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Biology

飞秒激光的光刺激激活目标细胞中的细胞外信号调节激酶(ERK)信号或线粒体事件

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

紧密聚焦的飞秒激光可以结合到共聚焦显微镜中,从而对细胞提供精确的刺激,从而实现实时观察和光刺激。光刺激可以激活细胞分子事件,包括ERK信号通路和反应氧物种的线粒体闪光。

Abstract

直接控制细胞定义的分子事件对生命科学很重要。最近,研究表明,飞秒激光刺激可以同时激活多个细胞分子信号通路。在此协议中,我们表明,通过将飞秒激光耦合到共聚焦显微镜中,通过紧密聚焦的激光可以精确刺激细胞。一些可以同时观察到的分子过程随后被激活。我们提出了光刺激的详细方案,以激活Hela细胞中的细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路。如果将飞秒激光脉冲聚焦到特定的线粒体管状结构上,也可以刺激活性氧物种 (ROS) 和其他线粒体事件的线粒体闪光。该协议包括光刺激前对细胞进行预处理,通过飞秒激光照射到靶上进行光刺激,以及观察/识别随后的分子变化。该协议是相关生物研究的全光学工具。

Introduction

控制细胞信号分子的技术是生命科学发展的重要组成部分。传统上,最常用的方法是用药物或生物材料1、2、3进行生化处理。在过去的十年里,光遗传学的发明开启了细胞分子信号调制的新时代。基因工程对光敏感蛋白的转染使光成为调节靶细胞中各种蛋白质活性的有力工具。该技术取得了令人鼓舞的进展,如激发和抑制神经信号,促进基因表达,操纵细胞信号模式,导致不同的细胞命运和病理调查4,5 ,6,7,8,9.然而,光只能通过用光遗传蛋白转染细胞来工作。在现阶段,除了光遗传学之外,还有一种罕见的使光能够直接控制细胞分子的方法。

飞秒激光在保持良好生物安全性的同时,通过提供高效的多光子激发,在生物学方面具有先进的生物学研究。通过部署多种光处理策略,它取得了多光子显微镜、微手术和多光子光遗传学应用10、11、12、13等多项成果。 ,14,15,16.近期的研究表明,飞秒激光刺激已被证明是直接诱发分子信号事件的一种高效光学方法。研究发现,对内质视网膜(ER)的紧聚焦飞秒激光照射能够耗尽ER中的钙,并激活钙释放活性钙(CRAC)通道,在细胞17中形成钙信号。这种光激活的钙信号可以在多种类型的细胞之间传播18,19,20。此外,它还能够激活细胞信号通路,如激活T细胞(NFAT)的核因子和ERK信号通路21,22。通过调整细胞中飞秒激光照射的强度和定位,例如,将激光聚焦在线粒体上,可以影响线粒体形态和分子事件23、24 25.具体来说,线粒体ROS的突发可以通过光刺激激发,光刺激被称为线粒体(线粒体)中的荧光闪烁。

因此,光刺激技术在相关生物研究中具有广泛的应用潜力。这也是一个扩大飞秒激光应用在控制细胞信号分子和功能,除了显微镜的好机会。在这里,我们提供光刺激的技术细节。光刺激是通过将飞秒激光耦合到共聚焦显微镜来实现的,从而提供具有短闪光光刺激的单靶细胞。它可以在细胞中启动高效且可控的 ERK 激活。如果光刺激位于线粒体管状结构上,线粒体膜电位、形态、ROS和渗透性过渡孔隙,都可以由光刺激控制。基于该光刺激方案,我们提供了激活ERK信号通路和影响Hela细胞中多个线粒体事件的详细方法。该协议阐明了向目标细胞提供飞秒激光刺激的过程。

光刺激系统建立在共聚焦显微镜上,带有飞秒激光耦合,可同时进行刺激和连续显微镜。飞秒激光(波长:1,040 nm,重复率:50 MHz,脉冲宽度:120 fs,最大输出平均功率:1 W)在耦合前被分成两个光束。其中一个通过由一对透镜组成的中继望远镜进行引导。然后,它直接反射到目标的后孔径(60x,N.A. = 1.2,水浸)中,形成衍射极限聚焦(Stim-A)。另一种被反射到共聚焦显微镜的扫描光学路径上,作为双光子扫描模式(Stim-B)工作。Stim-A 在视场中心 (FOV) 中显示一个固定焦点。Stim-B 是 FOV 中预先设计的部分共聚焦扫描区域。如图1A所示,显示了 Stim-A 和 Stim-B。二色镜 (DM) 下的 CCD 摄像机提供明场成像,用于监控飞秒激光对焦。

以下实验有一些关键要点。在此协议中,使用飞秒光纤激光源(1040 nm、50 MHz、120 fs)作为示例。在实践中,大多数商用飞秒振荡器可以使用,只要脉冲宽度短于200fs,峰值功率密度应高于10 11~1012 W/cm 2的水平。例如,通常用于多光子显微镜的 Ti: 蓝宝石激光能够取代图 1B所示的飞秒激光。激光功率和其他一些光刺激参数需要调整,因为光学参数(脉冲宽度、波长和重复率)在不同的飞秒激光器中变化很大,从而产生不同的多光子激发效率。

