Biology

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661

Shaoyang Wang^1,2, Minglie Hu², Tao Ren¹, Hao He³

¹Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, ²Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, ³School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

לייזר ממוקד בצורה ממוקדת בשני התאים יכול לספק גירוי מדויק לתאי החיבור למיקרוסקופיה מרוכזת המאפשרת תצפית וגירוי בזמן אמת. הגירוי יכול להפעיל את האירועים המולקולריים תאים כולל מסלול מאותת והבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי.

Abstract

בקרה ישירה של אירועים מולקולריים מוגדרים הסלולר חשוב למדעי החיים. לאחרונה, מחקרים הוכיחו כי גירוי לייזר של נשים במקביל יכול בו זמנית להפעיל מספר מסלולים מולקולריים סלולריים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי באמצעות צימוד לייזר מצמד לתוך מיקרוסקופ קונטואני, תאים יכולים להיות מגורה בדיוק על ידי הלייזר ממוקדת היטב. כמה תהליכים מולקולריים שניתן להבחין בו זמנית מופעלים לאחר מכן. אנחנו להציג פרוטוקולים מפורטים של הגירוי פוטותאי כדי להפעיל את האות מוסדר מוסדרים קינאז (טיפשה) מסלול איתות בתאי הלה. הבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואירועים מיטוכונדריאלי אחרים יכול להיות גם מגורה אם התמקדות הדופק לייזר של פטושני על מבנה מיטוכונדריאלי מסוים צינורי. פרוטוקול זה כולל התייחסות מראש לתאים לפני הפוטוסטימולציה, אספקת הפוטוסטימולציה על-ידי הבזק לייזר משני בלבד אל המטרה, והתבוננות/זיהוי של שינויים מולקולריים לאחר מכן. פרוטוקול זה מייצג כלי כולו אופטי עבור מחקרים ביולוגיים קשורים.

Introduction

הטכנולוגיה של שליטה מולקולות איתות הסלולר היא חלק חשוב של התפתחות מדעי החיים. באופן מסורתי, השיטה הנפוצה ביותר היא טיפול ביולוגי על ידי תרופות או חומרים ביולוגיים¹^,²^,³. במהלך העשור האחרון, ההמצאה של אלקטרואופטיקה פותחת עידן חדש לאפנון תדר מולקולרי סלולרי. העברה עם חלבונים רגישים באור על ידי הנדסת גנים גורם לאור להפוך כלי רב עוצמה כדי לווסת את פעילות החלבונים השונים בתא היעד. טכנולוגיה זו הפכה עידוד מתקדם כגון עירור ועיכוב של אות עצבי, קידום ביטוי גנים, מניפולציה דפוסי האותות הסלולריים, מוביל גורלות תא שונים וחקירה פתולוגית⁴^,⁵ ^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. עם זאת, אור יכול לעבוד רק על ידי הינע תאים עם חלבונים אלקטרואופטיקה. בשלב הנוכחי, קיימות שיטות נדירות המאפשרות אור לשלוט מולקולות הסלולר ישירות מלבד אלקטרואופטיקה.

לייזר פטושני יש מחקרים ביולוגיים מתקדמים על ידי מתן עירור רב-פוטון יעיל תוך שמירה על בטיחות ביולוגית טובה. על-ידי פריסת אסטרטגיות עיבוד מגוונות של תמונות, היא הבינה הישגים רבים כגון מיקרוסקופ רב-פוטון, מיקרוניתוחים ויישומים מרובי פוטון¹⁰^,¹¹,¹²^,¹³ ^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. חקירות שנעשו לאחרונה מראים כי גירוי לייזר של הנשים השני הוכח כשיטה אופטית יעילה ביותר כדי לגרום ישירות לאירועים איתות מולקולרי. זה נמצא כי הקרנה הדוקה התמקדות בלייזר לייזר באופן הדוק על רשתית העין (ER) הוא מסוגל לרוקן את הסידן ב-ER ולהפעיל סידן המופעל לשחרר סידן (CRAC) ערוצים ליצור אותות סידן בתאים¹⁷. זה אות סידן המופעל באמצעות תמונה יכול להתפשט בין סוגים מרובים של תאים¹⁸^,¹⁹^,²⁰. יתר על כן, יש לו גם את היכולת להפעיל משעולים תא איתות כגון גורם גרעיני של הפעלת תאים T (nfat) ו-איתות טיפשה מסלול²¹^,²². על-ידי התאמת העוצמה והלוקליזציה של חשיפה לייזר של פטושניות בתאים, לדוגמה, התמקדות בלייזר על המיטו, היא יכולה להשפיע על מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ואירועים מולקולריים²³^,²⁴^, ²⁵. במיוחד, צרורות של הדור מיטוכונדריאלי יכול להיות נרגש על ידי פוטוגירוי, אשר העיר כמו הבזקי פלורסנט ב המיטוסיה (mitoflashes).

מכאן, הטכנולוגיה לגירוי התמונה הוא בעל פוטנציאל טוב להיות מיושם נרחב במחקר ביולוגי הקשורים. זוהי גם הזדמנות טובה להרחיב את היישומים לייזר של נשים בלייזר בשליטה של מולקולות איתות הסלולר פונקציות מלבד מיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים את הפרטים הטכניים של הפוטוגריית. גירוי התמונה מושגת על ידי צימוד לייזר השני למיקרוסקופ מיקוד כדי לספק תא יעד יחיד עם פוטוגריית פלאש קצר. זה יכול ליזום הפעלה יעילה וניתנת לשליטה של הטיפשה בתא. אם הגירוי הוא ממוקם על מבנה הכרישים מיטוכונדריאלי, הפוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי, מורפולוגיה, ROS, ו חדירות מעבר נקבוביות, כל יכול להיות נשלט על ידי פוטוגריית. בהתבסס על הערכה זו גירוי תמונה, אנו מספקים שיטה מפורטת של הפעלת מסלול איתות טיפשה והשפעה על אירועים מיטוכונדריאלי מרובים בתאי הלה. פרוטוקול זה מהבהיר את התהליך של העברת גירוי לייזר משני בלבד לתאי המטרה.

מערכת הפוטוסטימולציה מבוססת על מיקרוסקופ קונטואני עם צימוד לייזר משני, לגירוי סימולטני ומיקרוסקופ רציף. לייזר המגלגל השני (אורך הגל: 1,040 ננומטר, קצב חזרה: 50 MHz, רוחב הדופק: 120 fs, מקסימום פלט כוח ממוצע: 1 W) הוא מפוצל לשתי קורות לפני צימוד. אחד מודרך דרך טלסקופ ממסר המורכב מזוג עדשות. לאחר מכן הוא משתקף ישירות לתוך הפתח האחורי של מטרה (60x, N.A. = 1.2, טבילה במים) כדי ליצור מוקד עקיפה-הגבלת (בתוך). השני משתקף בדרך הסריקה האופטית של מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי לעבוד כמצב הסריקה שני פוטון ("היכל-בי"). מציג נקודת מיקוד קבועה במרכז שדה הראייה (FOV). הוא אזור סריקת מוקד חלקי. מתוכנן מראש ב-FOV . מוצג באיור 1A מצלמת CCD תחת דיקרואיק mirror (DM) מספק הדמיה בשדה בהיר עבור ניטור המוקד של לייזר משני של הלייזר.

