Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Foto stimulation af Femtosecond laser aktiverer ekstracellulær-signal-reguleret kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hændelser i målcellerne

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

Stramt fokuseret at laser kan levere præcis stimulation til celler ved at blive koblet til en Konfokal mikroskopi muliggør real-time observation og foto stimulation. Foto stimulation kan aktivere celle molekylære hændelser, herunder ERK signalering pathway og mitokondrie blinker af reaktive oxygenarter.

Abstract

Direkte kontrol af cellulære definerede molekylære begivenheder er vigtig for Life Science. For nylig, undersøgelser har vist, at at laser stimulation kan samtidig aktivere flere cellulære molekylære signalering veje. I denne protokol viser vi, at ved at koble at laser ind i et Konfokal mikroskop, kan cellerne stimuleres netop af den stramt fokuserede laser. Nogle molekylære processer, der kan observeres samtidigt, aktiveres efterfølgende. Vi præsenterer detaljerede protokoller af foto stimulation for at aktivere ekstracellulær signal reguleret kinase (ERK) signalering pathway i Hela celler. Mitokondrie blinker af reaktive oxygenarter (ros) og andre mitokondrielle begivenheder kan også stimuleres, hvis fokusere at laser puls på en bestemt mitokondrie rørformede struktur. Denne protokol omfatter forbehandling af celler før foto stimulation, levering af foto stimulation af en at laser flash på målet, og observere/identificere molekylære ændringer bagefter. Denne protokol repræsenterer et alt optisk værktøj til beslægtede biologiske undersøgelser.

Introduction

Teknologien til at kontrollere cellulære signalering molekyler er en vigtig del af udviklingen af Life Science. Traditionelt er den mest almindeligt anvendte metode biokemisk behandling af narkotika eller biologiske materialer1,2,3. I løbet af det seneste årti, opfindelsen af optogenetics åbner en ny æra for cellulære molekylære signal modulation. Transfection med lysfølsomme proteiner fra genteknologi gør lys blive et kraftfuldt værktøj til at moduere forskellige protein aktiviteter i målcellen. Denne teknologi har gjort opmuntrende fremskridt såsom excitation og hæmning af neurale signal, fremme genekspression, manipulere cellulære signal mønstre, førende forskellige celle skæbner og patologisk undersøgelse4,5 ,6,7,8,9. Men, lys kan kun fungere ved transfficerende celler med optogenetiske proteiner. I den nuværende fase, der findes sjældne metoder, der giver lys til at kontrollere cellulære molekyler direkte udover optogenetics.

Femtosecond laser har avancerede biologiske forsker ved at give effektiv multiphoton excitation samtidig bevare god biologisk sikkerhed. Ved at implementere forskellige foto behandling strategier, det har indset talrige resultater såsom multiphoton mikroskopi, mikrokirurgi og multiphoton optogenetiske applikationer10,11,12,13 ,14,15,16. Nylige undersøgelser viser, at at laser stimulation er blevet demonstreret som en yderst effektiv optisk metode til direkte fremkalde molekylære signalering begivenheder. Det er blevet konstateret, at stramt fokuseret at laser bestråling på endoplasmatiske reticulum (er) er i stand til at nedbryder calcium i er og aktivere calcium-Release-aktiverede calcium (CRAC) kanaler til dannelse af calcium signaler i cellerne17. Dette foto-aktiverede calcium signal kan sprede sig mellem flere typer af celler18,19,20. Desuden, det har også evnen til at aktivere celle signalering veje såsom nuklear faktor af aktiverede T-celler (nfat) og Erk signalering pathway21,22. Ved at justere intensiteten og lokalisering af at laser eksponering i celler, for eksempel, fokusere laseren på mitokondrier, det kan påvirke mitokondrie morfologi og molekylære begivenheder23,24, 25. specifikt, byger af MITOKONDRIE ros generation kan blive ophidset af foto stimulation, som er bemærket som fluorescerende blinker i mitokondrier (mitoflashes).

Derfor, den foto stimulation teknologi er et godt potentiale til at blive bredt anvendt i beslægtede biologiske forskning. Det er også en god chance for at forlænge at laser applikationer i kontrol af cellulære signalering molekyler og funktioner foruden mikroskopi. Her giver vi de tekniske detaljer om foto stimulation. Foto stimulation opnås ved at koble en at-laser til et Konfokal mikroskop for at give en enkelt målcelle med en kort flash-foto stimulation. Det kan indlede effektiv og kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Hvis foto stimulation er placeret på mitokondrie rørformede struktur, mitokondrie membran potentiale, morfologi, ROS, og permeabilitet overgang porer, kan alle styres af foto stimulation. Baseret på denne foto stimulerings ordning giver vi en detaljeret metode til aktivering af ERK signalering pathway og påvirkning af flere mitokondrielle hændelser i Hela-cellerne. Denne protokol belyser processen med at levere at laser stimulation i målcellerne.

Foto stimulations systemet er etableret på et Konfokal mikroskop med en at laser kobling i det til simultan stimulation og kontinuerlig mikroskopi. At laser (bølgelængde: 1.040 nm, gentagelse sats: 50 MHz, pulsbredde: 120 FS, maksimal output gennemsnitlig effekt: 1 W) er opdelt i to bjælker før kobling. Den ene styres gennem et relæ teleskop bestående af et par linser. Det afspejles derefter direkte i bagsiden af et mål (60x, N.A. = 1,2, vand nedsænkning) at danne en diffraktion-Limit fokus (STIM-A). Den anden afspejles i den optiske scanning af confokale mikroskop til at fungere som en to-foton scanningstilstand (STIM-B). STIM-A præsenterer et fast fokuspunkt i midten af synsfeltet (FOV). STIM-B er et præ-designet partielt Konfokal scanningsområde i FOV. STIM-A og STIM-B er vist i figur 1a. Et CCD-kamera under koldtlysreflektorlamper Mirror (DM) giver lys-felt Imaging til overvågning af fokus for at laser.

Der er nogle afgørende væsentlige for følgende eksperimenter. I denne protokol, en at fiber laser kilde (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) bruges som et eksempel. I praksis kan de fleste kommercielle at oscillatorer anvendes, så længe puls bredden er kortere end 200 FS, og spidseffekt tætheden bør være over niveauet 1011 ~ 1012 W/cm2. For eksempel, en ti: safir laser normalt anvendes til multiphoton mikroskopi er i stand til at erstatte at laser viste i figur 1b. Laseren magt og nogle andre foto stimulation parametre skal justeres, fordi de optiske parametre (pulsbredde, bølgelængde, og gentagelse sats) varierer meget i forskellige at lasere, der dermed fremkalde forskellige multiphoton excitation effektivitetsgevinster.