与飞秒激光刺激一起,共聚焦显微镜提供连续细胞成像,以Stim-A和Stim-B模式实时监测分子动力学。两种光刺激方案(Stim-A 和 Stim-B)均由具有毫秒分辨率的机械快门控制(图 1)。

在Stim-A模式下,激光对焦的位置固定在FOV的中心。继电器望远镜用于通过调整垂直方向的两个透镜之间的距离(激光传播方向,垂直到共聚焦成像平面,如图 1.通过CCD相机的明场成像,可以测量激光对焦的直径(+2μm,图2B)。刺激持续时间和曝光时间在共聚焦成像过程中由快门控制。

在 Stim-B 模式下,刺激区域可以在共聚焦成像控制软件中手动预分配给任何形式,如直线、多边形或圆。快门与共聚焦扫描过程同步。它在通过共聚焦成像控制软件设置的预设计时间打开。然后,用飞秒激光扫描刺激区域作为共聚焦显微镜。因此,当共聚焦扫描过程进入给定的成像帧时,只有飞秒激光刺激样品。

根据实验对象,可在倒置和直立冶金显微镜上建立光刺激系统。培养在培养皿中的体外细胞更适合倒置显微镜。动物,特别是活体动物的大脑,更适合使用直立显微镜。在这项研究中,我们以倒置显微镜为例。需要注意的是,在整个实验过程中,培养皿的盖子没有打开。

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Protocol

警告:下面介绍的协议涉及使用近红外飞秒激光和有毒化学品。请注意实验程序引起的所有可能的损害。使用前请阅读所有相关化学品或其他材料的安全数据表。在操作激光源之前,请遵循激光设施的安全说明或咨询专业人士的指导。

1. 实验准备

  1. 设置光刺激系统
    注:该系统由飞秒激光和激光(荧光激发的可见范围)扫描共聚焦显微镜组成。在图1中,光纤飞秒激光器(1,040 nm、50 MHz、120 fs、1 W)用于耦合。参数不是固定的或必要的。它可以被 TI: 蓝宝石激光器或 NIR 范围内的其他商用飞秒振荡器所取代。
    1. 调谐在飞秒激光和共聚焦显微镜上。
      注:在调整光路的过程中,请将飞秒激光功率设置为低电平(±50 mW)。
    2. 使用反射镜(图1B所示的RM1和RM2)通过机械快门引导飞秒激光束。打开快门。
    3. 设置 50/50 光束分路器(BS,图 1B),将飞秒激光束拆分为两个独立的光束(传输光束和反射光束)。引导RM2和BS,使飞秒激光束与扫描激光束重合。
      注:(1) 长通二色镜(DM,700nm切入波长,图1B)后面的参考虹膜(虹膜1,图1B)用于定位扫描激光路径。(2) 系统只能在 Stim-A 或 Stim-B 模式下分别工作。对于 Stim-A 模式,可以删除 BS。对于 Stim-B,BS 可以替换为 RM。
    4. 设置由一对透镜组成的中继望远镜,以扩大透射光束宽度,该宽度与目标的后孔组成。
      注:(1) 参考虹膜2和3(图1B)被设置为对飞秒激光束进行准直合(图1B)。(2) 中继望远镜的放大倍数取决于飞秒激光束的原始直径和目标的后孔径。
    5. 引导 RM (RM 3-5,图 1B) 将膨胀的光束对准显微镜。引导 RM 4 和 RM 5,将飞秒激光对焦调谐到 FOV 中心。
    6. 测量飞秒激光目标的传输效率。
      注:由于这两种模式下激光的穿透路径不同,请分别测量Stim-A和Stim-B的激光功率。它将使用样本中的力量来说明下面的相关实验过程。
    7. 调谐快门,飞秒激光和共聚焦显微镜,直到实验开始。
      注:在下面的实验中,Stim-A 和 Stim-B 不协同工作。如果使用 Stim-A,则需要阻止 Stim-B 的飞秒激光束。另一方面,如果系统在 Stim-B 模式下工作,则应阻止 Stim-A 的光束。
  2. 制备培养基:Dulbeco的改性鹰培养基(DMEM)高葡萄糖与10%胎儿牛血清(FBS)。
  3. 制备ERK2-GFP DNA质粒、Mito-GFP DNA质粒和线粒体基质靶向循环渗透黄色荧光蛋白(mt-cpYFP)DNA质粒。将质粒保持在-20°C,直到使用。
  4. 制备四甲基氨基胺(TMRM,100 μM)和聚乙烯胺(PEI 1mg/mL)。将它们保持在-20°C,直到使用。
  5. 制备5%甲醛,0.5%Triton X-100,抗eIF4E(真核转化起始因子4E),抗体(磷S209,1mg/mL),抗巴克斯抗体(1毫克/升),抗细胞色素C抗体(1毫克/升,二次抗体(抗兔IG H&L,Alexa 氟 488,1 毫克/mL),和 1% BSA 与 0.1% Tween20。将这些试剂保持在4°C,直到使用。
  6. 准备无菌材料:细胞培养瓶、带玻璃滑动底的培养皿(图3A)、带玻璃底的培养皿、印有500μm的细胞位置网格(图3B,用于定位光刺激细胞)、1.5 mL和10 mL管,以及1mL、100 μL 和 10 μL 移液器和吸头。
  7. 制备标准细胞培养实验室设备:一个细胞培养培养培养室,设定在5%CO2和37°C,以及一个生物安全柜。