ישנם כמה יסודות חיוניים. לניסויים הבאים בפרוטוקול זה, מקור לייזר של סיבים משני השניים (1040 ננומטר, 50 MHz, 120 fs) משמש כדוגמה. בפועל, רוב המאיירים מסחרי המסחרי השני יכול לשמש כל עוד רוחב הדופק קצר יותר 200 fs ואת צפיפות הכוח שיא צריך להיות מעל רמה של 10¹¹~ 10 ו/cm². לדוגמה, Ti: לייזר ספיר משמש בדרך כלל עבור מיקרוסקופ מולטי פוטון מסוגל להחליף את הלייזר השני הראה באיור 1B. הכוח לייזר וכמה פרמטרים אחרים הגירוי צריך להיות מכוון מכיוון הפרמטרים האופטיים (רוחב הדופק, אורך הגל, ושיעור חזרה) לשנות הרבה לייזרים שונים לנשים שונות, כי ובכך לגרום שונה מרובת פוטון עירור יעילות.

יחד עם גירוי לייזר בשתי השניות, המיקרוסקופיה הקונפוקלית מספקת הדמיה תאית רציפה לניטור הדינמיקה המולקולרית בזמן אמת במצבי הפעולה של הקרן והקיטור. הן מערכות הפוטוסטימולציה ("היכל הקיטור" ו-"בלטה-B") נשלטות על-ידי תריס מכני עם רזולוציה אלפית שניה (איור 1).

במצב של לייזר, מיקום מוקד הלייזר מתוקן במרכז FOV. הטלסקופ ממסר משמש כדי להבטיח את המיקוד של לייזר שנייה להיות ממוקם על מטוס הדמיה קונפוקלית ידי כוונון המרחק בין שתי עדשות בכיוון האנכי (הפצת לייזר כיוון, אנכית למישור הדמיה קונפוקלית, כפי שמוצג ב איור 1). על ידי הדמיה בשדה בהיר של מצלמת CCD, את קוטר המוקד לייזר ניתן למדוד (~ 2 μm, איור 2B). משכי הגירוי וזמני החשיפה נשלטים על ידי תריס במהלך תהליך הדימות הקונמוקד.

במצב-B, ניתן להקצות מראש את אזור הגירוי באופן ידני בתוכנת הבקרה הדמיה של ההדמיה לכל צורה כמו קו, מצולע או עיגול. התריס מסונכרן עם תהליך הסריקה הקונקלית. זה נפתח בזמן מעוצב מראש אשר מוגדר באמצעות הדמיה קונפוקלית וקד השליטה בתוכנה. לאחר מכן, אזור הגירוי נסרק על-ידי לייזר משני בתור מיקרוסקופ קונטואני. לפיכך, המדגם מגורה רק על ידי לייזר משני בלבד כאשר תהליך סריקה מיקוד נכנס מסגרת הדמיה נתונה.

ניתן להקים את מערכת הפוטוסטימולציה בעזרת מיקרוסקופ מתכות הפוך וזקוף בהתאם לנושאי הניסוי. בתאי מבחנה מתורבתים בצלחות פטרי עדיף לעבוד עם מיקרוסקופים הפוכה. בעלי חיים, בעיקר המוחות של חיות חיות, מתאימים יותר עם מיקרוסקופים זקוף. במחקר זה, אנו לוקחים את המיקרוסקופ הפוך כדוגמה. יצוין כי העטיפה של צלחת פטרי אינה נפתחת במהלך כל הניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: הפרוטוקול המוצג להלן כרוך באמצעות לייזר ניר שנייה וכימיקלים רעילים. שים לב לכל הנזקים האפשריים הנגרמת על ידי הליכי ניסוי. אנא קראו גליונות נתונים בטיחותיים של כל הכימיקלים הרלוונטיים או חומרים אחרים לפני השימוש. אנא עקוב אחר הוראות בטיחות של מתקני לייזר או להתייעץ עם אנשי מקצוע להדרכה לפני הפעלת מקור לייזר.

1. הכנה ניסויית

הגדרת מערכת הגירוי
הערה: המערכת מורכבת לייזר משני שניים ולייזר (בטווח הנראה של עירור הקרינה הפלואורסצנטית) מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. באיור 1, סיבים לייזר השני (1,040 nm, 50 MHz, 120 fs, 1 W) משמש צימוד. הפרמטרים אינם קבועים או נחוצים. זה יכול להיות מוחלף על ידי Ti: ספיר לייזר או משני מרחיבים מסחריים אחרים בטווח ניר.
1. מכוונים על הלייזר הפטושני והמיקרוסקופ הקונפאני.
  הערה: נא הגדר את כוח הלייזר השני ברמה נמוכה (~ 50 mW) בתהליך התאמת הנתיב האופטי.
2. השתמש מראות רפלקטיבית (RM1 ו RM2 הראו באיור 1B) כדי להפנות קרן לייזר שנייה באמצעות תריס מכני. . פתח את התריס
3. הגדר 50/50 מפצל קרן (BS, איור 1B) לפצל את קרן הלייזר הנשית לשתי קורות שונות (קרן שידור וקרן השתקפות). לנווט RM2 ו-BS כדי להפוך את קרן הלייזר לייזר לשני במקביל עם קרן לייזר סריקה.
  הערה: (1) התייחסות קשתית (איריס 1, איור 1B) מאחורי המראה ארוך לעבור דיקרואיק (DM, 700 ננומטר לחתוך על הגל, איור 1b) משמש למיקום סריקת נתיב לייזר. (2) המערכת יכולה לעבוד רק במצב של מערכת הקיטור, בהתאמה. עבור מצב של היכל הקיטור, BS ניתן להסיר. עבור היכל הקיטור, ה-BS ניתן להחליף ב-RM.
4. הגדר טלסקופ ממסר המורכב מזוג עדשות כדי להרחיב את רוחב קרן השידור, אשר מורכב עם הצמצם האחורי של המטרה.
  הערה: (1) ההפניה איריס 2 ו-3 (איור 1b) מוגדרות לcollimate קרן הלייזר השנייה (איור 1b). (2) ההגדלה של טלסקופ הממסר תלויה בקוטר המקורי של קרן הלייזר השנייה ובקוטר הפתח האחורי של המטרה.
5. לנווט RMs (RM 3-5, איור 1B) כדי ליישר את הקרן המורחבת למיקרוסקופ. לנווט RM 4 ו-RM 5 כדי לכוונן את המוקד של לייזר בתוך השני למרכז FOV.
6. למדוד את יעילות השידור של המטרה של לייזר הפטושני.
  הערה: נא למדוד את כוח הלייזר בבית הקיטור-A ו-"בהתאמה" בשל נתיבי החדירה השונים של הלייזר בשני מצבים אלה. זה ישתמש בכוח בדגימה כדי להמחיש הליכים ניסוי הקשורים להלן.
7. כוונן את התריס, לייזר השני והמיקרוסקופ הקונטואחר עד שהניסויים יתחילו.
  הערה: , בניסויים הבאים. " במקרה של שימוש ב-"היכל הקיטור", יש לחסום את קרן הלייזר השנייה של "הקיטור". לעומת זאת, הקרן של הרשת המגנטית צריכה להיחסם אם המערכת עובדת במצב של "מערכת הקיטור".
הכינו את מדיום התרבות: מדיום הנשר המשופר (DMEM בינוני) ברמה גבוהה של גלוקוז עם 10% סרום של שור עוברי (FBS).
הכן את ה-DNA ERK2-GFP, מmito-GFP דנ א ומטריצות מיטוכונדריאלי-המיקוד מעגליות חלבון פלורסנט צהוב (mt-cpYFP) ה-DNA פלבאמצע. שמרו את הפלמידים ב-20 ° c עד השימוש.
הכינו את טטרמתילרדאמן (TMRM, 100 μM), ו פוליאתילן (פיי 1 מ"ג/mL). שמרו אותם ב-20 ° צ' עד השימוש.
להכין 5% פאראמפורמלדהיד, 0.5% טריטון X-100, anti-eIF4E (התרגום eukaryotic באתחול פקטור 4E), נוגדן (פוספור S209, 1 מ"ג/mL), נוגדן נגד Bax (1 מ"ג/mL), נוגדן נגד ציטוכרום C (1 מ"ג/mL), נוגדן משני (אנטי ארנב IgG H & L, אלקסה Fluor 488, 1 מ"ג/mL), ו 1% BSA עם 0.1% Tween20. שמרו על הריאגנטים ב -4 ° צ' עד השימוש.
הכנת חומרים סטריליים: בקבוקי תרבות התא, מנות פטרי עם שקופית זכוכית בתחתית (איור 3a), מנות עם תחתית זכוכית, מוטבע 500 יקרומטר תא מיקום התא (איור 3a, כדי להתאים את התאים פוטוגירוי), 1.5 ml ו 10 ml צינורות, ו 1 mL, 100 μL ו -10 מיקרומטר μL וטיפים.
הכנת ציוד המעבדה הסטנדרטית לתרבות התא: חממה לתרבות התא מוגדרת ב-5% CO₂ ו-37 ° c, וארון בטיחות ביולוגי.

