательные клетки показаны в каждом из квадрантов, как указано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Определение источника периферической крови Т-клеток в тимуса пересажены обнаженные мыши. Показано генотипирование гена лака и гена Insm1 в периферических белых клетках крови. Лестница: Маркер ДНК, : положительный контроль ДНК, -: отрицательный контроль ДНК, Anim1: ДНК из периферических белых кровяных клеток обнаженной мыши пересажены с Инсм1лак/ тимус, Anim2: ДНК из периферических белых кровяных клеток обнаженной мыши пересажены с тилю из инсм1и тилем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Почечная субкапсулулярная трансплантация эмбрионального тимуса является важным методом изучения функции тимических эпителиальных клеток и процесса созревания Т-клеток в vivo. Хотя Есть несколько экспериментальных исследований по эмбриональной культуры органов тимуса и трансплантации6,7, наш протокол обеспечивает простую альтернативную процедуру на мурин эмбриональной тимуса культуры и почечной подкапсулы трансплантации для старых тканей тимуса.
Наш протокол улучшает предыдущие протоколы, включив несколько различных модификаций 6,7,10,11. Во-первых, вместо вилки E14-E16 мы использовали тимуса, выделенный из E18.5, для трансплантации. Преимущество заключается в том, что тимус на этом более позднем этапе развития содержит относительно зрелые тимские структуры и эпителиальные популяции клеток. Хотя новорожденные или взрослые мыши являются альтернативным источником зрелого тимуса, если перинатальный смертельный фенотип возникает в результате манипуляций с генами, таких как мутации в генах Jmjd6 или Insm1 5,13, этот метод обеспечивает жизнеспособную альтернативу для изучения зрелого тимуса. Вторая модификация – это предвидение культового метода тимуса E18 перед трансплантацией. Кроме того, третья модификация происходит в процедуре трансплантации, в которой мы использовали кончик иглы, чтобы создать ник на почечной капсулы вместо сбора и резки почечной капсулы с пинцетом и ножницами. Эта модификация уменьшила как повреждение почек, так и повреждение почек. Одна окончательная модификация находится в шаге шва. Модифицированный прерванный вертикальный шов матраса устраняет внешнюю линию шва на коже и, следовательно, предотвращает открытие разреза из-за укусов.
Хотя этот протокол используется для пересадки e18.5 thymus в капсулу почки, он может быть изменен для трансплантации тимуса на других стадиях развития или для других тканей с аналогичными размерами. Кроме того, используемые материалы могут быть соответствующим образом изменены различными пользователями из разных областей, особенно в отношении реагентов анестезии, которые могут быть ограничены местными законами. Дозировка пентобарбитала, используемого в нашем протоколе, составляет 75 мкг/г массы тела. Тем не менее, максимальная дозировка должна быть не более 100 мкг/г массы тела, чтобы предотвратить смерть обезожненных животных. Хотя трансплантация тимуса в почечную капсулу является эффективным методом для функционального изучения вилизного виво, некоторые ограничения существуют в методе, представленном выше. Эти ограничения включают риск выпадения тимуса из капсулы почки в течение 8 недель виво-периода роста (1 из 12). Во-вторых, еще одним ограничением является смерть мышей после операции (6 из 30). Однако, эта смерть в основном вызвана передозировкой пентобарбитала. Таким образом, могут быть использованы другие допустимые методы анестезии.
Таким образом, мы предоставляем простой и эффективный протокол для изоляции и культуры E18.5 тимуса, а затем затем пересадить тимус в почечную капсулу. Это позволяет анализ тимических эпителиальных клеток функции и процесс созревания Т-клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не было заявлено.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана стартовым пакетом Университета Цзинаня в S.J. и Научно-технической программой Гуанчжоу Китая (Грант No 2017040209 в S.J.). Мы благодарим Эми Ботту (Департамент биологии, йоркский университет, Торонто, ON M3J 1P3, Канада) за коррективы и редактирование рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