2. 细胞培养和转染

注:Hela细胞(从1951年2月8日从Henrietta Lacks中提取的子宫颈癌细胞中提取的细胞系)26作为本协议中的例子。

  1. 细胞通道
    1. 从含有足够细胞的细胞培养瓶中取出培养基。
    2. 用2 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗瓶子。拆下 PBS。
    3. 缓慢加入1 mL的胰蛋白酶,然后轻轻敲击瓶子。将瓶子放回培养箱中,在37°C下孵育细胞3分钟。
    4. 取出胰蛋白酶。添加 2-3 mL 的培养基。多次移液介质以帮助细胞分离。将带细胞的介质转移到 10 mL 管中。
    5. 从管中抽取10μL的样品进行细胞计数。
    6. 种子 +25,000 细胞放入培养皿 (图 3A),并添加培养基高达 1 mL.
    7. 将培养皿中含有的细胞放回培养箱中。在转染前,在37°C下孵育细胞24小时。
  2. 细胞转染
    1. 使用0.5 μg的DNA质粒(ERK2-GFP,Mito-GFP或mt-cpYFP)进行每盘转染。在1.5 mL管中加入0.5μg质粒和2.5μgPEI至50μL的DMEM中。在室温下孵育混合介质10分钟。
    2. 从培养箱中拿出细胞。将培养基用 1 mL 的 DMEM 替换。
    3. 将DNA/PEI混合培养成一滴一滴的细胞。将细胞放回培养箱中。
    4. 在37°C下孵育细胞3小时,用1mL培养基取代DMEM DNA/PEI混合培养基。
    5. 在光刺激实验前,在37°C下孵育转染细胞24小时。

3. 通过飞秒激光的光刺激激活ERK2

  1. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  2. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。将激励激光设置为 488 nm。将 488 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素。将每个像素的间隔时间设置为 2.4 μs。将两帧之间的间隔时间设置为 6 秒,以尽量减少光漂白和对细胞的光损伤。将总成像帧设置为大约 300 帧,在单个实验中提供 ±30 分钟的连续显微镜。
    注:可根据实验要求调整两个相邻帧的间隔、总成像帧和连续显微镜的成像时间。如果单个实验持续超过 2 小时,请将第 3.3 步中的显微镜 CO2 孵育系统(如图 4所示)设置为提供 5% CO2和 37 °C 的环境,以保持细胞活力。如果单个实验限制在 2 小时内,则不需要CO2孵育系统。
  3. 打开 CO2孵育系统,打开所有加热器,并将工作温度设置为 37°C。等待温度达到37°C,CO2浓度达到5%。将培养箱阶段放在显微镜舞台上,如图4A所示。
  4. 如步骤 2 所述,制备用ERK2-GFP转染的希拉细胞。
    注:在单个实验中,应用Stim-A或Stim-B方案向细胞提供光刺激。步骤 3.5 和 3.6 分别介绍了 Stim-A 和 Stim-B 下的详细步骤。
  5. 使用 Stim-A 模式向目标细胞提供飞秒激光刺激
    注:在光刺激程序之前,请确保对焦的直径约为2μm。步骤 3.5.1 和 3.5.2 中介绍了此过程。
    1. 从培养箱中取用ERK2-GFP转染的含有细胞的培养皿,并将该菜放在显微镜台上。
    2. 通过显微镜操作软件启动快速扫描模式。调整目标以获得细胞的清晰荧光图像。停止快速扫描。由 CCD 相机切换到亮场成像模式 (图 2A)。打开快门并调整继电器望远镜两个透镜之间的距离,以确保飞秒激光对焦的直径为 ±2 μm(图 2B)。关闭快门以完成调整。
      注:可以标记参考箭头以指示激光对焦 (图2)。同时,还可以在荧光成像窗口的中心设置参考箭头,以指示飞秒激光对焦的位置。
    3. 将飞秒激光的功率设置为 15-40 mW(810 nm、65 fs、80 MHz)或 20-60 mW(1040 nm、120 fs、50 MHz)的试样。将快门的打开时间设置为 0.05-0.2 s。
    4. 使用快速扫描模式选择目标细胞,该细胞表达良好 ERK2-GFP。
    5. 移动舞台,以便在CCD相机的明亮场成像下定位FOV中心选定目标细胞的细胞溶剂区域(图2A)。
    6. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    7. 在任何预定义的时隙打开快门,将步骤 3.5.3 中设计的飞秒激光刺激传递到目标单元。
      注:(1) 光刺激可以在由快门控制的共聚焦显微镜序列中随时执行。(2) 光刺激可以在共聚焦显微镜序列期间在同一位置多次传递。
    8. 等待,直到成像过程完成。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
  6. 使用 Stim-B 模式向目标细胞提供飞秒激光刺激
    1. 将飞秒激光的功率设置为 15-40 mW(810 nm),在试样处设置 20-60 mW(1040 nm)。
    2. 从培养箱中取用ERK2-GFP转染的含有细胞的培养皿,并将其放在显微镜台上。
    3. 使用快速扫描模式选择目标细胞,该细胞表达良好 ERK2-GFP。
    4. 将共聚焦成像过程设置为步骤 3.2。将特殊扫描帧定义为成像过程中的刺激帧。定义模拟帧的参数。
      1. 在靠近目标细胞细胞核的细胞溶胶区域设置扫描区域(2 x 2-3 x 3 μm2)。
      2. 将总扫描时间设置为 0.1-0.2 秒。根据预定义的光刺激区域将飞秒激光快门与共聚焦扫描同步,该区域仅在激光扫描落在刺激帧中时打开,并在激光扫描停止时立即关闭走出去。
        注:(1) 光斑区域可设置为任意大小。(2) 光刺激可以在共聚焦显微镜序列中的任何预定义时隙进行。(3) 光刺激可以在该共聚焦显微镜序列中的FOV中相同或不同的预定义区域进行多次。
    5. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    6. 等待,直到成像过程完成。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
  7. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