2. תרבית תאים והעברה

הערה: תא הלה (קו התאים הנגזר מתאי סרטן צוואר הרחם נלקח בפברואר 8, 1951 מ הנרייטה חסרה)²⁶ משמש כדוגמה בפרוטוקול זה.

מעבר תאים
1. הסר את מדיום התרבות מבקבוק של תרבות התא המכיל מספיק תאים.
2. רוחצים את הבקבוק עם 2 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). . הסר את הערוץ הPBS
3. להוסיף 1 מ ל טריפסין לאט ולהקיש על הבקבוק מעט. לשים את הבקבוק בחזרה בחממה ו הדגירה התאים 3 דקות ב 37 ° c.
4. . הסר את הטריפסין הוסף 2-3 mL של מדיום התרבות. פיפטה את המדיום מספר פעמים כדי לעזור לתאים להתנתק. העבר את המדיום עם תאים לצינור 10 מ ל.
5. קח 10 μL של הדגימה מהצינור לספירת תאים.
6. זרע ~ 25,000 תאים לתוך צלחת פטרי (איור 3A) ולהוסיף מדיום התרבות עד 1 mL.
7. שים את המנה הכילה תאים. בחזרה בחממה מפעיל את התאים 24 שעות ב 37 ° צ' לפני הזיהום.
מעבר תאים
1. השתמש 0.5 μg של ה-DNA פלאמיד (ERK2-GFP, Mito-GFP או mt-cpYFP) עבור העברה למאכל לכל מנה. הוסף 0.5 μg של פלבאמצע ו 2.5 μg של פיי לתוך 50 μL של DMEM ב1.5 תוך צינור mL. דגירה מדיה מעורבת 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. קח את המנה עם התאים מהאינקובטור. החלף בינוני תרבותי עם 1 מ ל של DMEM.
3. הוסף מדיה מעורבת DNA/פיי לתוך התאים ירידה על ידי ירידה. . שים את התאים בחזרה בחממה
4. מודיית את התאים 3 h ב 37 ° צ' ולהחליף את DMEM DNA/פיי מעורב מדיה עם 1 מ ל של תרבות בינונית.
5. מכונות לעירוי תאים 24 שעות ב 37 ° צ' לפני ניסויים בפוטוגירויים.

3. הפעלת הERK2 על-ידי גירוי של לייזר פטושני

הפעל לייזר משני וודא כי התריס סגור.
הפעל את מיקרוסקופ קונפוקלית וקד של סריקת לייזר ופתח את תוכנת המיקרוסקופ. הגדר את לייזר עירור ב 488 ננומטר. הגדר את רמת הכוח של 488 לייזר ננומטר ב-0.1 mW. הגדרת גודל הדמיה כ-512 x 512 פיקסלים. הגדרת זמן מרווח של כל פיקסל כ-2.4 μs. הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות ב-6 s כדי למזער את הלבנת התמונות ולפגוע בתאים. הגדר מסגרות דימות מוחלטת בסביבות 300 מסגרות כדי לספק ~ 30 דקות מיקרוסקופ רציף בניסוי בודד.
הערה: מרווח של שתי מסגרות סמוכות, מסגרות הדמיה מלאה וזמן הדמיה של מיקרוסקופ רציף ניתן לכוונן בהתאם לדרישות הניסוי. אם הניסוי הפרטני נמשך מעל 2 h, בבקשה להגדיר את מערכת הדגירה של CO₂ (מוצג באיור 4) עבור מיקרוסקופ כנוכחי בשלב 3.3 כדי לספק את הסביבה של 5% CO₂ ו 37 ° צ' עבור שמירה על הכדאיות התא. אם ניסוי בודד מוגבל בתוך 2 h, מערכת הדגירה של CO₂ אינו הכרחי.
הפעל את מערכת הדגירה CO₂ , להפעיל את כל חימום ולהגדיר טמפרטורת העבודה ב 37 ° c. המתן עד הטמפרטורה עולה עד 37 ° צ' וריכוז של CO₂ עד 5%. שים את שלב החממה על הבמה במיקרוסקופ כפי שמוצג באיור 4A.
הכינו תאי הלה שהתעברו עם ERK2-GFP כמתואר בשלב 2.
הערה: בניסוי בודד, הערכה "אינ, א" או "בלנסים-B" מוחלת כדי לספק את הגירוי בתאים. שלב 3.5 ו 3.6 להציג צעדים מפורטים תחת מתחת לכאן.
העברת גירוי לייזר בצורת שליטה בתאי המטרה באמצעות מודוס
הערה: לפני הליך גירוי התמונה, בבקשה לוודא קוטר של המוקד הוא סביב 2 μm. תהליך זה מתואר בשלב 3.5.1 וב3.5.2.
1. קח את המנה המכילה תאים הERK2-GFP מאינקובטור ולשים את הצלחת על הבמה במיקרוסקופ.
2. התחל מצב סריקה מהירה דרך תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ. לכוון את המטרה לרכוש תמונות פלורסנט ברור של תאים. הפסק סריקה מהירה. מעבר למצב דימות בשדה בהיר על-ידי מצלמת CCD (איור 2A). פתח את התריס ולהתאים את המרחק בין שתי עדשות של טלסקופ הממסר כדי להבטיח את קוטר של המוקד לייזר השנייה להיות ~ 2 יקרומטר (איור 2b). סגור את התריס כדי להשלים את הכוונון.
  הערה: ניתן לתייג חץ הפניה כדי לציין את מוקד הלייזר (איור 2). בינתיים, ניתן להגדיר חץ הפניה גם במרכז חלון הדמיה של פלורסנט כדי לציין את מיקום המוקד של לייזר משני.
3. הגדר את העוצמה של לייזר לנשים השני ב 15-40 mW (810 nm, 65 fs, 80 MHz), או 20-60 mW (1040 nm, 120 fs, 50 MHz) בדגימה. הגדר את שעת הפתיחה של התריס ב 0.05-0.2 s.
4. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור תא יעד הביע היטב ERK2-GFP.
5. להזיז את הבמה כדי להתאים את אזור ציטוסול של תא היעד שנבחר במרכז FOV תחת הדמיה שדה בהיר של המצלמה CCD (איור 2A).
6. לחץ על התחל התחתון כדי להתחיל בהתקדמות הדמיה רציפה של המיקרוסקופיה.
7. פתח את התריס בכל חריץ זמן מוגדר מראש כדי לספק את הגירוי לייזר הפטושני שתוכנן בשלב 3.5.3 לתוך תא היעד.
  הערה: (1) גירוי הפוטוניתן לביצוע בכל עת ברצף המיקרוסקופיה הנשלט על ידי התריס. (2) גירוי התמונה ניתן למשלוח במשך מספר פעמים באותה תנוחה במהלך רצף המיקרוסקופיה הקונפוקלית.
8. המתן עד להשלמת תהליך הדימות. שמור את נתוני ההדמיה לצורך ניתוח נתונים נוסף.
העברת גירוי לייזר משני בלבד לתאי היעד באמצעות מודוס
1. הגדר את העוצמה של לייזר השני ב15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) בדגימה.
2. קח את המנה המכילה תאים שעברו מזוהמים עם ERK2-GFP מן החממה ולשים אותו על הבמה במיקרוסקופ.
3. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור תא יעד הביע היטב ERK2-GFP.
4. הגדר את תהליך הדימות הקונמוקד כשלב 3.2. הגדירו מסגרת סריקה מיוחדת כמסגרת הגירוי בתהליך הדימות. הגדר את הפרמטר של מסגרת הסימולציה.
  1. הגדר אזור סריקה (2 x 2-3 x 3 יקרומטר²) באזור ציטוסול קרוב לגרעין בתא היעד.
  2. הגדרת זמן סריקה כולל ב-0.1-0.2 s. לסנכרן את התריס של לייזר משני שניים עם סריקת קונפוקלית וקד בהתאם לאזור פוטוגריית מוגדר מראש, אשר פתוח רק כאשר סריקת לייזר טיפות במסגרת גירוי ולסגור מיד כאשר הוא יוצא
    הערה: (1) ניתן לקבוע את אזור הפוטוליון בכל גודל. (2) גירוי הפוטוניתן לביצוע בכל חריץ זמן מוגדר מראש ברצף המיקרוסקופיה. (3) הגירוי ניתן לבצע במשך מספר פעמים באותם אזורים מוגדרים מראש או שונים ב-FOV ברצף המיקרוסקופיה הקונמטאני.
5. לחץ על התחל התחתון כדי להתחיל בהתקדמות הדמיה רציפה של המיקרוסקופיה.
6. המתן עד להשלמת תהליך הדימות. שמור את נתוני ההדמיה לצורך ניתוח נתונים נוסף.
כבו את הלייזר השני, ומיקרוסקופ הקונטומוקד לאחר הניסוי.