Sammen med at laser stimulation, den konfokale mikroskopi giver kontinuerlig celle Imaging til at overvåge molekylære dynamik i realtid i både STIM-A og STIM-B modes. Begge foto stimuleringsordninger (STIM-A og STIM-B) styres af en mekanisk lukker med en millisekund opløsning (figur 1).

I STIM-A-tilstand er positionen for laser fokus fastgjort i midten af FOV. Et relæ teleskop bruges til at sikre fokus for at laser til at være placeret på confokale Imaging plane ved tuning afstanden mellem to linser i den lodrette retning (laser formering retning, lodret til confokale Imaging plane, som vist i Figur 1). Ved den lyse-Field Imaging af CCD-kamera, kan diameteren af laser fokus måles (~ 2 μm, figur 2b). Stimulations varigheder og eksponeringstider styres af en udløser under Konfokal billeddannelses processen.

I STIM-B-tilstand kan stimulerings området på forhånd tildeles manuelt i konfokale Imaging-styringssoftwaren til enhver form som linje, polygon eller cirkel. Udløseren synkroniseres med Konfokal scanningsprocessen. Det åbner på forhånd designet tid, som er sat gennem konfokale Imaging kontrollerende software. Derefter, stimulerings området scannes af at laser som Konfokal mikroskopi. Således, prøven er kun stimuleret af at laser når confokal scanning proces indtaster en given Imaging ramme.

Foto stimulations systemet kan etableres på både inverterede og opretstående metallurgiske mikroskoper i henhold til forsøgspersonerne. In vitro-celler, der dyrkes i Petri skåle er bedre at arbejde med inverterede mikroskoper. Dyr, især hjerner af levende dyr, er mere velegnede med opretstående mikroskoper. I denne undersøgelse tager vi det omvendte mikroskop som et eksempel. Det skal bemærkes, at dækslet af Petri skålen ikke åbnes under hele eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Protokollen præsenteret nedenfor indebærer brug af NIR at laser og giftige kemikalier. Vær opmærksom på alle mulige skader induceret af eksperiment procedurer. Læs sikkerhedsdatabladene for alle relevante kemikalier eller andre materialer inden brug. Følg sikkerhedsanvisningerne fra laser faciliteterne, eller Konsultér fagfolk for vejledning, før du betjener laserkilden.

1. eksperimentel forberedelse

  1. Opsætning af foto stimulerings systemet
    Bemærk: Systemet består af en at laser og en laser (på synligt område for fluorescens excitation) scanning confokale mikroskop. I figur 1anvendes en fiber at laser (1.040 nm, 50 MHz, 120 FS, 1 W) til kobling. Parametrene er ikke faste eller nødvendige. Det kan erstattes af en ti: Sapphire laser eller andre kommercielle at oscillatorer i NIR rækkevidde.
    1. Tune på at laser og confokale mikroskop.
      Bemærk: Sæt venligst at laser effekt på et lavt niveau (~ 50 MW) i processen med at justere den optiske vej.
    2. Brug reflekterende spejle (RM1 og RM2 vist i figur 1b) til direkte at laserstråle gennem en mekanisk udløser. Åbn udløseren.
    3. Indstil en 50/50 Beam splitter (BS, figur 1b) til at opdele at laserstrålen i to separate bjælker (transmissions stråle og refleksions stråle). Styre RM2 og BS at gøre at laserstråle sammenfaldende med scanningen laserstråle.
      Bemærk: (1) en reference iris (Iris 1, figur 1b) bag det lange pass koldtlysreflektorlamper spejl (DM, 700 nm cut-on bølgelængde, figur 1b) bruges til positionering scanning laser Path. (2) systemet kan kun fungere i henholdsvis STIM-A-eller STIM-B-modus. For STIM-A-tilstand kan BS fjernes. For STIM-B kan BS udskiftes med en RM.
    4. Sæt et relæ teleskop bestående af et par linser til at udvide transmissions strålen bredde, som er sammensat med bagsiden blænde af målet.
      Bemærk: (1) Referencen iris 2 og 3 (figur 1b) er indstillet til at collimere den femtosekunders laserstråle (figur 1b). (2) forstørrelsen af relæ teleskopet afhænger af den oprindelige diameter af at laserstråle og diameteren af bagsiden blænde af målet.
    5. Steer RMs (RM 3-5, figur 1b) for at tilpasse den ekspanderede stråle til mikroskop. Styre RM 4 og RM 5 for at tune fokus på at laser til centrum af FOV.
    6. Mål transmissionseffektiviteten af målet for at laseren.
      Bemærk: Mål laser kraften på henholdsvis STIM-A og STIM-B på grund af laserens forskellige indtrængnings veje i disse to tilstande. Det vil bruge Power på prøve til at illustrere relaterede eksperiment procedurer nedenfor.
    7. Tune off lukkeren, at laser og confokale mikroskop indtil eksperimenter starter.
      Bemærk: I de følgende eksperimenter arbejder STIM-A og STIM-B ikke sammen. Hvis du bruger STIM-A, skal den femtoanden laserstråle af STIM-B blokeres. På den anden side skal STIM-A-strålen blokeres, hvis systemet arbejder hos STIM-B mode.
  2. Forbered kulturmediet: Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) High glukose med 10% føtal bovint serum (FBS).
  3. Forbered ERK2-GFP DNA plasmid, Mito-GFP DNA plasmid og mitokondrie matrix-målretning cirkulært permuteret gult fluorescerende protein (MT-cpYFP) DNA plasmid. Plasmiderne skal opbevares ved-20 °C, indtil de anvendes.
  4. Forbered tetramethylrhodamin (TMRM, 100 μM) og polyethylenimin (PEI 1 mg/mL). Opbevar dem ved-20 °C indtil brug.
  5. Forbered 5% PARAFORMALDEHYD, 0,5% Triton X-100, anti-eIF4E (eukaryotic Translation Initierings faktor 4E), antistof (phosphor S209, 1 mg/mL), antistof (1 mg/ml), anti-cytochrom C antistof (1 mg/mL), sekundært antistof (anti-kanin IgG H & L, Alexa fluor 488, 1 mg/mL) og 1% BSA med 0,1% Tween20. Reagenserne opbevares ved 4 °C, indtil de anvendes.
  6. Forbered sterile materialer: cellekultur flasker, Petri skåle med glas rutsjebane bund (figur 3a), tallerkener med en glasbund, et trykt 500 μm celle placerings gitter (figur 3b, for at lokalisere de foto stimulerede celler), 1,5 ml og 10 ml rør og 1 mL, 100 μL og 10 μL pipetter og spidser.
  7. Forbered standard cellekultur laboratorieudstyr: en cellekultur inkubator sat til 5% CO2 og 37 °c, og en biologisk sikkerhed kabinet.