4. 通过倍秒激光模拟激活eIF4E(ERK基板)

  1. 赫拉细胞制剂
    1. 按照步骤 2.1.1-2.1.5 操作。
    2. 将+20,000个细胞种子放入具有细胞位置网格的培养皿中(图3B),以定位光刺激细胞。添加培养介质,高达 1 mL。
    3. 将带细胞的盘子放回培养箱中。在飞秒激光治疗之前,在37°C下孵育细胞24小时。
  2. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  3. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。
  4. 作为步骤 3.3 中的陈述,准备 CO2孵育系统。
  5. 使用 Stim-A 模式向目标细胞提供飞秒激光刺激
    1. 将飞秒激光的功率设置为 15-40 mW(810 nm),在试样处设置 20-60 mW(1,040 nm)。将快门的打开时间设置为 0.05-0.2 s。
    2. 从培养箱中取取带细胞的培养皿,并将其安装在显微镜的舞台上的CO2培养箱中。
    3. 在CCD相机的明场成像下以垂直方向移动目标以定位成像平面。以水平方向移动试样阶段,以确保没有细胞位于 FOV 中心。打开快门并调整继电器望远镜两个透镜之间的距离,以确保以 ±2 μm 为单位的飞秒激光对焦直径。关闭快门以完成调整。
    4. 移动显微镜阶段以随机选择 5~10 个网格。在CCD相机的明亮场成像下,通过培养皿底部的网格来指示和本地化。标记/记录盘中选定网格的坐标。
    5. 在 CCD 相机的明亮场成像下,手动刺激选定网格中的所有单元。
  6. 把盘子放回孵化器里。在免疫荧光显微镜前,在37°C下孵育细胞24小时。在拍照程序后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。
  7. 具有光刺激的细胞中磷酸化eIF4E的免疫荧光显微镜,用于确认ERK活化
    1. 将含有光刺激治疗的细胞的培养皿从培养箱中拿出来。删除培养基。用PBS清洗一次细胞。删除 PBS。
    2. 在盘中加入1 mL的5%甲醛(4°C)。用5%的甲醛固定细胞10分钟,取出甲醛缓冲液。用PBS清洗细胞5分钟两次。删除 PBS。
    3. 在菜中加入 1 mL 的 0.5% Triton X-100。在室温下孵育细胞15分钟。拆下 Triton X-100 缓冲液。用PBS清洗细胞5分钟两次。删除 PBS。
    4. 在盘中加入 1 mL 的 1% BSA 缓冲液。在室温下孵育细胞30分钟。卸下 BSA 缓冲区。
    5. 在1mL的PBS中稀释抗eIF4E抗体(磷S209),1%BSA,最终浓度为1μg/mL。将缓冲液加入盘中。在4°C下孵育细胞10-12小时。删除缓冲区。
    6. 用PBS清洗细胞5分钟两次。删除 PBS。
    7. 用1%BSA稀释PBS1 mL中的二级抗体抗兔子IgG H&L,最终浓度为2微克/mL。将缓冲液加入盘中。在室温下孵育细胞2小时。删除缓冲区。
    8. 用PBS清洗细胞。删除 PBS。
    9. 在盘中加入 1 mL 的 PBS。
    10. 打开激光扫描共聚焦显微镜。打开显微镜软件。将激励激光设置为 488 nm。将 488 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素。将每个像素的间隔时间设置为 2.4 μs。
    11. 将带有免疫荧光染色细胞的盘子放在显微镜台上。在 CCD 相机的明亮场成像下找到所选框。
    12. 开始单帧共聚焦扫描。保存光刺激细胞的荧光图片。
    13. 随机移动舞台以定位没有飞秒激光刺激的区域。开始单帧共聚焦扫描。保存无刺激细胞的荧光图片作为控制数据。
  8. 实验后关闭共聚焦显微镜。