4. הפעלה של eIF4E (מצע של טיפשה) על ידי סימולציה לייזר של פטושני

הכנה לתאי הלה
1. בצע את השלבים 2.1.1-2.1.5.
2. זרע ~ 20,000 תאים לתוך צלחת פטרי עם רשתות מיקום התא (איור 3B) כדי להתאים את התאים פוטוסטימולציה. הוסף מדיום תרבות עד 1 מ ל.
3. שים את המנה עם התאים. בחזרה בחממה מודאת התאים 24 שעות ב 37 ° צ' לפני הטיפול בלייזר לייזר לשני.
הפעל את לייזר הפטושני וודא כי התריס סגור.
הפעל את מיקרוסקופ קונפוקלית וקד של סריקת לייזר ופתח את תוכנת המיקרוסקופ.
הכינו את מערכת הדגירה של CO₂ כהצהרה בשלב 3.3.
העברת גירוי לייזר בצורת שליטה בתאי המטרה באמצעות מודוס
1. הגדר את העוצמה של לייזר השני ב15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1,040 nm) בדגימה. הגדר את שעת הפתיחה של התריס ב 0.05-0.2 s.
2. קח את הצלחת עם תאים מתוך החממה להר אותו₂ חממה על הבמה של מיקרוסקופ.
3. להעביר את המטרה בכיוון אנכי כדי לאתר את המטוס הדמיה תחת הדמיה שדה בהיר של מצלמת CCD. הזז את שלב הדגימה בכיוון אופקי כדי לוודא שהתא לא מאתר במרכז FOV. פתח את התריס ולהתאים את המרחק בין שתי עדשות של טלסקופ הממסר כדי להבטיח את קוטר המוקד לייזר השני של הלייזר ב ~ 2 μm. סגור את התריס כדי להשלים את הכוונון.
4. הזז את שלב המיקרוסקופ כדי לבחור באופן אקראי 5 ~ 10 רשתות. זה יכול להיות מצוין ומקומי על ידי רשתות בחלק התחתון של מנות פטרי תחת הדמיה שדה בהיר של מצלמת CCD. סמן/הקלט את הקואורדינטות של הרשתות הנבחרות במנה.
5. לעורר את כל התאים הממוקמים ברשתות שנבחרו אחד אחד באופן ידני תחת הדמיה שדה בהיר של מצלמת CCD.
. תחזיר את המנה לחממה מודמים את התאים 24 שעות ב 37 ° צ' לפני מיקרוסקופ מאימונולובורנציה. כבו את הלייזר לייזר ומיקרוסקופ הקונטושני לאחר הליך פוטוגירוי.
Immunofluorescence מיקרוסקופ של eIF4E זרחתית בתאים עם גירוי לאישור הפעלה של טיפשה
1. קח את המנה המכילה תאים עם טיפול פוטוגירויים בשלב 4.5 מתוך החממה. הסר את מדיום התרבות. . שטוף את התאים עם הPBS פעם אחת הסר את PBS.
2. הוסיפו 1 מ ל של 5% פאראפורמלדהיד (4 ° c) לתוך המנה. תקן את התאים עם 5% פאראמפורמלדהיד עבור 10 דקות.. תסיר את מאגר הפאראמפורמלדהיד שטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות פעמיים. הסר את PBS.
3. הוסף 1 mL של 0.5% טריטון X-100 לתוך המנה. מודקון את התאים 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר הטריטון X-100. שטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות פעמיים. הסר את PBS.
4. הוסף 1 mL של 1% BSA מאגר לתוך המנה. מודקון את התאים 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר ה-BSA.
5. לדלל את הנוגדן anti-eIF4E (פוספור S209) ב 1 מ ל של PBS עם 1% BSA לריכוז הסופי של 1 μg/mL. הוסף את המאגר לתוך המנה. דגירה את התאים עבור 10-12 h ב 4 ° c. הסר את המאגר.
6. שטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות פעמיים. הסר את PBS.
7. לדלל את הנוגדן המשני אנטי ארנב IgG H & L ב 1 מ ל של PBS עם 1% BSA לריכוז הסופי של 2 μg/mL. הוסף את המאגר לתוך המנה. מודג את התאים 2 h בטמפרטורת החדר. הסר את המאגר.
8. . תשטוף את התאים עם הערוץ הסר את PBS.
9. הוסף 1 מ ל של PBS לתוך המנה.
10. . הפעל את מיקרוסקופ הלייזר הקונמוקד פתח את תוכנת המיקרוסקופ. להגדיר לייזר עירור ב 488 nm. הגדר את רמת הכוח של 488 לייזר ננומטר ב-0.1 mW. הגדרת גודל הדמיה כ-512 x 512 פיקסלים. הגדרת זמן מרווח של כל פיקסל כ-2.4 μs.
11. שימו את הצלחת עם התאים. אתר את התיבות שנבחרו תחת הדמיה של שדה בהיר של מצלמת CCD.
12. התחל סריקה באמצעות מסגרת בודדת. שמור את תמונות פלורסנט של תאים פוטוגירויים.
13. להזיז את הבמה באופן אקראי כדי לאתר אזורים ללא גירוי לייזר שנייה. התחל סריקה באמצעות מסגרת בודדת. שמור את תמונות פלורסנט ללא תאים גירוי כנתוני בקרה.
כבו את המיקרוסקופ. לאחר הניסוי

5. הפעלת מיטוריסים ואירועים מיטוכונדריאלי אחרים על ידי פוטוגריית אור

הערה: כדי לצפות בדינמיקה מורפולוגית מיטוכונדריאלי, תאי הלה הם מזוהמים ב-Mito-GFP בשלב 5.1 כדי לציין המיטוסקופים. כדי להתבונן מיריסים, תאי הלה הם מזוהמים עם mt-cpYFP בשלב 5.1.