2. cellekultur og Transfection

Bemærk: Hela Cell (cellelinje afledt af livmoderhalskræft celler taget februar 8, 1951 fra Henrietta mangler)26 bruges som et eksempel i denne protokol.

  1. Celle passage
    1. Fjern kulturmediet fra cellekultur flasken, der indeholder nok celler.
    2. Flasken vaskes med 2 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS). Fjern PBS.
    3. Tilsæt 1 mL trypsin langsomt, og Tap flasken lidt. Sæt flasken tilbage i inkubator og Inkubér cellerne 3 min ved 37 °C.
    4. Fjern trypsin. Tilsæt 2-3 mL dyrkningsmedium. Pipette mediet flere gange for at hjælpe cellerne med at løsne sig. Overfør mediet med cellerne til et 10 mL rør.
    5. Tag 10 μL af prøven fra røret til celletælling.
    6. Frø ~ 25.000 celler i en Petri skål (figur 3a) og tilsæt kulturmedium op til 1 ml.
    7. Sæt skålen indeholdt celler tilbage i inkubator. Inkubér cellerne 24 timer ved 37 °C før transfection.
  2. Celle transfektering
    1. Brug 0,5 μg DNA plasmid (ERK2-gfp, Mito-gfp eller MT-cpyfp) til transfektering pr. skål. Tilsæt 0,5 μg plasmid og 2,5 μg PEI til 50 μL DMEM i et 1,5 mL rør. Incubate blandet medie 10 min ved stuetemperatur.
    2. Tag skålen med cellerne fra inkubator. Udskift dyrkningsmediet med 1 mL DMEM.
    3. Tilføj DNA/PEI blandede medier i cellerne dråbe for dråbe. Sæt cellerne tilbage i inkubator.
    4. Cellerne 3 h ved 37 °C inkubates, og DMEM DNA/PEI-blandede medier erstattes med 1 mL dyrkningsmedium.
    5. Incubate transficeret celler 24 h ved 37 °c før foto stimulation eksperimenter.

3. aktivering af ERK2 ved foto stimulation af Femtosecond laser

  1. Tænd at laser og sørg for, at lukkeren er lukket.
  2. Tænd for laser scannings-confokal mikroskop, og Åbn mikroskop-softwaren. Indstil excitation laser ved 488 nm. Indstil effektniveauet på 488 nm laser ved 0,1 mW. Indstil billedbehandlings størrelse til 512 x 512 pixels. Indstil intervaltiden for hver pixel som 2,4 μs. Indstil intervaltiden mellem to rammer ved 6 s for at minimere fotoblegning og foto skade på cellerne. Indstil total Imaging frames på omkring 300 frames til at give ~ 30 min kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.
    Bemærk: Intervallet mellem to tilstødende rammer, samlede billedbehandlings rammer og billedbehandlings tiden for kontinuerlig mikroskopi kan justeres i henhold til eksperimentelle krav. Hvis et individuelt eksperiment varer over 2 timer, skal du indstille CO2 -inkubations systemet (vist i figur 4) for mikroskop som til stede i trin 3,3 for at forsyne miljøet med 5% Co2 og 37 °c for at opretholde cellernes levedygtighed. Hvis et individuelt eksperiment er begrænset inden for 2 timer, er CO2 inkubations systemet ikke nødvendigt.
  3. Tænd for CO2 inkubations systemet, Tænd for alt varmelegeme og Indstil arbejdstemperatur ved 37 °c. Vent, indtil temperaturen går op til 37 °C og koncentrationen af CO2 op til 5%. Placer inkubator stadiet på mikroskopet som vist i figur 4a.
  4. Forbered Hela-cellerne transficeret med ERK2-gfp som beskrevet i trin 2.
    Bemærk: I et individuelt eksperiment anvendes ordningen STIM-A eller STIM-B til at levere foto stimulation til cellerne. Trin 3,5 og 3,6 udgør detaljerede trin under henholdsvis STIM-A og STIM-B.
  5. Levering af at-laser stimulering til målceller ved hjælp af STIM-A-tilstand
    Bemærk: Før foto stimulation procedure, skal du sørge for, at diameteren af fokus er omkring 2 μm. Denne proces er beskrevet i trin 3.5.1 og 3.5.2.
    1. Tag skålen, der indeholder celler transficeret med ERK2-gfp fra inkubator og sætte skålen på mikroskopet scenen.
    2. Start hurtig scanningstilstand via mikroskop-operativsoftwaren. Tune målet for at erhverve klare fluorescerende billeder af celler. Stop hurtig scanning. Skift til lysfelt billedbehandlings tilstand ved CCD-kameraet (figur 2a). Åbn lukkeren og Juster afstanden mellem to linser af relæ teleskopet for at sikre diameteren af at laser fokus til at være ~ 2 μm (figur 2b). Luk udløseren for at fuldføre justeringen.
      Bemærk: En reference pil kan mærkes for at indikere laser fokus (figur 2). I mellemtiden kan en reference pil også indstilles i midten af fluorescerende billeddannelse vindue for at indikere positionen af fokus for at laser.
    3. Indstil styrken af at laser på 15-40 MW (810 nm, 65 FS, 80 MHz) eller 20-60 MW (1040 nm, 120 FS, 50 MHz) ved prøven. Indstil åbningstiden for udløseren ved 0,05-0,2 s.
    4. Brug hurtig scanning tilstand til at vælge en målcelle godt udtrykt ERK2-GFP.
    5. Flyt scenen for at lokalisere cytosol området af den valgte målcelle i midten af FOV under Bright-felt Imaging af CCD-kameraet (figur 2a).
    6. Klik på Start bunden for at starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremskridt.
    7. Åbn lukkeren på ethvert foruddefineret tidspunkt for at levere at laser stimulation designet i trin 3.5.3 ind i målcellen.
      Bemærk: (1) foto stimulation kan udføres når som helst i den konfokale mikroskopi sekvens, der styres af udløseren. (2) foto stimulation kan leveres flere gange i samme position under den konfokale mikroskopi sekvens.
    8. Vent, indtil billedbehandlings processen er fuldført. Gem billeddata til yderligere dataanalyse.
  6. Levering af at-laser stimulering til målceller ved hjælp af STIM-B-tilstand
    1. Indstil styrken af at laser ved 15-40 MW (810 nm), 20-60 MW (1040 nm) på prøven.
    2. Tag den skål, der indeholder celler transficeret med ERK2-gfp fra inkubator og sætte det på mikroskopet scenen.
    3. Brug hurtig scanning tilstand til at vælge en målcelle godt udtrykt ERK2-GFP.
    4. Indstil konfokale Imaging-processen som trin 3,2. Definer en særlig scannings ramme som stimulerings rammen i billeddannelses processen. Definer parameteren for simulerings rammen.
      1. Indstil et scanningsområde (2 x 2-3 x 3 μm2) på cytosol-området tæt på kernen i målcellen.
      2. Indstil samlet scanningstid ved 0,1-0,2 s. Synkroniser lukkeren af at-laseren med Konfokal scanning i henhold til det foruddefinerede foto stimulerings område, som kun er åbent, når laser scanningen falder i stimulerings rammen og lukkes straks, når den går ud.
        Bemærk: (1) photostimulaion-regionen kan indstilles til enhver størrelse. (2) foto stimulation kan udføres på enhver foruddefineret tids spalte i den konfokale mikroskopi sekvens. (3) foto stimulation kan udføres flere gange på de samme eller forskellige foruddefinerede områder i FOV i den konfokale mikroskopi sekvens.
    5. Klik på Start bunden for at starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremskridt.
    6. Vent, indtil billedbehandlings processen er fuldført. Gem billeddata til yderligere dataanalyse.
  7. Sluk at laser og confokale mikroskop efter eksperimentet.