5. 通过光刺激激活线粒体事件和其他线粒体事件

注:为了观察线粒体形态动力学,在步骤5.1中用Mito-GFP转染Hela细胞,以荧光表示线粒体。为了观察线闪光,在步骤5.1中用mt-cpYFP转染Hela细胞。

  1. 按照步骤2,准备用Mito-GFP或mt-cpYFP转染的希拉细胞。
  2. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  3. 打开激光扫描共聚焦显微镜。将激励激光设置为 488 nm。将 488 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素。将每帧的总成像时间设置为 2.2 s。将两帧之间的间隔时间设置为 0 s。将总成像帧设置为 200 帧,以在单个实验中提供 ±440 s 的连续显微镜。
    注:可根据实验要求调整两个相邻帧的间隔、总成像帧和连续显微镜的成像时间。
  4. 如果需要,请按照步骤 3.3 中所述准备 CO2孵育系统。
  5. 使用 Stim-A 模式将飞秒激光刺激传递到目标线粒体
    1. 从培养箱中取用Mito-GFP或mt-cpYFP转染的含有细胞的培养皿,并将该菜放在显微镜台上。
    2. 检查飞秒激光的状态,作为步骤 3.5.2。确保飞秒激光的对焦位于 FOV 中心。在荧光成像窗口的中心设置参考箭头以指示焦点的位置。
    3. 将飞秒激光的功率设置为 5-30 mW(810 nm),在试样处设置 10-40 mW(1040 nm)。将快门的打开时间设置为 0.05-0.1 s。
    4. 使用快速扫描模式选择目标细胞,该细胞表达良好 Mito-GFP 或 mt-cpYFP。
    5. 在靶细胞中随机选择一个线粒体作为实验对象。移动显微镜阶段,以便通过快速扫描模式定位 FOV 中心的目标线粒体管状结构(通过参考箭头指示)。
    6. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    7. 在任何预定义时间打开快门,将步骤 5.5.3 中设计的飞秒激光刺激传递到目标线粒体管状结构中。
      注:(1) 线粒体管状结构上的飞秒激光照射可在共聚焦显微镜期间随时由快门控制。(2) 在一个实验中只进行一次飞秒激光照射,因为一个飞秒激光刺激可能会长期干扰线粒体状态。
    8. 等待,直到成像过程完成。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
  6. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

6. 乘月激光刺激对希拉细胞中靶线粒体细胞的线粒体膜电位振荡

  1. 按照步骤 2.1.1-2.1.6 准备希拉细胞。
  2. 在实验前,在37°C下孵育细胞24小时。
  3. 制备 TMRM 染色溶液:用 10% FBS 将 TMRM 稀释到 1 mL 的 DMEM 中,最终浓度为 100 nM。
  4. 将步骤 5.2.1 和 5.2.2 中制备的细胞从培养箱中取走。删除培养基。将步骤 6.3 中制备的 TMRM 染色溶液添加到盘中。在培养箱中37°C下染色15-20分钟。去除染色溶液。用PBS清洗一次细胞。在菜中加入1mL的培养基。
  5. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  6. 打开激光扫描共聚焦显微镜。打开显微镜软件。将激励激光设置为 532 nm。将 532 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素,帧生成时间设置为 2.2 s。将两帧之间的间隔时间设置为 0 s。将总成像帧设置为 200 帧,以在单个实验中提供 ±440 s 的连续显微镜。
    注:可根据实验要求调整两个相邻帧的间隔、总成像帧和连续显微镜的成像时间。
  7. 如果需要,准备步骤 3.3 中描述的 CO2孵育系统。
  8. 使用 Stim-A 模式将飞秒激光刺激传递到目标线粒体。按照步骤 5.5.1-5.5.8 完成实验。
    注:在步骤 6.8 中,选择一个与 TMRM 很好地染色的线粒体作为目标线粒体。
  9. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