הכינו תאי הלה מזוהמים עם Mito-GFP או mt-cpYFP לאחר שלב 2.
הפעל לייזר משני וודא כי התריס סגור.
תדליק את המיקרוסקופ. לסריקת לייזר להגדיר לייזר עירור ב 488 nm. הגדר את רמת הכוח של 488 לייזר ננומטר ב-0.1 mW. הגדרת גודל הדמיה כ-512 x 512 פיקסלים. הגדר את זמן הדימות הכולל של כל אחת מהמסגרות כ-2.2 s. הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות ב-0 s. הגדרת מסגרות הדמיה כוללת כ-200 מסגרות כדי לספק את המיקרוסקופיה הרציפה של ~ 440 בניסוי פרטני.
הערה: מרווח של שתי מסגרות סמוכות, מסגרות הדמיה מלאה וזמן הדמיה של מיקרוסקופ רציף ניתן לכוונן בהתאם לדרישות הניסוי.
הכינו את מערכת הדגירה של CO₂ כמתואר בשלב 3.3 במידת הצורך.
העברת גירוי לייזר של פטושני לתוך המיטו, היעד באמצעות מודוס
1. קח את המנה המכילה תאים שעברו עם Mito-GFP או mt-cpYFP מן החממה ולשים את הצלחת על הבמה במיקרוסקופ.
2. בדוק את המצב של לייזר פטושני כמו שלב 3.5.2. ודא כי המיקוד של לייזר שנייה ממוקם במרכז FOV. הגדר חץ הפניה במרכז חלון דימות הפלורסנט כדי לציין את מיקום המוקד.
3. הגדר את העוצמה של לייזר השני ב5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) בדגימה. הגדר את שעת הפתיחה של התריס ב 0.05-0.1 s.
4. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור תא יעד הביע היטב Mito-GFP או mt-cpYFP.
5. בחרו מיטוכונמיטו1 בתא היעד כנושא ניסיוני. להעביר את הבמה המיקרוסקופ כדי להתאים את היעד המיועד הכרישים מיטוכונדריאלי במרכז FOV (לציין על ידי חץ ההפניה) במצב סריקה מהירה.
6. לחץ על התחל התחתון כדי להתחיל בהתקדמות הדמיה רציפה של המיקרוסקופיה.
7. פתח את התריס בכל זמן מוגדר מראש כדי לספק את הגירוי לייזר פטושני שתוכנן בשלב 5.5.3 לתוך המבנה מיטוכונדריאלי היעד הכרישים.
  הערה: (1) החשיפה ללייזר השני על מבנה הצינורי היטוכונדריאלי יכולה להיות נשלטת על ידי התריס בכל עת במהלך המיקרוסקופיה הקונפוקלית. (2) לבצע חשיפה לייזר אחת בלבד בלבד בניסוי אחד, משום שגירוי לייזר אחד בלבד עשוי לperturb מעמד מיטוכונדריאלי במשך תקופה ארוכה.
8. המתן עד להשלמת תהליך הדימות. שמור את נתוני ההדמיה לצורך ניתוח נתונים נוסף.
כבו את הלייזר השני, ומיקרוסקופ הקונטומוקד לאחר הניסוי.

6. תנודות של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי על יעד המיטומטר בתאי הלה על-ידי גירוי לייזר באמצעות שליטה בלייזר

הכינו תאי הלה בעקבות השלבים 2.1.1-2.1.6.
דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° צ' לפני הניסוי.
הכינו את הפתרון לצביעת TMRM: מדלל את ה-TMRM ב-1 mL של DMEM עם 10% FBS לריכוז הסופי של 100 ננומטר.
קח את המנה עם התאים המוכנים בשלב 5.2.1 ו5.2.2 מתוך החממה. הסר את מדיום התרבות. הוסף את הפתרון לצביעת TMRM המוכן בשלב 6.3 לתוך המנה. כתם עבור 15-20 דקות ב 37 ° c בחממה. הסר את פתרון ההכתמים. . שטוף את התאים עם הPBS פעם אחת הוסיפו 1 מ ל של תרבות בינונית לתוך המנה.
הפעל לייזר משני וודא כי התריס סגור.
תדליק את המיקרוסקופ. לסריקת לייזר פתח את תוכנת המיקרוסקופ. להגדיר לייזר עירור ב 532 nm. הגדר את רמת הכוח של 532 לייזר ננומטר ב-0.1 mW. הגדרת גודל הדמיה כ-512 x 512 פיקסלים וזמן יצירת מסגרת ב-2.2 s. הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות ב-0 s. הגדרת מסגרות דימות כולל 200 כמסגרות שאינן מהוות מסגרות הכוללות שיפור מערכת העיבוד של 440 ~ המיקרוסקופיה בניסוי פרטני.
הערה: מרווח של שתי מסגרות סמוכות, מסגרות הדמיה מלאה וזמן הדמיה של מיקרוסקופ רציף ניתן לכוונן בהתאם לדרישות הניסוי.
הכינו את מערכת הדגירה של CO₂ המתוארת בשלב 3.3 במידת הצורך.
השתמש במצב לספק לייזר לגירוי בלייזר השני לתוך המיטוזים היעד. בצע את השלבים 5.5.1-5.5.8 כדי להשלים את הניסוי.
הערה: בשלב 6.8, בחר המיטו, שבו הוא מוכתם היטב עם TMRM כמו המיטו, היעד.
כבו את הלייזר השני, ומיקרוסקופ הקונטומוקד לאחר הניסוי.

7. שינויים של Bax ו ציטוכרום C על המיטוזים היעד בתאי הלה על ידי הגירוי לייזר פטושני בלייזר

הערה: בניסוי זה, הזרע את התאים בצלחות פטרי עם רשתות מיקום התא (איור 3B) כדי להתאים את התא אשר מטופל על ידי לייזר משני. כתם את התאים עם TMRM כדי להתאים את המיטו, אשר נבחר להיות מגורה על ידי לייזר משני.