4. aktivering af eIF4E (substrat af ERK) af Femtosecond laser simulation

  1. Hela-celle klargøring
    1. Følg trin 2.1.1-2.1.5.
    2. Frø ~ 20.000 celler i en Petri skål med celle placering gitre (figur 3b) at lokalisere de foto stimulerede celler. Tilsæt kulturmedium op til 1 mL.
    3. Sæt skålen med cellerne tilbage i inkubator. Cellerne 24 h ved 37 °c før at laser behandling.
  2. Tænd for at-laseren, og sørg for, at lukkeren er lukket.
  3. Tænd for laser scannings-confokal mikroskop, og Åbn mikroskop-softwaren.
  4. Forbered CO2 inkubations systemet som erklæring i trin 3,3.
  5. Levering af at-laser stimulering til målceller ved hjælp af STIM-A-tilstand
    1. Indstil styrken af at laser ved 15-40 MW (810 nm), 20-60 MW (1.040 nm) på prøven. Indstil åbningstiden for udløseren ved 0,05-0,2 s.
    2. Tag skålen med celler fra inkubator og Monter den i CO2 -inkubator på mikroskop stadiet.
    3. Flyt målsætningen i lodret retning for at finde billedplanet under lysbilleddannelse af CCD-kameraet. Flyt prøvestadiet i vandret retning for at sikre, at ingen celle lokaliserer i midten af FOV. Åbn lukkeren og Juster afstanden mellem to linser af relæ teleskopet for at sikre diameteren af at laser fokus ved ~ 2 μm. Luk udløseren for at fuldføre justeringen.
    4. Flyt mikroskopet for at vælge tilfældigt 5 ~ 10 gitre. Det kan angives og lokaliseret af gitrene i bunden af Petri skålene under lysfelt billeddannelse af CCD-kameraet. Markér/Optag koordinaterne for de valgte gitre i skålen.
    5. Stimulere alle celler placeret i de valgte gitre en efter en manuelt under lyse-felt Imaging af CCD-kameraet.
  6. Sæt skålen tilbage i inkubator. Cellerne 24 h ved 37 °C inkubates før immunofluorescens mikroskopi. Sluk for at laser og confokale mikroskop efter photostimualtion procedure.
  7. Immunofluorescens mikroskopi af phosphoryleret eIF4E i celler med foto stimulation til bekræftelse af ERK aktivering
    1. Tag skålen med celler med foto stimulationsbehandling i trin 4,5 ud af inkubator. Fjern dyrkningsmediet. Vask cellerne med PBS én gang. Fjern PBS.
    2. Tilsæt 1 mL 5% PARAFORMALDEHYD (4 °C) til skålen. Fastgør cellerne med 5% PARAFORMALDEHYD i 10 min. Fjern PARAFORMALDEHYD bufferen. Vask cellerne med PBS i 5 min. to gange. Fjern PBS.
    3. Tilsæt 1 mL 0,5% Triton X-100 i skålen. Cellerne 15 min ved stuetemperatur inkubates. Fjern Triton X-100-bufferen. Vask cellerne med PBS i 5 min. to gange. Fjern PBS.
    4. Tilsæt 1 mL 1% BSA-buffer i skålen. Cellerne 30 min ved stuetemperatur inkubates. Fjern BSA-bufferen.
    5. Anti-eIF4E antistof (phosphor S209) fortyndes i 1 mL PBS med 1% BSA til en slutkoncentration på 1 μg/mL. Tilføj bufferen i skålen. Cellerne inkubates i 10-12 h ved 4 °C. Fjern bufferen.
    6. Vask cellerne med PBS i 5 min. to gange. Fjern PBS.
    7. Det sekundære antistof anti-kanin IgG H & L fortyndes i 1 mL PBS med 1% BSA til en slutkoncentration på 2 μg/mL. Tilføj bufferen i skålen. Cellerne 2 h ved stuetemperatur inkubates. Fjern bufferen.
    8. Vask cellerne med PBS. Fjern PBS.
    9. Tilsæt 1 mL PBS i skålen.
    10. Tænd for Laserscanning confokale mikroskop. Åbn mikroskop-softwaren. Indstil excitation laser ved 488 nm. Indstil effektniveauet på 488 nm laser ved 0,1 mW. Indstil billedbehandlings størrelse til 512 x 512 pixels. Indstil intervaltiden for hver pixel som 2,4 μs.
    11. Sæt skålen med immunfluorescent farvnings celler på mikroskop stadiet. Find de markerede felter under Bright-Field Imaging af CCD-kameraet.
    12. Start en enkelt frame-Konfokal scanning. Gem de fluorescerende billeder af foto stimulations celler.
    13. Flyt scenen tilfældigt for at finde områder uden at laser stimulation. Start en enkelt frame-Konfokal scanning. Gem de fluorescerende billeder af ingen stimulerings celler som kontroldata.
  8. Sluk for det konfokale mikroskop efter eksperimentet.