7. 通过倍秒激光刺激,在希拉细胞中靶线粒体上发生巴克斯和细胞色素C的变化

注:在这个实验中,用细胞位置网格(图3B)在培养皿中播种细胞,以定位由飞秒激光处理的细胞。用TMRM染色细胞,以本地化被选择由飞秒激光刺激的线粒体。

  1. 如步骤 4.1 所述,在具有细胞位置网格的培养皿中制备 Hela 细胞(图 3B)。
  2. 如步骤 6.3 和 6.4 所述,使用 TMRM 染色细胞。
  3. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  4. 打开激光扫描共聚焦显微镜。打开显微镜软件。将激励激光设置为 532 nm。将 532 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素,帧生成时间设置为 2.2 s。将两帧之间的间隔时间设置为 0 s。将总成像帧设置为 50 帧,以在单个实验中提供 ±110 s 的连续显微镜。
  5. 使用 Stim-A 模式将飞秒激光刺激传递到目标线粒体
    1. 将飞秒激光的功率设置为 5-30 mW(810 nm),在试样处设置 10-40 mW(1040 nm)。将快门的打开时间设置为 0.05-0.1 s。
    2. 从培养箱中取取含有染色细胞的培养皿,并将盘子放在显微镜台上。
    3. 使用快速扫描模式选择与 TMRM 沾染良好的目标细胞。
    4. 移动舞台,以便使用快速扫描模式定位 FOV 中心的目标线粒体管状结构。标记所选像元在亮场成像下所在的网格的坐标。
    5. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    6. 在显微镜成像进度的任何预定义时间打开快门,将步骤 7.5.1 中设计的飞秒激光刺激传递到目标线粒体管状结构中。
    7. 等待,直到成像过程完成。标记由飞秒激光模拟的所选线粒体。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
    8. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。在实验细胞上制备Bax或细胞色素C的免疫荧光显微镜。
  6. Bax 或细胞色素 C在飞秒激光治疗线粒体。
    1. 从显微镜阶段拿出盘子。
    2. 完全免疫荧光染色的Bax或细胞色素C遵循步骤4.7.1-4.7.9。
      注:在步骤 4.7.5 中使用抗 Bax 或抗细胞色素 C 代替抗 eIF4E,完成步骤 7.6.2 中 Bax 或细胞色素 C 的免疫荧光染色。
    3. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。将激励激光设置为 488 nm 和 532 nm。将 488 nm 和 532 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素,将帧生成时间设置为 2.2 s。
    4. 将带有免疫荧光染色细胞的盘子放在显微镜台上。在 CCD 相机的明亮场成像下找到所选网格。找到由飞秒激光处理的细胞。
    5. 开始单帧共聚焦扫描。定位由飞秒激光刺激的线粒体。保存光刺激细胞的荧光图片,以便进一步数据分析。
  7. 实验后关闭共聚焦显微镜。

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Representative Results

光刺激可以同时进行连续共聚焦扫描显微镜。光刺激可以从延时共聚焦显微镜序列中的任何预定义的时隙开始。共聚焦显微镜可以通过荧光成像监测细胞分子。光刺激和其他动力学的分子反应可以这样识别。从理论上讲,如果ERK被激活,它将从细胞质磷酸化移动到细胞核27。特定的细胞命运可以由这个ERK信号28的某些模式调节。在最近的研究中,基于光化学的光学调制提供了对ERK信号持续时间和幅度的高精确控制,并表明扰动的ERK信号传输动力学驱动癌细胞的不当增殖7 8.在这里,我们演示ERK2在用短闪光的飞秒激光处理细胞后,使用该协议中介绍的方法,将ERK2转移到细胞核中。如图5A所示,ERK2-GFP荧光在数分钟的飞秒激光模拟后达到最大值。ERK2分子在激活核的下游基板后将脱磷,然后ERK2回到核GFP荧光降低所指示的细胞质。ERK2可以通过多次光刺激多次激活(图5B)。因此,它可以通过控制多个刺激之间的间隔时间来精确操作ERK2信号模式。此外,ERK2偶尔可以在刺激细胞周围的相邻细胞中激活(图5C)。这一观察表明,用飞秒激光处理的细胞可能会释放一些可扩散的分子,以激活相邻细胞中的ERK2。ERK2下游蛋白eIF4E的磷酸化可以通过免疫荧光显微镜进行确认和可视化(图5D)。结果表明,飞秒激光刺激能成功激活ERK信号通路。更详细的结果在王S,等人22。

线粒体氧化闪光(线闪光)是线粒体中的氧化突发,根植于复杂的线粒体分子动力学。在过去的十年中,线粒体被意识到是一种元素线粒体信号事件,并在多细胞功能29、30、31中发挥重要作用。传统上,线粒体在用化学物质治疗细胞时通常偶然观察到线粒体29、30。通过实施这种光刺激方案,我们实现了一种可控和精确的方式,在单线粒体管水平上激发线粒体。成功的线闪光激发如图6A所示。有趣的是,线波波的特性,如脉冲峰值,宽度和响应持续时间32与飞秒激光功率密切相关。在王S等32个对飞秒激光刺激激发的线闪光进行更详细的定量分析。这种对线粒体的光刺激还显示了线粒体分子动力学的多种,包括线粒体形态的破碎和恢复(图6B),以及线粒体膜电位的振荡(图 6C.与光激活线闪光类似,这些线粒体事件具有不同的性能,具有不同的光刺激功率强度。它不同于ERK信令通路的激活。飞秒激光对单线粒体管的影响受到严格限制。更详细的结果在王Y等人。24和Shi F.等。25.