הכינו תאי הלה בצלחת פטרי עם רשתות מיקום תאים (איור 3B) כמתואר בשלב 4.1.
הכתם את התאים עם TMRM כמתואר בשלבים 6.3 ו 6.4.
הפעל לייזר משני וודא כי התריס סגור.
תדליק את המיקרוסקופ. לסריקת לייזר פתח את תוכנת המיקרוסקופ. להגדיר לייזר עירור ב 532 nm. הגדר את רמת הכוח של 532 לייזר ננומטר ב-0.1 mW. הגדרת גודל הדמיה כ-512 x 512 פיקסלים וזמן יצירת מסגרת ב-2.2 s. הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות ב-0 s. הגדרת מסגרות דימות כולל 50 כמסגרות שאינן מהוות מסגרות הכוללות שיפור מערכת העיבוד של 110 ~ המיקרוסקופיה בניסוי פרטני.
העברת גירוי לייזר של פטושני לתוך המיטו, היעד באמצעות מודוס
1. הגדר את העוצמה של לייזר השני ב5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) בדגימה. הגדר את שעת הפתיחה של התריס ב 0.05-0.1 s.
2. קח את המנה המכילה תאים מוכתם מתוך החממה ולשים את הצלחת על הבמה במיקרוסקופ.
3. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור את תא היעד אשר מוכתם היטב עם TMRM.
4. להזיז את הבמה על מנת להתאים את היעד המרכזי מיטוכונדריאלי המטרה במרכז FOV באמצעות מצב סריקה מהירה. סמן את קואורדינטת הרשת שהתא הנבחר ממוקם תחת דימות של שדה בהיר.
5. לחץ על התחל התחתון כדי להתחיל בהתקדמות הדמיה רציפה של המיקרוסקופיה.
6. פתח את התריס בכל זמן מוגדר מראש של התקדמות הדמיה מיקרוסקופית באופן ידני כדי לספק את הגירוי לייזר הפטושני שתוכנן בשלב 7.5.1 לתוך המבנה מיטוכונדריאלי היעד הכרישים.
7. המתן עד להשלמת תהליך הדימות. סמן את המיטוייזרים שנבחרו אשר מדומה על ידי לייזר משני. שמור את נתוני ההדמיה לצורך ניתוח נתונים נוסף.
8. כבו את הלייזר השני, ומיקרוסקופ הקונטומוקד לאחר הניסוי. הכינו את המיקרוסקופיה החיסונית של Bax או ציטוכרום C על תאי הניסוי.
מיקרוסקופ אימונולובורנציה של Bax או ציטוכרום C בסרגל ה לייזר פטושני מיטו, מטופלים.
1. קח את המנה. משלב המיקרוסקופ
2. להשלים את הטיפול האימונוoforx או ציטוכרום C בצע את השלבים 4.7.1-4.7.9.
  הערה: השתמש anti-Bax או anti-ציטוכרום C במקום anti-eIF4E בשלב 4.7.5 כדי לסיים את כתמים אימונוoforc של Bax או ציטוכרום ג בשלב 7.6.2.
3. הפעל את מיקרוסקופ קונפוקלית וקד של סריקת לייזר ופתח את תוכנת המיקרוסקופ. להגדיר לייזר עירור ב 488 nm ו 532 nm. הגדר את רמת הכוח של 488 ננומטר ו 532 לייזר nm ב 0.1 mW. הגדרת גודל הדמיה כ512 x 512 פיקסלים וזמן יצירת מסגרת ב 2.2 s.
4. שימו את הצלחת עם התאים. אתר את הרשת שנבחרה תחת הדמיה של שדה בהיר של מצלמת ה-CCD. אתר את התא אשר מטופל על ידי לייזר משני שניות.
5. התחל סריקה באמצעות מסגרת בודדת. אתר את המיטו, אשר מגורה על-ידי לייזר שנייה. שמור את תמונת הפלורסנט של תא פוטוסטימולציה לניתוח נתונים נוסף.
כבו את המיקרוסקופ. לאחר הניסוי

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן לבצע את הגירוי בו יחד עם מיקרוסקופ מתמשך של סריקת קונסקופיה. הגירוי יכול להתחיל בכל חריץ זמן מוגדר מראש ברצף מיקרוסקופיה מיקוד הזמן. המיקרוסקופיה הקונפוקלית יכולה לפקח על מולקולות סלולריות על ידי דימות פלורסנט. בדרך זו ניתן לזהות את התגובות המולקולריות לגירויים ולדינמיקות אחרות. באופן תיאורטי, אם היא מופעלת, זה יהיה מעבר זרחתית מהציטופלסמה לתא הגרעין²⁷. הגורל התא הספציפי יכול להיות מוסדר על ידי דפוסים מסוימים של זה אות הטיפשה²⁸. במחקרים שנעשו לאחרונה, אפנון אופטי המבוסס על אלקטרואופטיקה סיפקה שליטה מדויקת גבוהה של האות הטיפשה במשך ובגודל וגילה כי מודאג השידור אות שידור דינמיקה כוננים התפשטות פסולה בתאי סרטן⁷^, ^שמונה. כאן, אנו להדגים את הטרנסלוקציה ERK2 לתוך הגרעין לאחר לטפל בתא עם הבזק קצר של לייזר שנייה של השני באמצעות שיטה המוצגת בפרוטוקול זה. כפי שמוצג באיור 5A, ERK2-gfp הזריחה מגיע למקסימום לאחר כמה דקות של הדמיית לייזר שנייה. מולקולות ERK2 יהיה deated לאחר הפעלת מצעים המטה בגרעין, ולאחר מכן ERK2 חוזר הציטופלסמה המצוין על ידי הפחתת הקרינה הגרעינית GFP. ניתן להפעיל ERK2 במשך מספר פעמים על-ידי מספר רב של אוספים (איור 5B). לכן, הוא מסוגל לתמרן את דפוס האות ERK2 בדיוק על ידי שליטה זמן מרווח בין גירויים מרובים. בנוסף, ERK2 יכול להיות מופעל בתאים סמוכים סביב התא מגורה מדי פעם (איור 5C). התבוננות זו מצביעה על כך שכמה מולקולות העשויות להיות משוחררות על ידי התא המטופל בלייזר ששני להפעיל ERK2 בתאים הסמוכים. זירחון של ERK2 במורד חלבון eIF4E יכול להיות מאושר ודמיינו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence (איור 5D). תוצאה זו מצביעה על כך שגירוי לייזר בצורה נשית, יכול בהצלחה להפעיל את מסלול איתות של טיפשה. תוצאות מפורטות יותר הן וואנג S., ואח '²².

גלי חמצון מיטוכונדריאלי (מיריסים) הם צרורות חמצוני ב המיטו, כי השורש של דינמיקה מולקולרית מיטוכונדריאלי מורכב. במהלך העשור האחרון, mitoflashes לקות הבינו להיות אירוע איתות הבסיסי ולקחת חלק חשוב בפונקציות תא חטאיו²⁹^,³⁰^,³¹. באופן מסורתי, mitoflashes הם נצפו בדרך כלל במקרה כאשר מטפלים בתאים עם כימיקלים כדי לספק לחץ עקיף כדי המיטומטר²⁹^,³⁰. על-ידי יישום זה מערכת גירוי תמונה, אנו משיגים באופן שאפשר לשליטה ומדויקת כדי להלהיב מיריסים ברמת מיטוכונדריאלי יחיד הכרישים. הריגוש המוצלח ביותר מוצג באיור 6A. מעניין, את המאפיינים של מיריסים כגון שיא הדופק, רוחב ומשכי תגובה³² הם קשורים הקשר הדוק לכוח לייזר לנשים השני. ניתוח כמותי מפורט יותר של מיריסים מתרגש על ידי גירוי לייזר פטושני הוא ב וואנג S, ואח '.³². זה מקרין פוטומניפולציה מראה גם זנים של דינמיקה מולקולרית מיטוכונדריאלי, כולל פיצול ושחזור של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי (איור 6B), ותנודות של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ( איור 6C). בדומה מיריסים המופעל על-ידי תמונות, אירועים אלה יש ביצועים שונים עם עוצמות כוח שונים של הגירוי. הוא שונה מהפעלה של מסלול איתות טיפשה. ההשפעה של לייזר בפטושני היא מוגבלת מאוד על צינור מיטוכונדריאלי אחד. תוצאות מפורטות יותר הן וואנג Y., ואח '. ²⁴ ו-Shi F., ואח '. . ^{עשרים וחמש}

איור 1: ערכת הפוטוגירוי שהוקמה על צימוד לייזר מפשני במיקרוסקופ. (א) שבילים אופטיים של (ב) מערכת הדמיה והדמייה ממוחשבת. הלייזר השני הוא בשלב הראשון מפוצל על ידי מפצל 50/50 קרן לשתי קורות. התמסורת מורחבת על ידי טלסקופ ממסר ולאחר מכן משתקף לתוך המטרה כדי ליצור מהפך. קרן ההשתקפות מיושרת דרך מערכת סריקת המיקרוסקופ כדי ליצור את הרשת. מצלמת CCD משמש כדי לספק דימות בהיר-felid כדי לפקח על התאים ומיקוד של לייזר בצורת שנייה במצב. מיקוד קבוע במרכז FOV; מסגרת סריקה מיוחדת באזור מעוצב מראש. מיט = דיקרואיק mirror, BS = מפצל קרן, RM = מראה רפלקטיבי. אורך הגל של לייזר סריקה קונפוקלית וקד הוא 488 nm/532 nm/635 nm, ואת מרווח האוסף טיפוסי אורך הגל של פלואורסצנטית הוא < 560 nm/560-625 ננומטר/> 625 nm. סיבים לייזר השני (1,040 nm, 120 fs, 50 MHz, 1 W) ניתן להחליף על ידי Ti = לייזר ספיר (810 nm, 80 MHz, 65 fs, 1 W) או אחרים מסחרי לייזר משני הלייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: במצב של פלאז-א, הלוקליזציה והגודל של מיקוד לייזר ממוקד בלייזר בתוך תא היעד במישור הדמיה מוקד תחת הדמיה בהירה-felid. (א) לייזר פטושני נחסם על ידי התריס. (ב) לייזר פטושני מופעל. חץ: חץ ההפניה מוגדר במרכז FOV כדי לוודא כי מוקד הלייזר השני מאתר את המיקום הנכון. סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צלחת פטרי המשמשת לעיבוד תאים, העברה וניסויים בפוטוגריית עור. (א) צלחת פטרי 35 mm עם קוטר 15 מ"מ ו 0.17 מ"מ עובי זכוכית תחתית. (ב) 35 מ"מ צלחת פטרי עם תחתית זכוכית ו הוטבע 500 יקרומטר תא מיקום הרשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מערכת הדגירה של CO₂ . (א) בשלב החממה של CO₂ ו-(ב) לוח הבקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: צילום הפעלה של טיפשה באמצעות מודוס. (A) צילום יחיד גירוי (1,040 nm, 40 mW, 0.1 s) גורמת ERK2-gfp טרנסלוקציה לתוך הגרעין ולאחר מכן חזרה cytoplasm. (ב) ERK2 אות דפוס בתיווך על ידי חשיפה לייזר בודדת בלייזר (החץ האדום, 1,040 nm, 40 mW, 0.1 s) ו two מגירוי (חצים ירוקים, 810 ננומטר, 30 mW, 0.1 s). (ג) הפעלה טיפשה בתאים שמסביב על ידי החשיפה לייזר קצר בלבד בלייזר בתאי היעד (חץ לבן, 810 nm, 24 mW, 0.2 s). (ד) הimmunofluorescence של EIF4E-P מראה עלייה משמעותית 24 שעות אחרי photoסימולציית יחיד (810 nm, 25 mW, 0.2 s). סרגל קנה מידה = 10 יקרומטר (A) ו-20 יקרומטר (B, C). הזריחה של ERK2-GFP ו-eIF4E-P מתרגש על ידי לייזר עירור 488 ננומטר ונאסף ב < 560 ננומטר ערוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: המיטו, אירועים מרובים המושרה על ידי פוטוגריית מתחת למצב של "היכל הקיטור". (א) הריגוש של מיטללש על מיטוכונדריאלי מגורה על ידי גירוי יחיד (810 nm, 16 mW, 0.1 s). (ב) המיטו, פיצול מורפולוגית ושחזור הנגרמת על ידי גירוי בודד (1,040 nm, 30 mW, 0.1 s). (ג) תנודות בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי על ידי גירוי לייזר בודד באמצעות השני (1040 ננומטר, 20 mW, 0.1 s). חיצים ב (א) (ב) ו-(ג) מציינים את מיקום הגירוי בתמונות. סרגל קנה מידה = 10 μm. הזריחה של Mito-GFP או mt-cpYFP הוא נרגש על ידי 488 לייזר עירור ננומטר ונאסף ב < 560 ננומטר ערוץ. הזריחה של TMRM מתרגשת על ידי לייזר עירור 532 ננומטר ונאסף בערוץ 560-625 nm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

	0.05 ס	0.1 ס	0.2 ס	0.5 ס
810 nm, 65 fs, 80 MHz	20-65 mW	10-60 mW	5-50 mW	5-40 mW
1040 nm, 120 fs, 50 MHz	30-100 mW	20-80 mW	15-70 mW	10-60 mW

טבלה 1: משך הגירוי המומלץ והעוצמה הממוצעת של לייזר הפטושני במצב "מתחת".

	0.05 ס	0.1 ס	0.2 ס	0.5 ס
810 nm, 65 fs, 80 MHz	25-40 mW	20-30 mW	15-25 mW	10-25 mW
1040 nm, 120 fs, 50 MHz	40-60 mW	30-50 mW	25-40 mW	20-30 mW

טבלה 2: משך הגירוי המומלץ והכוח הממוצע של לייזר התלת-שנייה במצב "היכל הקיטור" ב-2 x 2-3 x 3 יקרומטר מיכל השני . בתא

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מדגימים אסטרטגיה פוטוסטימולציה על ידי שילוב לייזר משני השניים באמצעות סריקת לייזר ומערכת מיקרוסקופ קונטוטרציה. הגירוי יכול לעבוד ישירות כמיקרוסקופיה של שני הפוטונים על ידי הגדרת "היכל הקיטור" בהתאם. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניצול הבזק קצר של לייזר הפטושני להפעיל איתות של טיפשה או מיטוריסים בתאי היעד. ניתן לבצע את מצבי הגירוי השונים בהתאם למטרות ומערכות נסיוניות שונות. ניתן להגדיר בקלות את האתר מבוסס על מיקרוסקופ קונמוקד. הלייזר השני יכול להיות ממוקד ברמת הגבלת עקיפה במרכז FOV. היעד התת-סלולרי צריך להיות מועבר לתנוחת המוקד לייזר של הלייזר באופן ידני והוא יכול להיות מגורה למשך שרירותי, עצמאי לחלוטין ממיקרוסקופ קונפוקלית. לכן, גן-ההגנה יכול להגן על המדגם שנמצא מחוץ לאזור המיקוד בצורה מושלמת והוא מתאים לגירויים ארוכים במשך זמן רב. ניתן להגדיר מראש את אזור הגירוי של "האזור הטוב ביותר" של המרכז. ניתן לבצע אותו באופן אוטומטי. אך משך הגירוי וזמן החשיפה יכולים רק לעקוב אחר הסריקה הקונפוקלית. לאחר הגדרת זמן ההתעכב של כל פיקסל וגודל המסגרת הכולל, משך הגירוי במסגרת מיקרוסקופית אחת מתוקן למעשה. ניתן גם לבצע את הגירוי בתמונה מסגרת מעת לעת. זה יכול לשמש גם כדי להפעיל פוטוסנסיטינים וחלבונים אלקטרואופטיקה שדורש פחות משך חשיפה אבל שטח גדול.

שיקול ביקורתי בפרוטוקול זה הוא כיצד לקבוע את הפרמטרים של גירוי לייזר לנשים שניות. על פי המחקרים הקודמים שלנו, הפעילות המולקולרית התאית נגרמת בעיקרעל ידי מולטיפוטון מרובה^,²¹,²²^,²³^,²⁴,²⁵. בדרך כלל מולטיפוטון יעילות מרובת פעולה קשורה עם כל הפרמטרים לייזר השני של הלייזר, כולל אורך הגל, רוחב הדופק, קצב חזרה. התגובה התאית קשורה עוד יותר עם כוח הלייזר, מיקום הגירוי/אזור, ואת משך החשיפה בו זמנית. בעיקרון, יעילות הגירוי מתנגשת עם בטיחות התא. גירוי התמונה חזק יותר כגון כוח ממוצע גבוה יותר, משך גירוי ארוך יותר האירוע הכולל אנרגיה לייזר תורמת ליעילות גירוי גבוהה יותר אך מביא סיכונים גבוהים יותר של נזק לתאים. מאחר שפרמטרים אלה יחסיים גם זה לזה, וכולם תורמים לאפקט הגירוי והנזק, אי אפשר להשתמש בפרמטר אחד בלבד, כמו באנרגיה הכוללת לייזר, או בכוח הממוצע של הלייזר, כדי להגדיר שהוא בטוח או לא. בהתחשב הן יעילות הפעלת אות ובטיחות התא, כאן, אנו מספקים כוח ממוצע מומלץ ומשך הגירוי של שני מקור לייזר השני לצורך התייחסות בטבלה 1 ובטבלה 2. חוץ מזה, יש לשנות את הפרמטרים של גירוי הלייזר השני בהתאם למערכת האופטית הממשית ולדוגמה הביולוגית.

על פי הדיונים לעיל, אנו מתכוונים להציג טווחים יעילים יותר מפורט של פרמטרים פוטוגירויים. ניתן לשנות את אורך הגל של לייזר משני השניים ברכס ניר המשמש לגירוי בתמונה. רוחב הפולס צריך להיות קצר כדי לספק כוח שיא גבוה ויעילות גבוהה לינארית exaction. משך פעימה ארוך אינו מומלץ עבור פרוטוקול זה. בדרך כלל, רוחב הפולס אופייני לשני הפוטונים (< 200 fs) הוא הבחירה הנכונה. קצב החזרה של הלייזר אינו גורם מפתח. קצב החזרה של עד MHz מתאים לפרוטוקול זה. הגורם הקריטי ביותר לתגובות מולקולריות הסלולר הוא כוח הלייזר ומשך הגירוי של הלייזר השני. עבור הפעלת טיפשה, על פי העבודה הקודמת שלנו²², הכוח הממוצע ב 15 mW (810 nm) או 20 mw (1,040 nm) ואת משך החשיפה ב 0.2 s הם מספיק כדי לספק גירוי מספיק כדי להפעיל איתות טיפשה תוך שמירה על יכולת הכדאיות של התא באולטרסאונד . תאי הלה להיפך, הכוח הממוצע מעל 80 mW (810 nm) או 120 mW (1,040 nm) ומשך החשיפה יותר מ 1 s יכול לגרום נזק בלתי הפיך לתאים. המיטו, הם בדרך כלל רגישים יותר לפוטוגריית. גירוי עם כוח ממוצע גבוה יותר מ 40 mW (810 nm) או 80 mW (1,040 nm) ואת משך החשיפה על פני ה0.2 s עשוי לגרום נזק משמעותי כמו פיצול בלתי הפיך ב מיטוכונמיטוציה או אפילו בכל המיטוסים על פני התא כולו. יש לציין כי הרגישות של המיטוציה כדי פוטוגירוי משתנה הרבה סוגי תאים שונים. לדוגמה, בתאי הלה, כוח הלייזר צריך רק סביב 6 mW (810 ננומטר, 0.1 s משך). כל המיטוa יכול להגיב על הגירוי בצורה של פיצול, המיריסים, ו-MP תנודות. אבל בתאי גזע אנושיים mesenchymal, הכוח צריך להיות מוגבר סביב 15 mW (810 ננומטר, 0.1 s משך), ועדיין בסביבות חצי המיטו, מראה לא תגובה פוטוגריית. במצב-B, גורם נוסף עלול להשפיע על יעילות הפעלת התמונה ונזק לתאים הוא אזור הגירוי. גירוי התמונה עלול לגרום נזק לתאים על-ידי אספקת באזור גירוי קטן. אבל גירוי זהה עלול להיכשל להפעיל את האישה הטיפשה על ידי אספקת באזור גירוי גדול יותר. אנו ממליצים כי האזור גירוי בתא היעד הוא סביב 2 x 2-3 x 3 יקרומטר² ואינו עולה על 25 יקרומטר².

ההתאמה של אזור הגירוי חשובה גם להחלת פרוטוקול זה. על פי עבודות קודמות¹⁷^,²², הגירוי באזור זה יכול לרוקן את Ca^{2 +} החנות ב ER ביעילות ולהפעיל את ערוץ crac. לאחר מכן, Ca^{2 +} זרם יכול להפעיל את מסלול איתות של טיפשה לאחר מכן. לכן, אנו ממליצים לספק את הפוטוגירוי על האזור ER בתאי הלה כדי להשיג יעילות הפעלה גבוהה של טיפשה. אזור ER ניתן להבדיל בקלות מציטופלסמה או הגרעין תחת מיקרוסקופ שדה בהיר על ידי מטרה ניגודיות פאזה. על מנת להציג אירועים מיטוכונדריאלי איתות, המוקד של לייזר השני בקלות יכול להיות רכוב על מבנה מיטוכונדריאלי נבחר בעקבות ההליכים הקשורים.

גירוי שיטות המתוארות בפרוטוקול זה הם גם יכולים לשמש כדי להשפיע על אירועים אחרים מרובים סלולריים כגון גרימת Ca^{2 +} ו רוס אותות¹⁷^,²⁰^,²¹. יש לציין שכל העבודות הקודמות סיפקו את הערכת בטיחות התא לאחר פוטוגירוי. לדוגמה, שינויים מורפולוגיים משמעותיים של תאים, מבעבע, פיצול מיטוכונדריאלי ונפיחות של התא כולו, ירידה שיעור התפשטות של תאים, וכמה שינויים יוצאי דופן אחרים של הזריחה במהלך המיקרוסקופיה הכול רומז גבוה . פגיעה בתאים זה צריך להיות מאוד זהיר כדי לפקח על מצב התא. עם זאת, עם שליטה מרבית על הפרמטרים של לייזר והגירוי, הכדאיות התאית יכולה להישמר ברמה גבוהה מאוד בו זמנית עם יעילות גבוהה של גירוי. מכאן, זו שיטת צילום מגירוי של הלייזר השני הוא בעל פוטנציאל טוב להרחיב עוד אזורים ויישם יישומים רלוונטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

העבודה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81571719 ו 81661168014, 81673014, ו 81870055), שנגחאי העיר המדע והטכנולוגיה הוועדה (18QA1402300 ו 16XD1403100), והמפתח הלאומי R & D תוכנית (2017YFA0104600).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus
Femtosecond laser	Fianium
CO₂ incubation system	Olympus	MIU-IBC
Petri dish	NEST	801002
Petri dish with imprinted grid	Ibidi	81148
ERK-GFP	addgene	37145	A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP			A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP	Invitrogen	C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM)	Invitrogen	T668	Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	9002-98-6	Dilute in PBS
Paraformaldehyde	Solarbio	P8430	Dilute in PBS
Triton X-100	Solarbio	T8200	Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Dilute in PBS
Tween20	Sigma-Aldrich	9005-64-5
anti-eIF4E antibody	abcam	ab76256
anti-Bax antibody	abcam	ab53154
anti-cytochrome C antibody	abcam	ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488)	abcam	ab150077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Biology

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.