5. aktivering af Mitoflashes og andre mitokondrielle hændelser ved foto stimulation

Bemærk: For at observere mitokondrie morfologiske dynamik, er Hela celler transficeret med Mito-gfp i trin 5,1 at fluorescently indikerer mitokondrier. For at observere mitofpiskeslag transfteres Hela-cellerne med MT-cpYFP i trin 5,1.

  1. Forbered Hela-celler transficeret med Mito-gfp eller MT-cpyfp efter trin 2.
  2. Tænd at laser og sørg for, at lukkeren er lukket.
  3. Tænd for laser-scanning confokale mikroskop. Indstil excitation laser ved 488 nm. Indstil effektniveauet på 488 nm laser ved 0,1 mW. Indstil billedbehandlings størrelse til 512 x 512 pixels. Indstil den samlede billedtid for hvert billede som 2,2 s. Indstil intervaltiden mellem to rammer ved 0 s. Indstil total Imaging frames som 200 frames til at give ~ 440 s kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.
    Bemærk: Intervallet mellem to tilstødende rammer, samlede billedbehandlings rammer og billedbehandlings tiden for kontinuerlig mikroskopi kan justeres i henhold til eksperimentelle krav.
  4. Forbered CO2 inkubations systemet som beskrevet i trin 3,3, hvis det er nødvendigt.
  5. Leverer at laser stimulation til målet mitokondrion ved hjælp af STIM-A-tilstand
    1. Tag den skål, der indeholder celler transficeret med Mito-gfp eller MT-cpyfp fra inkubator og sætte skålen på mikroskop scenen.
    2. Kontroller status for at laser som trin 3.5.2. Sørg for, at fokus for at laser er placeret i centrum af FOV. Indstil en reference pil midt i det fluorescerende billedbehandlings vindue for at angive fokuspositionen.
    3. Indstil styrken af at laser ved 5-30 MW (810 nm), 10-40 MW (1040 nm) på prøven. Indstil åbningstiden for udløseren ved 0,05-0,1 s.
    4. Brug hurtig scanning tilstand til at vælge en målcelle godt udtrykt Mito-GFP eller MT-cpYFP.
    5. Vælg en mitokondrion tilfældigt i målcellen som forsøgs motiv. Flyt mikroskopet fase for at lokalisere målet mitokondrie rørformede struktur i midten af FOV (angiver med reference pilen) ved hurtig scanning mode.
    6. Klik på Start bunden for at starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremskridt.
    7. Åbn lukkeren på ethvert foruddefineret tidspunkt for at levere at laser stimulation designet i trin 5.5.3 i målet mitokondriel rørformede struktur.
      Bemærk: (1) at laser eksponering på mitokondrie rørformede struktur kan styres af lukkeren til enhver tid under Konfokal mikroskopi. (2) Udfør kun en at-laser eksponering i et eksperiment, fordi en at laser stimulation kan forstyrrer mitokondrie status over en lang periode.
    8. Vent, indtil billedbehandlings processen er fuldført. Gem billeddata til yderligere dataanalyse.
  6. Sluk at laser og confokale mikroskop efter eksperimentet.

6. svingning af mitokondriel membran potentiale på Target mitokondrier i Hela celler ved Femtosecond laser stimulation

  1. Forbered Hela-cellerne ved at følge trinene 2.1.1-2.1.6.
  2. Cellerne inkubates i 24 timer ved 37 °C før eksperimentet.
  3. Klargøring af TMRM-Farvningsopløsningen: fortyndet TMRM i 1 mL DMEM med 10% FBS til en endelig koncentration på 100 nM.
  4. Tag skålen med celler, som er fremstillet i trin 5.2.1 og 5.2.2 ud af inkubator. Fjern dyrkningsmediet. Tilsæt TMRM-Farvningsopløsningen fremstillet i trin 6,3 i skålen. Plet til 15-20 min ved 37 °C i inkubator. Fjern Farvningsopløsningen. Vask cellerne med PBS én gang. Tilsæt 1 mL kulturmedium til skålen.
  5. Tænd at laser og sørg for, at lukkeren er lukket.
  6. Tænd for laser-scanning confokale mikroskop. Åbn mikroskop-softwaren. Indstil excitation laser ved 532 nm. Indstil effektniveauet på 532 nm laser ved 0,1 mW. Indstil billedbehandlings størrelse som 512 x 512 pixels og frame generation tid på 2,2 s. Indstil intervaltiden mellem to rammer ved 0 s. Indstil total Imaging frames som 200 frames til at give ~ 440 s kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.
    Bemærk: Intervallet mellem to tilstødende rammer, samlede billedbehandlings rammer og billedbehandlings tiden for kontinuerlig mikroskopi kan justeres i henhold til eksperimentelle krav.
  7. Forbered CO2 inkubations systemet, der er beskrevet i trin 3,3, hvis det er nødvendigt.
  8. Brug STIM-A tilstand til at levere at laser stimulation i målet mitokondrion. Følg trin 5.5.1-5.5.8 for at fuldføre eksperimentet.
    Bemærk: I trin 6,8 skal du vælge en betyder, som er godt plettet med tmrm som mål mitokondrion.
  9. Sluk at laser og confokale mikroskop efter eksperimentet.

7. ændringer af Bax og cytochrom C på målet mitokondrier i Hela celler af Femtosecond laser stimulation

Bemærk: I dette eksperiment, frø cellerne i Petri skåle med celle placering gitre (figur 3b) at lokalisere cellen, som behandles af at laser. Plette cellerne med tmrm at lokalisere mitokondrion som er udvalgt til at blive stimuleret af at laser.