Figure 1
图1:在飞秒激光耦合到共聚焦显微镜上建立的光刺激方案。(A) 光刺激和共聚焦成像系统的光学路径 (B) .飞秒激光首先由50/50光束分割器分裂成两束。传输通过中继望远镜扩展,然后反射到形成Stim-A的目标中。反射光束通过显微镜扫描系统对齐,形成Stim-B。CCD 相机用于提供明亮的成像,以监测 Stim-A 模式下的元秒激光的细胞和对焦。Stim-A = FOV 中心的固定焦点;Stim-B = 预先设计区域的特殊扫描框架。DM = 二色镜,BS = 分光器,RM = 反射镜。共聚焦扫描激光器的波长为488 nm/532 nm/635 nm,荧光的典型收集波长间隔为<560 nm/560-625 nm/>625 nm。光纤飞秒激光(1,040 nm、120 fs、50 MHz、1 W)可以由 Ti + 蓝宝石激光器(810 nm、80 MHz、65 fs、1 W)或其他商用飞秒激光振荡器取代。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:在Stim-A模式下,在明亮成像下,飞秒激光的定位和尺寸聚焦在共聚焦成像平面上的目标细胞上。(A) 飞秒激光被快门挡住.(B) 飞秒激光已打开.箭头:参考箭头设置在FOV的中心,以确认飞秒激光聚焦定位正确位置。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:用于细胞培养、转染和光刺激实验的培养皿。(A) 直径为 15 mm 和 0.17 mm 厚度的玻璃底的 35 mm 培养皿。(B) 35 毫米培养皿,带玻璃底部和印有 500 μm 的细胞位置网格。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:CO2孵育系统。(A) CO2 孵化器阶段和 (B) 控制面板.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:使用 Stim-A 模式激活 ERK 照片。(A) 单光刺激 (1,040 nm, 40 mW, 0.1 s) 诱导 ERK2-GFP 转位到细胞质,然后回到细胞质。(B) ERK2 信号模式由单飞秒激光照射(红色箭头、1,040 nm、40 mW、0.1s)和两个光刺激(绿色箭头、810 nm、30 mW、0.1 s)进行介导。(C) ERK在目标细胞中通过单短的飞秒激光照射(白色箭头,810 nm,24 mW,0.2 s)在周围细胞中激活。(D) eIF4E-P 的免疫荧光在单光模拟(810 nm、25 mW、0.2 s)后,24 小时显著增加。刻度条 = 10 μm (A) 和 20 μm(B、C)。ERK2-GFP 和 eIF4E-P 的荧光由 488 nm 激发激光激发,并收集在 <560 nm 通道中。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:在Stim-A模式下由光刺激引起的多个线粒体事件。(A) 通过单刺激(810 nm、16 mW、0.1 s)激发受刺激的线粒体小管上的线闪光。(B) 单光刺激引起的线粒体形态分裂和恢复(1,040 nm,30 mW,0.1 s)。(C) 单飞秒激光刺激(1040 nm、20 mW、0.1 s)对线粒体膜电位进行振荡。(A) (B) 和 (C) 中的箭头表示光刺激的位置。刻度条 = 10 μm。Mito-GFP 或 mt-cpYFP 的荧光由 488 nm 激发激光激发,并收集在 <560 nm 通道中。TMRM的荧光由532nm激发激光激发,并收集在560-625nm通道中。请点击此处查看此图的较大版本。

0.05 s 0.1 s 0.2 s 0.5 s
810 纳米、65 fs、80 MHz 20 - 65 mW 10 - 60 mW 5 - 50 mW 5 - 40 mW
1040 纳米、120 fs、50 MHz 30 - 100 mW 20 - 80 mW 15 - 70 mW 10 - 60 mW

表 1:在Stim-A模式下推荐刺激持续时间和飞秒激光的平均功率。

0.05 s 0.1 s 0.2 s 0.5 s
810 纳米、65 fs、80 MHz 25 - 40 mW 20 - 30 mW 15 - 25 mW 10 - 25 mW
1040 纳米、120 fs、50 MHz 40 - 60 mW 30 - 50 mW 25 - 40 mW 20 - 30 mW

表 2:在 2 x 2-3 x 3 μm 模式下,在 Stim-A 模式下推荐刺激持续时间和飞秒激光的平均功率2在细胞。

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Discussion

我们将飞秒激光与激光扫描共聚焦显微镜系统相结合,演示了光刺激策略。光刺激可以通过相应地定义Stim-B直接作为双光子显微镜。我们提供了一个详细的协议,利用短闪光的飞秒激光触发ERK信号或线闪光的目标细胞。不同的刺激模式可以根据不同的实验目的和系统进行。基于共聚焦显微镜可轻松设置 Stim-A。飞秒激光可以在FOV中心的衍射极限水平聚焦。亚细胞目标需要手动移动到飞秒激光对焦位置,并可在任意持续时间内刺激,完全独立于共聚焦显微镜。因此,Stim-A 可以完美地保护出焦点区域的样品,并适合长时间光刺激。Stim-B 的刺激区域可以预定义为 FOV 中的任何区域。它可以自动执行。但刺激持续时间和暴露时间只能随着共聚焦扫描而遵循。设置每个像素的停留时间和总帧大小后,单个显微镜帧中的刺激持续时间实际上是固定的。光刺激也可以定期逐帧执行。它还可用于激活光敏剂和光遗传学蛋白,这些蛋白质需要较少的暴露持续时间,但面积较大。