  1. Forbered Hela-cellerne i en Petri skål med celle placerings gitre (figur 3b) som beskrevet i trin 4,1.
  2. Plette cellerne med TMRM som beskrevet i trin 6,3 og 6,4.
  3. Tænd at laser og sørg for, at lukkeren er lukket.
  4. Tænd for laser-scanning confokale mikroskop. Åbn mikroskop-softwaren. Indstil excitation laser ved 532 nm. Indstil effektniveauet på 532 nm laser ved 0,1 mW. Indstil billedbehandlings størrelse som 512 x 512 pixels og frame generation tid på 2,2 s. Indstil intervaltiden mellem to rammer ved 0 s. Indstil total Imaging frames som 50 frames til at give ~ 110 s kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.
  5. Leverer at laser stimulation til målet mitokondrion ved hjælp af STIM-A-tilstand
    1. Indstil styrken af at laser ved 5-30 MW (810 nm), 10-40 MW (1040 nm) på prøven. Indstil åbningstiden for udløseren ved 0,05-0,1 s.
    2. Tag skålen med celler farvet med fra inkubator og sætte skålen på mikroskopet scenen.
    3. Brug hurtig scanningstilstand til at vælge målcellen, som er godt plettet med TMRM.
    4. Flyt scenen for at lokalisere målet mitokondrie rørformede struktur i centrum af FOV ved hjælp af hurtig scanning tilstand. Markér koordinaten for det gitter, som den valgte celle er placeret under lysbilleddannelse.
    5. Klik på Start bunden for at starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremskridt.
    6. Åbn lukkeren på ethvert foruddefineret tidspunkt for mikroskopi Imaging fremskridt manuelt for at levere at laser stimulation designet i trin 7.5.1 ind i målet mitokondrie rørformede struktur.
    7. Vent, indtil billedbehandlings processen er fuldført. Marker den valgte mitokondrion, som er simuleret af at laser. Gem billeddata til yderligere dataanalyse.
    8. Sluk at laser og confokale mikroskop efter eksperimentet. Forbered immunofluorescens mikroskopi af Bax eller cytochrom C på eksperiment cellerne.
  6. Immunofluorescens mikroskopi af Bax eller cytochrom C på den at laser behandlet mitochondrion.
    1. Tag skålen fra mikroskop scenen.
    2. Komplet immunfluorescent farvning af Bax eller cytochrom C Følg trin 4.7.1-4.7.9.
      Bemærk: Brug anti-Bax eller anti-cytokrom c i stedet for anti-eIF4E i trin 4.7.5 til at afslutte immunfluorescent farvning af Bax eller cytochrom c i trin 7.6.2.
    3. Tænd for laser scannings-confokal mikroskop, og Åbn mikroskop-softwaren. Indstil excitation laser ved 488 nm og 532 nm. Indstil effektniveauet på 488 nm og 532 nm laser ved 0,1 mW. Indstil billedbehandlings størrelse som 512 x 512 pixels og frame generation tid på 2,2 s.
    4. Sæt skålen med immunfluorescent farvnings celler på mikroskop stadiet. Find det valgte gitter under lysbilleddannelse af CCD-kameraet. Find den celle, der behandles af at laser.
    5. Start en enkelt frame-Konfokal scanning. Find den mitokondrion, som stimuleres af at laser. Gem det fluorescerende billede af foto stimulerings cellen for yderligere dataanalyse.
  7. Sluk for det konfokale mikroskop efter eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Foto stimulation kan udføres samtidigt sammen med kontinuerlig Konfokal scanning mikroskopi. Foto stimulation kan starte på ethvert foruddefineret tidsinterval i den tidsforskudt Konfokal mikroskopi sekvens. Den konfokale mikroskopi kan overvåge cellulære molekyler ved fluorescerende billeddannelse. Den molekylære respons på foto stimulation og andre dynamikker kan identificeres på denne måde. Teoretisk, hvis ERK er aktiveret, vil det være fosforyleret flytte fra cytoplasmaet til celle Nucleus27. Den specifikke celle skæbne kan reguleres af de visse mønstre i dette ERK signal28. I nylige undersøgelser, optisk graduering baseret på optogentics har givet en høj præcis kontrol af Erk signal i varighed og størrelse og afslørede, at rystet Erk signal transmission dynamik drev forkert spredning i kræftceller7, 8. Her demonstrerer vi ERK2 translokation i Nucleus efter behandling af celle med en kort blitz af at laser ved hjælp af metoden præsenteret i denne protokol. Som vist i figur 5anår ERK2-gfp fluorescens maksimum efter flere minutters at-laser simulering. De ERK2 molekyler vil blive defosforyleret efter aktivering downstream substrater i kernen, og derefter ERK2 kommer tilbage til cytoplasmaet indikeret ved faldende atomare GFP fluorescens. ERK2 kan aktiveres flere gange ved flere foto stimuleringer (figur 5b). Derfor er det i stand til at manipulere ERK2 signal mønster netop ved at styre interval tid mellem flere stimuli. Desuden kan ERK2 aktiveres i tilstødende celler omkring den stimulerede celle lejlighedsvis (figur 5c). Denne observation indikerer, at nogle difsible molekyler kan frigives af cellen behandlet med at laser til at aktivere ERK2 i de tilstødende celler. Fosforylering af ERK2 downstream-protein eIF4E kan bekræftes og visualiseres ved immunofluorescens mikroskopi (figur 5D). Dette resultat indikerer, at at laser stimulation kan med held aktivere Erk signalering pathway. Mere detaljerede resultater er i Wang S., et al.22.

Mitokondrie oxidativ blinker (mitoflashes) er oxidativ brister i mitokondrier, der rod fra komplekse mitokondrie Molekylær dynamik. I sidste årti, er mitoflashes realiseret at være en elementær mitokondria signalering begivenhed og tage en vigtig rolle i multitudinerende celle funktioner29,30,31. Traditionelt, mitoflashes er normalt observeret tilfældigt ved behandling af celler med kemikalier for at give indirekte stress til mitokondrier29,30. Ved at gennemføre denne foto stimulation ordning, vi opnå en kontrollerbar og præcis måde at begejstre mitoflashes på enkelt mitokondrie rørformede niveau. Den vellykkede mitoflash excitation er vist i figur 6a. Interessant, egenskaberne af mitoflashes såsom puls peak, bredde og respons varigheder32 er tæt forbundet med at laser effekt. Mere detaljeret kvantitativ analyse af mitoflashes spændt af at laser stimulation er i Wang S., et al.32. Denne foto stimulation til mitokondrier viser også sorter af mitokondrie Molekylær dynamik, herunder fragmentering og restaurering af mitokondrie morfologi (figur 6b), og svingning af mitokondriel membran potentiale ( Figur 6C). Svarende til foto-aktiverede mitoflashes, disse mitokondrier begivenheder har forskellige præstationer med forskellige effekt intensiteter af foto stimulation. Det er forskelligt fra aktivering af ERK signalering pathway. Indflydelsen af at laser er meget begrænset på en enkelt mitokondrie rør. Mere detaljerede resultater er i Wang Y., et al. 24 og Shi F., et al. 25.

Figure 1
Figur 1: den foto stimulerings ordning, der er etableret på en at-laser kobling, til et Konfokal mikroskop. A) optiske veje i (B) foto stimulation og confokale Imaging System. At laseren er ved første opdeling af en 50/50 stråle splitter i to bjælker. Transmissionen udvides med et relæ teleskop og afspejles derefter i målsætningen om at danne STIM-A. Refleksions strålen er justeret gennem mikroskopet Scanningssystem til at danne STIM-B. Et CCD-kamera bruges til at give en lys-felid Imaging til at overvåge celler og fokus på at laser i STIM-a-tilstand. STIM-A = et fast fokus i midten af FOV; STIM-B = en særlig scannings ramme på det foruddesignede område. DM = koldtlysreflektorlamper spejl, BS = stråle splitter, RM = reflekterende spejl. Bølgelængden af confokal scanning laser er 488 nm/532 nm/635 nm, og den typiske indsamling bølgelængde interval af Fluorescens er < 560 nm/560-625 nm/> 625 nm. Den fiber at laser (1.040 nm, 120 FS, 50 MHz, 1 w) kan erstattes af en ti = Sapphire laser (810 nm, 80 MHz, 65 FS, 1 w) eller andre kommercielle at laser oscillatorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: i STIM-A mode, lokalisering og størrelse af at laser fokus på målcellen på konfokale Imaging plan under Bright-felid Imaging. (A) femtosecond laser er blokeret af lukkeren. (B) femtosecond laser er tændt. Pil: reference pilen er indstillet i midten af FOV for at bekræfte, at at laser fokus lokaliserer den korrekte position. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: den Petri skål, der anvendes til cellekultur, transfektering og foto stimulation eksperimenter. A) 35 mm Petri skål med 15 mm diameter og 0,17 mm tykkelse glasbund. B) 35 mm Petri skålen med glasbund og et trykt 500 μm-celle positions gitter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: CO2 -inkubations systemet. A) Co2 -inkubator stadiet ogB) kontrolpanelet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Erk fotoaktivering ved hjælp af STIM-A-tilstand. (A) enkelt foto stimulus (1.040 nm, 40 MW, 0,1 s) inducerer ERK2-gfp omplantning i Nucleus og derefter tilbage til cytoplasmaet. (B) ERK2 signal mønster medieret af enkelt at laser eksponering (rød pil, 1.040 nm, 40 MW, 0,1 s) og to foto stimuleringer (grønne pile, 810 nm, 30 MW, 0,1 s). (C) Erk aktivering i omgivende celler ved enkelt kort at laser eksponering i målcellen (hvid pil, 810 nm, 24 MW, 0,2 s). D) immunofluorescens for EIF4E-P viser en signifikant stigning 24 h efter enkelt foto simulering (810 nm, 25 mW, 0,2 s). Skala bar = 10 μm (A) og 20 μm (B, C). Fluorescensen af ERK2-GFP og eIF4E-P er spændt af 488 nm excitation laser og indsamlet i < 560 nm kanal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: flere mitokondrier-hændelser induceret af foto stimulation under STIM-A-tilstand. A) excitation af mitoflash på den stimulerede mitokondrie tubulus ved enkelt stimulus (810 nm, 16 MW, 0,1 s). (B) mitokondrier morfologiske fragmentering og restaurering induceret af enkelt foto stimulation (1.040 nm, 30 mW, 0,1 s). C) svingning af mitokondriel membran potentiale ved enkelt at laser stimulation (1040 nm, 20 MW, 0,1 s). Pilene i (A) (B) og (C) angiver placeringen af foto stimuleringer. Skala bjælke = 10 μm. Fluorescensen af Mito-GFP eller MT-cpYFP er spændt af 488 nm excitation laser og indsamlet i < 560 nm kanal. Fluorescensen af TMRM er spændt af 532 nm excitation laser og opsamles i 560-625 nm kanal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 FS, 80 MHz 20-65 mW 10-60 mW 5-50 mW 5-40 mW
1040 nm, 120 FS, 50 MHz 30-100 mW 20-80 mW 15-70 mW 10-60 mW

Tabel 1: Den anbefalede stimulerings varighed og den gennemsnitlige effekt af at-laseren i STIM-A-tilstand.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 FS, 80 MHz 25-40 mW 20-30 mW 15-25 mW 10-25 mW
1040 nm, 120 FS, 50 MHz 40-60 mW 30-50 mW 25-40 mW 20-30 mW

Tabel 2: Anbefalet stimulation varighed og gennemsnitlig effekt af at laser i STIM-A mode ved 2 x 2-3 x 3 μm 2 i cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi demonstrerer en foto stimulation strategi ved at kombinere en at laser med en Laserscanning confokale mikroskop system. Foto stimulation kan direkte fungere som en to-foton mikroskopi ved at definere STIM-B i overensstemmelse hermed. Vi leverer en detaljeret protokol til at udnytte en kort flash af at laser til at udløse Erk signalering eller mitoflashes i målceller. De forskellige stimulerings former kan udføres i henhold til forskellige eksperimentelle formål og systemer. STIM-A kan nemt sættes op baseret på et Konfokal mikroskop. At laseren kan være fokuseret på diffraktion-Limit niveau på FOV Center. Det subcellulære mål skal flyttes til at laser fokus position manuelt og kan stimuleres til vilkårlige varigheder, helt uafhængig af confokal mikroskopi. Derfor kan STIM-A beskytte den prøve, der er helt ude af fokusområdet, og som er egnet til langvarig foto stimulation. Stimulerings området for STIM-B kan defineres på forhånd som ethvert område i FOV. Den kan udføres automatisk. Men stimulering varighed og eksponeringstid kan kun følge sammen med confokal scanning. Efter indstilling af hviletiden for hver pixel og den samlede rammestørrelse er stimulerings varigheden i en enkelt mikroskopi ramme faktisk fast. Foto stimulation kan også udføres periodisk ramme for ramme. Det kan også bruges til at aktivere foto Sensitizers og optogenetiske proteiner, der kræver mindre eksponering varighed, men stort område.