该协议中的一个关键考虑因素是如何确定飞秒激光刺激的参数。根据我们以前的研究,细胞分子活性主要是由多光子排泄17、21、22、23、24、25引起的。一般来说,多光子的除法效率与所有飞秒激光参数有关,包括波长、脉冲宽度、重复率。细胞反应与激光功率、刺激位置/区域和暴露持续时间同时相关。原则上,刺激效率与细胞安全相冲突。更强的光刺激(如更高的平均功率、更长的刺激持续时间和更大的总事件激光能量)有助于提高刺激效率,但带来更高的细胞损伤风险。由于这些参数也是相对的,并且都有助于刺激和损伤效果,因此不可能只使用一个参数,如总入射激光能量或激光平均功率来定义它是否安全。考虑到信号激活效率和细胞安全,这里,我们提供两个飞秒激光源的建议平均功率和刺激持续时间,供表1和表2参考。此外,应根据实际光学系统和生物样品改变飞秒激光刺激的参数。

根据上述讨论,我们打算提出更详细的光刺激参数范围。在用于光刺激的NIR范围内,飞秒激光的波长可以改变。脉冲宽度应短,以提供高峰值功率和高非线性冲击效率。此协议不建议使用长脉冲持续时间。通常,双光子显微镜(<200 fs)的典型脉冲宽度是正确的选择。激光的重复率不是一个关键因素。高达MHz的重复率适用于此协议。细胞分子反应最关键的因素是飞秒激光的激光功率和刺激持续时间。对于激活 ERK,根据我们以前的工作22,平均功率为 15 mW (810 nm) 或 20 mW (1,040 nm),曝光持续时间为 0.2 s,足以提供足够的刺激来激活 ERK 信号,同时保持超高细胞活力希拉细胞。相反,平均功率超过 80 mW (810 nm) 或 120 mW (1,040 nm), 暴露持续时间超过 1 s 会导致细胞不可逆的损害。线粒体通常对光刺激更敏感。平均功率高于40 mW(810 nm)或 80 mW(1,040 nm)且暴露持续时间超过 0.2 s的刺激可能导致严重损伤,如刺激线粒体甚至整个细胞内所有线粒体中的不可逆碎片。需要注意的是,线粒体对光刺激的光敏性在不同的细胞类型中差异很大。例如,在 HeLa 电池中,激光功率只需要大约 6 mW(810 nm,0.1 s 持续时间)。所有线粒体都可以以碎片、线影和MMP振荡的形式对光刺激作出反应。但在人类中质性干细胞中,能量需要增加到15mW(810纳米,0.1s持续时间),并且仍然大约一半的受刺激线粒体对光刺激没有反应。在Stim-B模式下,另一个因素可能影响光活化效率,细胞损伤是刺激区域。光刺激可能通过在小刺激区域传递而造成细胞损伤。但同样的刺激可能无法激活ERK通过提供更大的刺激区域。我们建议目标细胞中的刺激区域约为2 x 2-3 x 3 μm2,不超过25μm2。

刺激区域的定位对于应用该协议也很重要。根据之前的作品17,22,该地区的光刺激可以有效地耗尽ER中的Ca2+存储,并激活CRAC通道。然后,Ca2+流入可以随后激活 ERK 信令通路。因此,我们建议在Hela细胞的ER区域提供光刺激,以实现高ERK激活效率。ER区域可以通过相对比目标在明场显微镜下与细胞质或细胞核轻松区分。为了引入线粒体信号事件,按照相关程序,可以轻松地将飞秒激光的聚焦安装在选定的线粒体结构上。

该协议中描述的光刺激方法也能够影响其他多细胞事件,如诱导Ca2+和ROS信号17,20,21。应该注意,所有以前的工作都提供了光刺激后细胞安全性的评估。例如,细胞的形态变化、冒泡、线粒体分裂和整个细胞的膨胀、细胞增殖率降低,以及共聚焦显微镜期间荧光的其他一些异常变化都意味着高细胞损伤。应非常小心地监视单元格状态。然而,在激光功率和刺激参数的控制下,细胞的生存能力可以同时保持在非常高的水平,同时具有较高的刺激效率。因此,这种飞秒激光的照拍方法具有进一步扩展到更多领域并应用于相关应用的良好潜力。

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Disclosures

作者声明没有相互竞争的利益。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金(81571719和81661168014、81673014、81870055)、上海市科学技术委员会(18QA1402300和16XD1403100)和国家重点研发计划(2017YFA01046000)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

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References

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

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生物学,第149期,飞秒激光,光刺激,细胞外信号调节激酶(ERK),线粒体,线闪光,生物光子
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Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

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