En kritisk overvejelse i denne protokol er, hvordan man bestemme parametrene for at laser stimulation. Ifølge vores tidligere undersøgelser, den cellulære molekylære aktivitet er for det meste induceret af multiphoton og17,21,22,23,24,25. Generelt multiphoton og effektivitet er relateret med alle at laser parametre, herunder bølgelængde, pulsbredde, gentagelse sats. Den cellulære respons er yderligere relateret med laser effekt, stimulation position/region, og eksponering varighed samtidigt. I princippet er stimulerings effektiviteten i modstrid med celle sikkerheden. Stærkere foto stimulation såsom højere gennemsnitlig effekt, længere stimulation varighed og større total hændelse laser energi bidrager til højere stimulation effektivitet, men bringer større risiko for celleskader. Da disse parametre også er relative med hinanden og alle bidrager til stimulering og skade effekt, er det umuligt at bruge kun én parameter, ligesom den samlede hændelse laser energi, eller laser gennemsnitlige effekt, at definere det er sikkert eller ej. I betragtning af både signal aktiverings effektivitet og cellesikkerhed, her giver vi anbefalede gennemsnitlige effekt og stimulation varighed af to at laser kilde til reference i tabel 1 og tabel 2. Udover, parametrene for at laser stimulation bør ændres i henhold til den faktiske optiske system og biologisk prøve.

Ifølge drøftelserne ovenfor, vi har til hensigt at fremlægge mere detaljerede effektive intervaller af foto stimulation parametre. Den bølgelængde af at laser kan ændres på NIR rækkevidde, der anvendes til foto stimulation. Puls bredden skal være kort for at give en høj spidseffekt og høj ikke-lineær og-effektivitet. Lang impuls varighed anbefales ikke til denne protokol. Normalt er den typiske pulsbredde for to-foton mikroskopi (< 200 FS) det rigtige valg. Den gentagelse sats af laseren er ikke en nøglefaktor. Gentagelsesfrekvensen op til MHz er velegnet til denne protokol. Den mest kritiske faktor for cellulære molekylære respons er laser effekt og stimulation varighed at laser. Til aktivering af ERK er den gennemsnitlige effekt ved 15 mW (810 nm) eller 20 mW (1.040 nm) og eksponeringsvarigheden ved 0,2 s i henhold til vores tidligere arbejde22nok til at give tilstrækkelig stimulering til at aktivere Erk signalering, samtidig med at ultrahøj cellelevedygtighed bevares i Hela-cellerne. Tværtimod kan den gennemsnitlige effekt på over 80 mW (810 nm) eller 120 mW (1.040 nm) og eksponeringsvarigheden længere end 1 s medføre uoprettelig beskadigelse af cellerne. Mitokondrier er generelt mere følsomme over for foto stimulation. Stimulering med en gennemsnitlig effekt højere end 40 mW (810 nm) eller 80 mW (1.040 nm) og eksponeringsvarighed over 0,2 s kan forårsage betydelig skade som irreversibel fragmentering i stimuleret mitokondrion eller endda i alle mitokondrier over hele cellen. Det skal bemærkes, at den lysfølsomhed af mitokondrier til foto stimulation varierer meget i forskellige celletyper. For eksempel, i HeLa celler, laser effektbehov kun omkring 6 mW (810 nm, 0,1 s varighed). Alle mitokondrier kan reagere på foto stimulation i form af fragmentering, mitoflashes og MMP oscillationer. Men i menneskelige mesenchymal stamceller, magt skal øges til omkring 15 mW (810 nm, 0,1 s varighed), og stadig omkring halvdelen stimuleret mitokondrier viser ingen reaktion på foto stimulation. I STIM-B-tilstand kan en anden faktor påvirke billed aktiverings effektiviteten, og celle skaden er stimulerings området. Foto stimulation kan forårsage celleskader ved at levere på et lille stimulerings område. Men den samme stimulation kan ikke aktivere ERK ved at levere på et større stimulerings område. Vi anbefaler, at stimulerings området i målcellen er omkring 2 x 2-3 x 3 μm2 og ikke overstiger 25 μm2.

Lokalisering af stimulerings regionen er også vigtig for anvendelsen af denne protokol. Ifølge tidligere værker17,22, foto stimulation i dette område kan nedbryder ca2 + butik i er effektivt og aktivere CRAC kanal. Derefter kan ca2 + tilstrømningen aktivere Erk signalering pathway efterfølgende. Derfor anbefaler vi at levere foto stimulation på ER-regionen i Hela-cellerne for at opnå en høj ERK aktiverings effektivitet. ER-regionen kan let skelnes fra cytoplasma eller kerne under Bright-felt mikroskopi ved en fase-kontrast mål. For at introducere mitokondrielle signalerings hændelser, kan fokus for at laser let monteres på den valgte mitokondrie struktur efter de relaterede procedurer.

Photostimulation metoder, der er beskrevet i denne protokol er også i stand til at blive brugt til at påvirke andre flere cellulære begivenheder såsom inducerende ca2 + og ros signaler17,20,21. Det skal bemærkes, at alle disse tidligere værker har givet evaluering af cellesikkerhed efter foto stimulation. For eksempel, betydelige morfologiske ændringer af celler, boblende, mitokondrie fragmentering og hævelse af hele cellen, nedsat proliferation rate af celler, og nogle andre usædvanlige ændringer af fluorescens under Konfokal mikroskopi alle indebærer høj celleskader. Det bør være meget omhyggelig med at overvåge celle status. Ikke desto mindre, med god kontrol over laser effekt og stimulering parametre, cellelevedygtighed kunne opretholdes i et meget højt niveau samtidig med høj stimulation effektivitet. Derfor er denne photostimualtion metode at laser er et godt potentiale til yderligere at udvide til flere områder og anvendes i relevante applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Arbejdet blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81571719 og 81661168014, 81673014, og 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 og 16XD1403100), og National Key R & D plan (2017YFA0104600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Tags

Biologi at laser foto stimulation ekstracellulær-signal-reguleret kinase (Erk) mitokondrier mitoflash photobiomodulation
Foto stimulation af Femtosecond laser aktiverer ekstracellulær-signal-reguleret kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hændelser i målcellerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H.… More

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter