Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

Strak gerichte femtosecondelaser laser kan precieze stimulatie naar cellen leveren door te worden gekoppeld aan een confocale microscopie die de real-time observatie en foto stimulatie mogelijk maakt. De foto stimulatie kan celmoleculaire gebeurtenissen activeren, waaronder ERK-signalerings traject en mitochondriale flitsen van reactieve zuurstof soorten.

Abstract

Directe controle van cellulaire gedefinieerde moleculaire gebeurtenissen is belangrijk voor Life Science. Onlangs hebben studies aangetoond dat femtosecondelaser Laser stimulatie gelijktijdig meerdere cellulaire moleculaire signalerings trajecten kan activeren. In dit protocol laten we zien dat door het koppelen van femtosecondelaser laser in een confocale Microscoop, cellen precies kunnen worden gestimuleerd door de strak gerichte laser. Sommige moleculaire processen die gelijktijdig kunnen worden waargenomen, worden vervolgens geactiveerd. We presenteren gedetailleerde protocollen van de photostimulatie te activeren extracellulaire signaal gereguleerd kinase (ERK) signalering traject in HeLa cellen. Mitochondriale flitsen van reactieve zuurstof soorten (ROS) en andere mitochondriale gebeurtenissen kunnen ook worden gestimuleerd als het concentreren van de femtosecondelaser laserpuls op een bepaalde mitochondriale buisvormige structuur. Dit protocol omvat het voorbehandelen van cellen vóór foto stimulatie, het afleveren van de foto stimulatie door een femtosecondelaser Laser flits op het doelwit en het observeren/identificeren van moleculaire veranderingen achteraf. Dit protocol vertegenwoordigt een all-optisch hulpmiddel voor aanverwante biologische onderzoeken.

Introduction

De technologie van het beheersen van cellulaire signalering moleculen is een belangrijk onderdeel van de ontwikkeling van de levenswetenschappen. Traditioneel, de meest gebruikte methode is biochemische behandeling door drugs of biologische materialen1,2,3. In het afgelopen decennium, de uitvinding van optogenetics opent een nieuw tijdperk voor cellulaire moleculaire signaal modulatie. Transfectie met lichtgevoelige eiwitten door genengineering maakt licht uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel om verschillende proteïne-activiteiten in de doelcel te moduleren. Deze technologie heeft bemoedigende vorderingen gemaakt, zoals excitatie en remming van het neurale signaal, het bevorderen van genexpressie, het manipuleren van cellulaire signaal patronen, het leiden van verschillende celfates en pathologisch onderzoek4,5 ,6,7,8,9. Licht kan echter alleen werken door transfecterende cellen met optogenetische eiwitten. In de huidige fase, er bestaan zeldzame methoden die licht in staat stellen om cellulaire moleculen direct naast optogenetics controleren.

Femtosecond laser heeft geavanceerde biologische onderzoeken door het verstrekken van efficiënte multiphoton excitatie met behoud van goede biologische veiligheid. Door diverse fotoverwerkings strategieën te implementeren, heeft het tal van prestaties gerealiseerd, zoals multiphoton microscopie, microsurgeries en multiphoton optogenetische toepassingen10,11,12,13 ,14,15,16. Recente onderzoeken tonen aan dat femtosecondelaser Laser stimulatie is aangetoond als een zeer efficiënte optische methode om moleculaire signalering van gebeurtenissen direct te induceren. Er is geconstateerd dat strak gerichte femtosecondelaser laser bestraling op endoplasmisch reticulum (ER) calcium in ER kan afbreken en calcium-vrijgave-geactiveerde calcium (CRAC)-kanalen kunnen activeren om calcium signalen in cellen17te vormen. Dit foto-geactiveerde calcium signaal kan zich verspreiden tussen meerdere soorten cellen18,19,20. Bovendien, het heeft ook de mogelijkheid om het activeren van de cel signalering trajecten zoals nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (nfat) en ERK signalering traject21,22. Door het aanpassen van de intensiteit en lokalisatie van femtosecondelaser Laser blootstelling in cellen, bijvoorbeeld, het concentreren van de laser op mitochondriën, het kan beïnvloeden mitochondriale morfologie en moleculaire gebeurtenissen23,24, 25. in het bijzonder, uitbarstingen van mitochondriale Ros generatie kan worden opgewonden door photostimulatie, die is gemarkeerd als fluorescerende flitsen in mitochondriën (mitoflashes).

Vandaar dat de photostimulatie technologie van goed potentieel is om op grote schaal toegepast te worden in verwant biologisch onderzoek. Het is ook een goede kans om uit te breiden femtosecondelaser lasertoepassingen in het beheersen van cellulaire signalering van moleculen en functies naast microscopie. Hier bieden we de technische details van photostimulatie. De foto stimulatie wordt bereikt door een femtosecondelaser laser te koppelen aan een confocale Microscoop om een enkelvoudige doelcel te bieden met een korte flits fotostimulatie. Het kan efficiënte en bestuurbare ERK-activering in de cel initiëren. Als de foto stimulatie is gelegen op de mitochondriale buisvormige structuur, de Mitochondriale membraanpotentiaal, morfologie, ROS, en permeabiliteit overgang poriën, kunnen allemaal worden bestuurd door de foto stimulatie. Op basis van dit photostimulatie schema bieden we een gedetailleerde methode om ERK-signalerings traject te activeren en meerdere mitochondriale gebeurtenissen in HeLa-cellen te beïnvloeden. Dit protocol aanvult het proces van het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in doelcellen.

Het foto stimulatie systeem wordt ingesteld op een confocale Microscoop met een femtosecondelaser Laser koppeling erin voor gelijktijdige stimulatie en continue microscopie. De femtosecondelaser Laser (golflengte: 1.040 nm, herhalingssnelheid: 50 MHz, pulsbreedte: 120 FS, maximaal uitgangs gemiddelde vermogen: 1 W) wordt voor koppeling gesplitst in twee stralen. Een wordt geleid door een relais telescoop bestaande uit een paar lenzen. Het wordt dan direct weerspiegeld in de Achteropening van een doelstelling (60x, N.A. = 1,2, onderdompeling in water) om een diffractie-grens focus te vormen (STIM-A). De andere wordt weerspiegeld in het Scanning optische pad van confocale Microscoop om te werken als een twee-photon Scanning mode (STIM-B). STIM-A presenteert een vast scherpstelpunt in het midden van het gezichtsveld (FOV). STIM-B is een vooraf ontworpen gedeeltelijke confocale scanning gebied in de FOV. STIM-A en STIM-B worden weergegeven in Figuur 1a. Een CCD-camera onder de dichroïde spiegel (DM) biedt helder-veld beeldvorming voor het bewaken van de focus van femtosecondelaser laser.

Er zijn enkele cruciale essentiële benodigdheden voor de volgende experimenten. In dit protocol wordt een femtosecondelaser Fiber laserbron (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) als voorbeeld gebruikt. In de praktijk kunnen de meeste commerciële femtosecondelaser-oscillatoren worden gebruikt zolang de pulsbreedte korter is dan 200 FS en de piek vermogensdichtheid boven het niveau van 1011 ~ 1012 W/cm2moet liggen. Bijvoorbeeld, een TI: saffier laser meestal gebruikt voor multiphoton microscopie is in staat om de femtosecondelaser laser te vervangen toonde in Figuur 1b. De laser kracht en enkele andere fotostimulatie parameters moeten worden afgesteld omdat de optische parameters (pulsbreedte, golflengte en herhalingssnelheid) veel variëren in verschillende femtosecondelaser-lasers die zo verschillende multiphoton-excitatie-efficiëntie opwekken.

Samen met femtosecondelaser Laser stimulatie biedt de confocale microscopie continue celbeeldvorming om de moleculaire dynamiek in real-time te bewaken in zowel Stim-A als Stim-B modes. Beide foto stimulatie schema's (STIM-A en STIM-B) worden bestuurd door een mechanische sluiter met een resolutie van milliseconde (Figuur 1).

In Stim-A mode, de positie van laser focus is vastgesteld in het centrum van FOV. Een relais telescoop wordt gebruikt om de focus van femtosecondelaser laser te vinden op het confocale beeldvormings vlak door de afstand tussen twee lenzen in de verticale richting te tunen (de laser propagatie richting, verticaal naar het confocale beeldvlak, zoals weergegeven in Figuur 1). Door de helder-veld beeldvorming van de CCD-camera kan de diameter van de laser focus worden gemeten (~ 2 μm, Figuur 2b). De duur van de stimulatie en de blootstellings tijden worden geregeld door een sluiter tijdens het confocale beeldvormings proces.

In de Stim-B-modus kan het stimulatie gebied handmatig worden toegewezen in de confocale Imaging Controlling-software op elke vorm zoals lijn, veelhoek of cirkel. De sluiter wordt gesynchroniseerd met het confocale scanproces. Het opent op de vooraf ontworpen tijd die is ingesteld door de confocale Imaging Controlling software. Vervolgens wordt het stimulatie gebied gescand door femtosecondelaser laser als confocale microscopie. Zo wordt het monster alleen gestimuleerd door femtosecondelaser Laser wanneer het confocale scanproces een bepaald beeld frame binnenkomt.

Het fotostimulatie systeem kan worden ingesteld op zowel omgekeerde als staande metallurgische microscopen volgens de proefpersonen. In vitro cellen gekweekt in Petri schalen zijn beter om te werken met omgekeerde microscopen. Dieren, in het bijzonder hersenen van levende dieren, zijn meer geschikt voor rechtopstaande microscopen. In deze studie nemen we de omgekeerde Microscoop als voorbeeld. Opgemerkt moet worden dat de cover van Petri schaal niet wordt geopend tijdens de hele experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Het onderstaande protocol omvat het gebruik van NIR femtosecondelaser laser en giftige chemicaliën. Let op alle mogelijke schade veroorzaakt door experiment procedures. Lees voor gebruik veiligheidsinformatiebladen van alle relevante chemicaliën of andere materialen. Volg de veiligheidsinstructies van de laser faciliteiten of raadpleeg professionals voor hulp bij het bedienen van de laserbron.

1. experimentele voorbereiding

  1. Het photostimulatie systeem instellen
    Opmerking: Het systeem bestaat uit een femtosecondelaser laser en een laser (op zichtbaar bereik voor fluorescentie excitatie) Scanning confocale Microscoop. In Figuur 1wordt een Fiber femtosecondelaser Laser (1.040 nm, 50 MHz, 120 FS, 1 W) gebruikt voor koppeling. De parameters zijn niet vast of noodzakelijk. Het kan worden vervangen door een TI: saffier laser of andere commerciële femtosecondelaser oscillatoren in de NIR-reeks.
    1. Tune op de femtosecondelaser laser en de confocale Microscoop.
      Opmerking: Stel femtosecondelaser Laser vermogen op een laag niveau (~ 50 mW) in het proces van het aanpassen van het optische pad.
    2. Gebruik reflecterende spiegels (RM1 en RM2 getoond in Figuur 1b) om de femtosecondelaser laserstraal door een mechanische sluiter te richten. Open de sluiter.
    3. Stel een 50/50 Beam splitter (BS, afbeelding 1B) in om de femtosecondelaser laserstraal in twee afzonderlijke stralen (transmissie balk en reflectie straal) te splitsen. Stuur RM2 en BS om de femtosecondelaser laserstraal samen te laten vallen met de scan laserstraal.
      Opmerking: (1) een referentie Iris (Iris 1, Figuur 1b) achter de long-pass dichroïde spiegel (DM, 700 nm cut-on golflengte, Figuur 1b) wordt gebruikt voor positionering Scanning laserpad. (2) het systeem kan alleen werken op Stim-A of Stim-B modus, respectievelijk. Voor Stim-A-modus kunnen de BS worden verwijderd. Voor Stim-B, de BS kan worden vervangen door een RM.
    4. Stel een relais telescoop in die bestaat uit een paar lenzen om de breedte van de transmissie balk uit te breiden, die bestaat uit het achterste diafragma van het objectief.
      Opmerking: (1) de referentie Iris 2 en 3 (Figuur 1b) zijn ingesteld om de laserstraal femtoseconde (Figuur 1b) te collimeren. (2) de vergroting van de Relais telescoop is afhankelijk van de oorspronkelijke diameter van de femtosecondelaser laserstraal en de diameter van de Achteropening van het objectief.
    5. Stuur RMs (RM 3-5, Figuur 1b) om de uitgebreide straal in de Microscoop uit te lijnen. Stuur RM 4 en RM 5 om de focus van femtosecondelaser laser naar het centrum van FOV af te stemmen.
    6. Meet de transmissie efficiëntie van de doelstelling van de femtosecondelaser laser.
      Opmerking: Gelieve te meten de laser Power op Stim-A en STIM-B respectievelijk als gevolg van de verschillende penetratie paden van de laser in deze twee modi. Het zal de Power at specimen gebruiken om gerelateerde experiment procedures hieronder te illustreren.
    7. Stem af van de sluiter, femtosecondelaser laser en confocale Microscoop totdat experimenten beginnen.
      Opmerking: In de volgende experimenten, STIM-A en STIM-B niet samenwerken. Bij het gebruik van Stim-A, de femtosecondelaser laserstraal van Stim-B moet worden geblokkeerd. Aan de andere kant, de bundel van Stim-A moet worden geblokkeerd als het systeem werkt op Stim-B modus.
  2. Bereid het kweekmedium voor: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) High glucose met 10% foetaal runderserum (FBS).
  3. Bereid de ERK2-GFP DNA plasmide, Mito-GFP DNA plasmide en mitochondriale matrix-targeting circulair pergedempt geel fluorescerende eiwit (MT-cpYFP) DNA plasmide. Houd de plasmiden bij-20 °C tot het gebruik.
  4. Bereid tetramethylrhodamine (TMRM, 100 μM) en polyethylenimine (PEI 1 mg/mL). Houd ze bij-20 °C tot het gebruik.
  5. Bereid 5% Paraformaldehyde, 0,5% Triton X-100, anti-eIF4E (eukaryotische initiatie factor 4E), antilichaam (fosfor S209, 1 mg/mL), anti-Bax antilichaam (1 mg/mL), anti-cytochroom C antilichaam (1 mg/mL), secundair antilichaam (anti-konijn IgG H & L, Alexa Fluor 488, 1 mg/mL), en 1% BSA met 0,1% Tween20. Bewaar deze reagentia bij 4 °C tot het gebruik.
  6. Bereid steriele materialen voor: celkweek flessen, Petri schalen met glazen schuif bodem (Figuur 3a), gerechten met een glazen bodem, een bedrukt 500 μm cellocatie raster (Figuur 3b, om de fotogestimuleerde cellen te lokaliseren), 1,5 ml en 10 ml buizen, en 1 mL, 100 μL en 10 μL pipetten en tips.
  7. Bereid standaard celkweek laboratoriumapparatuur: een celkweek incubator ingesteld op 5% CO2 en 37 °c, en een biologische veiligheidskast.

2. celcultuur en-transfectie

Opmerking: Hela Cell (cellijn afgeleid van baarmoederhalskanker cellen genomen op 8 februari 1951 van Henrietta mist)26 wordt gebruikt als een voorbeeld in dit protocol.

  1. Celpassage
    1. Verwijder het kweekmedium uit de celkweek fles met voldoende cellen.
    2. Was de fles met 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS.
    3. Voeg langzaam 1 mL trypsine toe en tik lichtjes op de fles. Plaats de fles terug in de incubator en incuberen de cellen 3 min bij 37 °C.
    4. Verwijder de trypsine. Voeg 2-3 mL kweekmedium toe. Pipetteer het medium meerdere malen om de cellen te helpen loskoppelen. Breng het medium met cellen over in een tube van 10 mL.
    5. Neem 10 μL van het monster uit de buis voor het tellen van cellen.
    6. Zaad ~ 25.000 cellen in een Petri schaaltje (Figuur 3a) en voeg kweekmedium toe tot 1 ml.
    7. Plaats de schaal cellen terug in de incubator. Inincuberen de cellen 24 h bij 37 °C vóór de transfectie.
  2. Celtransfectie
    1. Gebruik 0,5 μg DNA plasmide (ERK2-GFP, Mito-GFP of MT-cpYFP) voor Transfectie per gerecht. Voeg 0,5 μg plasmide en 2,5 μg PEI toe aan 50 μL van de DMEM in een 1,5 mL Tube. Incuberen mixed media 10 min bij kamertemperatuur.
    2. Neem de schaal met de cellen uit de incubator. Vervang het kweekmedium door 1 mL DMEM.
    3. Voeg DNA/PEI mixed media in de cellen drop by drop. Plaats de cellen terug in de incubator.
    4. Inbroed de cellen 3 uur bij 37 °C en vervang de mixed media van DMEM DNA/PEI door 1 mL kweekmedium.
    5. Incuberen de cellen 24 uur bij 37 °C vóór de fotostimulatie experimenten.

3. activering van ERK2 door foto stimulatie van Femtosecond Laser

  1. Zet de femtosecondelaser laser aan en zorg ervoor dat de sluiter gesloten is.
  2. Schakel de confocale laser scan-Microscoop in en open de Microscoop software. Stel de excitatie laser in op 488 nm. Stel het vermogensniveau van 488 nm laser in op 0,1 mW. Stel de beeldgrootte in op 512 x 512 pixels. Stel de intervaltijd van elke pixel in op 2,4 μs. Stel de intervaltijd tussen twee frames op 6 sec. om fotobleaching en foto schade aan cellen te minimaliseren. Stel Total Imaging frames in op ongeveer 300 frames om ~ 30 min continue microscopie te bieden in een individueel experiment.
    Opmerking: Het interval van twee aangrenzende frames, totale beeldvormings frames en imaging tijd van continue microscopie kan worden aangepast aan de hand van experimentele vereisten. Als een individueel experiment langer duurt dan 2 uur, stelt u het incubatie systeem CO2 (weergegeven in Figuur 4) voor de Microscoop in als aanwezig in stap 3,3 om de omgeving van 5% Co2 en 37 °c te bieden voor het behoud van de levensvatbaarheid van de cellen. Als een individueel experiment binnen 2 uur beperkt is, is het CO2 -incubatie systeem niet nodig.
  3. Schakel het CO2 -incubatie systeem in, schakel alle Verwarming in en stel de werktemperatuur in op 37 °c. Wacht tot de temperatuur stijgt tot 37 °C en de concentratie van CO2 tot 5%. Plaats de couveuse fase op de Microscoop fase zoals afgebeeld in figuur 4a.
  4. Bereid HeLa cellen met ERK2-GFP, zoals beschreven in stap 2.
    Opmerking: In een individueel experiment, het schema Stim-A of Stim-B wordt toegepast om photostimulatie aan cellen te leveren. Stap 3,5 en 3,6 presenteren gedetailleerde stappen onder Stim-A en STIM-B respectievelijk.
  5. Het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in doelcellen met behulp van Stim-A-modus
    Opmerking: Voor de foto stimulatieprocedure, zorg ervoor dat de diameter van de focus ongeveer 2 μm. Dit proces wordt beschreven in stap 3.5.1 en 3.5.2.
    1. Neem de schaal met cellen die met ERK2-GFP zijn getransfcuteerd uit de incubator en zet het gerecht op de Microscoop fase.
    2. Start de snelle scanmodus via de Microscoop-besturingssoftware. Stem het doel af om heldere fluorescerende afbeeldingen van cellen te verkrijgen. Stop snel scannen. Schakel over naar de helder-veld beeldvormings modus door de CCD-camera (Figuur 2a). Open de sluiter en pas de afstand tussen twee lenzen van de Relais telescoop aan om ervoor te zorgen dat de diameter van de femtosecondelaser laser focus ~ 2 μm is (Figuur 2b). Sluit de sluiter om de aanpassing te voltooien.
      Opmerking: Een verwijzings pijl kan worden gelabeld om de laser focus aan te duiden (Figuur 2). In de tussentijd kan een referentie pijl ook in het midden van het fluorescerende beeldvormings venster worden ingesteld om de positie van de focus van femtosecondelaser laser aan te geven.
    3. Stel de kracht van de femtosecondelaser laser in op 15-40 mW (810 nm, 65 FS, 80 MHz), of 20-60 mW (1040 nm, 120 FS, 50 MHz) op het preparaat. Stel de openingstijd van de sluiter in op 0,05-0,2 s.
    4. Gebruik de snelle scanmodus om een doelcel te selecteren die goed is uitgedrukt ERK2-GFP.
    5. Verplaats het werkgebied om het cytosol-gebied van de geselecteerde doelcel in het midden van FOV te lokaliseren onder heldere beeldvorming van de CCD-camera (Figuur 2a).
    6. Klik op de Start onderkant om de voortgang van de continue microscopie-Imaging te starten.
    7. Open de sluiter op een vooraf gedefinieerde tijd sleuf om de femtosecondelaser Laser stimulatie te leveren die is ontworpen in stap 3.5.3 in de doelcel.
      Opmerking: (1) de foto stimulatie kan op elk moment worden uitgevoerd in de confocale microscopie sequentie die door de sluiter wordt bestuurd. (2) de foto stimulatie kan gedurende meerdere keren in dezelfde positie worden afgeleverd tijdens de confocale microscopie sequentie.
    8. Wacht tot het imaging proces is voltooid. Sla de afbeeldingsgegevens op voor verdere gegevensanalyse.
  6. Het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in doelcellen met behulp van Stim-B-modus
    1. Stel de kracht van de femtosecondelaser laser in op 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) op het preparaat.
    2. Neem de schaal met cellen die met ERK2-GFP zijn getransffecteerd uit de incubator en zet deze op de Microscoop.
    3. Gebruik de snelle scanmodus om een doelcel te selecteren die goed is uitgedrukt ERK2-GFP.
    4. Stel het confocale beeldvormings proces in als stap 3,2. Definieer een speciaal scan frame als het stimulatie frame in het beeldvormings proces. Definieer de parameter van het simulatie frame.
      1. Stel een scangebied in (2 x 2-3 x 3 μm2) in het cytosol-gebied dicht bij de Nucleus in de doelcel.
      2. Stel de totale scantijd in op 0,1-0,2 s. Synchroniseer de sluiter van de femtosecondelaser laser met de confocale scanning volgens het vooraf gedefinieerde foto stimulatie gebied, dat alleen open is wanneer de laser scanning in het stimulatie frame daalt en onmiddellijk sluit wanneer het uitgaat.
        Opmerking: (1) de fotostimulaion regio kan worden ingesteld op elke grootte. (2) de foto stimulatie kan worden uitgevoerd op elke vooraf gedefinieerde tijd sleuf in de confocale microscopie sequentie. (3) de foto stimulatie kan meerdere malen worden uitgevoerd op dezelfde of verschillende vooraf gedefinieerde gebieden in de FOV in die confocale microscopie sequentie.
    5. Klik op de Start onderkant om de voortgang van de continue microscopie-Imaging te starten.
    6. Wacht tot het imaging proces is voltooid. Sla de afbeeldingsgegevens op voor verdere gegevensanalyse.
  7. Zet de femtosecondelaser laser en de confocale Microscoop na het experiment uit.

4. activering van eIF4E (substraat van ERK) door Femtosecond Laser simulatie

  1. Hela-celvoorbereiding
    1. Volg de stappen 2.1.1-2.1.5.
    2. Zaad ~ 20.000 cellen in een Petri schaaltje met cellocatierasters (Figuur 3b) om de fotogestimuleerde cellen te lokaliseren. Voeg een kweekmedium tot 1 mL toe.
    3. Plaats de schaal met de cellen terug in de incubator. Inincuberen de cellen 24 h bij 37 °C vóór femtosecondelaser laserbehandeling.
  2. Zet de femtosecondelaser laser aan en zorg ervoor dat de sluiter gesloten is.
  3. Schakel de confocale laser scan-Microscoop in en open de Microscoop software.
  4. Bereid het CO2 -incubatie systeem als instructie in stap 3,3.
  5. Het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in doelcellen met behulp van Stim-A-modus
    1. Stel de kracht van de femtosecondelaser laser in op 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1.040 nm) op het preparaat. Stel de openingstijd van de sluiter in op 0,05-0,2 s.
    2. Neem het gerecht met cellen uit de incubator en monteer het in de CO2 -incubator op het podium van de Microscoop.
    3. Verplaats de doelstelling in verticale richting om het beeldvormings vlak te lokaliseren onder helderveld beeldvorming van de CCD-camera. Verplaats de preparaat fase in horizontale richting om ervoor te zorgen dat er geen cel zich in het midden van FOV bevindt. Open de sluiter en pas de afstand tussen twee lenzen van de Relais telescoop aan om de diameter van de femtosecondelaser laser focus op ~ 2 μm te garanderen. Sluit de sluiter om de aanpassing te voltooien.
    4. Verplaats de Microscoop fase naar willekeurig selecteren 5 ~ 10 rasters. Het kan worden aangegeven en gelokaliseerd door de roosters in de bodem van de Petri schalen onder helderveld beeldvorming van de CCD camera. Markeer/Noteer de coördinaten van de geselecteerde rasters in de schaal.
    5. Stimuleer alle cellen die zich in de geselecteerde rasters een voor een handmatig bevinden onder helderveld beeldvorming van de CCD-camera.
  6. Zet de schaal terug in de incubator. Inincuberen de cellen 24 uur bij 37 °C vóór immunofluorescentie microscopie. Zet de femtosecondelaser laser en confocale Microscoop uit na de fotostimualtion-procedure.
  7. Immunofluorescentie microscopie van fosforyleerd eIF4E in cellen met foto stimulatie voor de bevestiging van ERK-activatie
    1. Neem de schotel met cellen met fotostimulatie behandeling in stap 4,5 uit de incubator. Verwijder het kweekmedium. Was de cellen één keer met PBS. Verwijder PBS.
    2. Voeg 1 mL 5% Paraformaldehyde (4 °C) toe aan de schaal. Repareer de cellen met 5% Paraformaldehyde gedurende 10 min. Verwijder de Paraformaldehyde buffer. Was de cellen tweemaal met PBS gedurende 5 minuten. Verwijder PBS.
    3. Voeg 1 mL 0,5% Triton X-100 toe aan de schaal. Inincuberen de cellen 15 min bij kamertemperatuur. Verwijder de Triton X-100 buffer. Was de cellen tweemaal met PBS gedurende 5 minuten. Verwijder PBS.
    4. Voeg 1 mL 1% BSA-buffer toe aan de schaal. Inincuberen de cellen 30 min bij kamertemperatuur. Verwijder de BSA-buffer.
    5. Verdun anti-eIF4E antilichaam (Phosphor S209) in 1 mL PBS met 1% BSA tot een eindconcentratie van 1 μg/mL. Voeg de buffer toe aan het schaaltje. Inincuberen de cellen voor 10-12 uur bij 4 °C. Verwijder de buffer.
    6. Was de cellen tweemaal met PBS gedurende 5 minuten. Verwijder PBS.
    7. Verdun het secundaire antilichaam tegen konijnen IgG H & L in 1 mL PBS met 1% BSA tot een eindconcentratie van 2 μg/mL. Voeg de buffer toe aan het schaaltje. Inincuberen de cellen 2 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de buffer.
    8. Was de cellen met PBS. Verwijder PBS.
    9. Voeg 1 mL PBS toe aan de schaal.
    10. Schakel de confocale Microscoop van laser scanning in. Open de Microscoop-software. Stel excitatie laser in op 488 nm. Stel het vermogensniveau van 488 nm laser in op 0,1 mW. Stel de beeldgrootte in op 512 x 512 pixels. Stel de intervaltijd van elke pixel in op 2,4 μs.
    11. Plaats de schaal met immunofluorescentie kleurings cellen op de Microscoop. Zoek de geselecteerde vakken onder helderveld beeldvorming van de CCD-camera.
    12. Start een confocale scanning met één frame. Bewaar de fluorescerende foto's van foto stimulatie cellen.
    13. Verplaats het podium willekeurig om gebieden te lokaliseren zonder femtosecondelaser Laser stimulatie. Start een confocale scanning met één frame. Sla de fluorescerende afbeeldingen van geen stimulatie cellen op als controlegegevens.
  8. Schakel de confocale Microscoop na het experiment uit.

5. activering van Mitoflitsen en andere mitochondriale voorvallen door Photostimulatie

Opmerking: Om de mitochondriale morfologische dynamiek te observeren, worden HeLa-cellen met Mito-GFP in stap 5,1 getransffecteerd om de mitochondriën aan te duiden. Om mitoflitsen te observeren, worden HeLa-cellen in stap 5,1 met mt-cpYFP getransffecteerd.

  1. Bereid HeLa-cellen die met Mito-GFP of MT-cpYFP zijn getransffecteerd naar aanleiding van stap 2.
  2. Zet de femtosecondelaser laser aan en zorg ervoor dat de sluiter gesloten is.
  3. Schakel de confocale Microscoop van laser scanning in. Stel excitatie laser in op 488 nm. Stel het vermogensniveau van 488 nm laser in op 0,1 mW. Stel de beeldgrootte in op 512 x 512 pixels. Stel de totale beeldvormings tijd van elk frame in op 2,2 s. Stel de intervaltijd tussen twee frames bij 0 s in. Stel totaalbeeld frames in als 200 frames om ~ 440 s continue microscopie te bieden in een individueel experiment.
    Opmerking: Het interval van twee aangrenzende frames, totale beeldvormings frames en imaging tijd van continue microscopie kan worden aangepast aan de hand van experimentele vereisten.
  4. Bereid het CO2 -incubatie systeem, zoals beschreven in stap 3,3, indien nodig.
  5. Het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in het doelwit mitochondrion met behulp van Stim-A-modus
    1. Neem de schaal met cellen die met Mito-GFP of MT-cpYFP zijn getransfcuteerd van de incubator en zet het gerecht op de Microscoop.
    2. Controleer de status van femtosecondelaser laser als stap 3.5.2. Zorg ervoor dat de focus van femtosecondelaser Laser zich in het centrum van FOV bevindt. Stel een verwijzings pijl in het midden van het fluorescerende beeldvormings venster in om de positie van de focus aan te geven.
    3. Stel de kracht van de femtosecondelaser laser in op 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) op het preparaat. Stel de openingstijd van de sluiter in op 0,05-0,1 s.
    4. Gebruik de snelle scanmodus om een doelcel te selecteren die goed wordt uitgedrukt Mito-GFP of MT-cpYFP.
    5. Selecteer een mitochondrion willekeurig in de doelcel als het experimentele onderwerp. Verplaats de Microscoop fase om de doel mitochondriale buisvormige structuur in het midden van FOV te lokaliseren (Geef aan met de referentie pijl) door de snelle scanmodus.
    6. Klik op de Start onderkant om de voortgang van de continue microscopie-Imaging te starten.
    7. Open de sluiter op een vooraf gedefinieerde tijd om de femtosecondelaser Laser stimulatie te leveren die is ontworpen in stap 5.5.3 in de beoogde mitochondriale buisvormige structuur.
      Opmerking: (1) de blootstelling aan de femtosecondelaser laser op de mitochondriale tubulaire structuur kan op elk moment tijdens de confocale microscopie worden geregeld door de sluiter. (2) Voer slechts één femtosecondelaser-Laser blootstelling uit in één experiment omdat een femtosecondelaser Laser stimulatie de mitochondriale status gedurende een lange periode kan pertureren.
    8. Wacht tot het imaging proces is voltooid. Sla de afbeeldingsgegevens op voor verdere gegevensanalyse.
  6. Zet de femtosecondelaser laser en de confocale Microscoop na het experiment uit.

6. oscillatie van mitochondriale membraan potentieel op doel mitochondriën in HeLa cellen door Femtosecond Laser stimulatie

  1. Maak HeLa-cellen klaar volgens de stappen 2.1.1-2.1.6.
  2. Inincuberen de cellen voor 24 uur bij 37 °C vóór het experiment.
  3. Bereid de TMRM-kleurings oplossing: Verdun de TMRM in 1 mL DMEM met 10% FBS tot een eindconcentratie van 100 nM.
  4. Neem de schaal met cellen die in stap 5.2.1 en 5.2.2 uit de incubator zijn bereid. Verwijder het kweekmedium. Voeg de TMRM-kleurings oplossing voorbereid in stap 6,3 in het schaaltje. Vlek voor 15-20 min bij 37 °C in de incubator. Verwijder de kleurings oplossing. Was de cellen één keer met PBS. Voeg 1 mL kweekmedium toe aan de schaal.
  5. Zet de femtosecondelaser laser aan en zorg ervoor dat de sluiter gesloten is.
  6. Schakel de confocale Microscoop van laser scanning in. Open de Microscoop-software. Stel excitatie laser in op 532 nm. Stel het vermogensniveau van 532 nm laser in op 0,1 mW. Stel Imaging size in als 512 x 512 pixels en frame generatie tijd bij 2,2 s. Stel de intervaltijd tussen twee frames bij 0 s in. Stel de totale beeldvormings frames in als 200-frames om ~ 440 s continue microscopie te leveren in een individueel experiment.
    Opmerking: Het interval van twee aangrenzende frames, totale beeldvormings frames en imaging tijd van continue microscopie kan worden aangepast aan de hand van experimentele vereisten.
  7. Bereid indien nodig het incubatie systeem CO2 zoals beschreven in stap 3,3.
  8. Gebruik Stim-A modus te leveren femtosecondelaser Laser stimulatie in de doel-mitochondrion. Volg de stappen 5.5.1-5.5.8 om het experiment te voltooien.
    Opmerking: In stap 6,8, selecteer een mitochondrion die goed bevlekt met TMRM als het doelwit mitochondrion.
  9. Zet de femtosecondelaser laser en de confocale Microscoop na het experiment uit.

7. veranderingen van Bax en cytochroom C op de doel mitochondriën in HeLa cellen door Femtosecond Laser stimulatie

Opmerking: In dit experiment, zaad de cellen in Petri schalen met cel locatie rasters (Figuur 3b) om de cel die wordt behandeld door femtosecondelaser Laser lokaliseren. Vlek de cellen met TMRM om de mitochondrion te lokaliseren die is geselecteerd om te worden gestimuleerd door femtosecondelaser laser.

  1. Bereid HeLa-cellen in een Petri schaaltje met cellocatierasters (Figuur 3b) zoals beschreven in stap 4,1.
  2. Beits de cellen met TMRM zoals beschreven in de stappen 6,3 en 6,4.
  3. Zet de femtosecondelaser laser aan en zorg ervoor dat de sluiter gesloten is.
  4. Schakel de confocale Microscoop van laser scanning in. Open de Microscoop-software. Stel excitatie laser in op 532 nm. Stel het vermogensniveau van 532 nm laser in op 0,1 mW. Stel Imaging size in als 512 x 512 pixels en frame generatie tijd bij 2,2 s. Stel de intervaltijd tussen twee frames bij 0 s in. Stel de totale beeldvormings frames in als 50-frames om ~ 110 s continue microscopie te leveren in een individueel experiment.
  5. Het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in het doelwit mitochondrion met behulp van Stim-A-modus
    1. Stel de kracht van de femtosecondelaser laser in op 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) op het preparaat. Stel de openingstijd van de sluiter in op 0,05-0,1 s.
    2. Neem de schotel met cellen bevlekt met uit de broedplaats en zet het gerecht op de Microscoop fase.
    3. Gebruik de snelle scanmodus om de doelcel te selecteren die goed bevlekt is met TMRM.
    4. Verplaats het podium om de doel mitochondriale buisvormige structuur in het centrum van FOV te lokaliseren met behulp van de snelle scanmodus. Markeer de coördinaat van het raster waarop de geselecteerde cel zich bevindt onder helderveld Imaging.
    5. Klik op de Start onderkant om de voortgang van de continue microscopie-Imaging te starten.
    6. Open de sluiter op elke vooraf gedefinieerde tijd van microscopie Imaging voortgang handmatig te leveren de femtosecondelaser Laser stimulatie ontworpen in stap 7.5.1 in de doel-mitochondriale buisvormige structuur.
    7. Wacht tot het imaging proces is voltooid. Markeer de geselecteerde mitochondrion die wordt gesimuleerd door femtosecondelaser laser. Sla de afbeeldingsgegevens op voor verdere gegevensanalyse.
    8. Zet de femtosecondelaser laser en de confocale Microscoop na het experiment uit. Maak immunofluorescentie microscopie van Bax of cytochroom C op de experiment cellen.
  6. Immunofluorescentie microscopie van Bax of cytochroom C op de femtosecondelaser Laser behandelde mitochondrion.
    1. Neem het gerecht uit de Microscoop.
    2. Volledige immunofluorescentie kleuring van Bax of cytochroom C volg de stappen 4.7.1-4.7.9.
      Opmerking: Gebruik anti-Bax of anti-cytochroom C in plaats van anti-eIF4E in stap 4.7.5 om immunofluorescentie kleuring van Bax of cytochroom C in stap 7.6.2 te voltooien.
    3. Schakel de confocale laser scan-Microscoop in en open de Microscoop software. Stel excitatie laser in op 488 nm en 532 nm. Stel het vermogensniveau van 488 nm en 532 nm laser in op 0,1 mW. Stel beeldformaat in als 512 x 512 pixels en frame generatie tijd op 2,2 s.
    4. Plaats de schaal met immunofluorescentie kleurings cellen op de Microscoop. Zoek het geselecteerde raster onder helderveld beeldvorming van de CCD-camera. Zoek de cel die wordt behandeld door femtosecondelaser laser.
    5. Start een confocale scanning met één frame. Zoek de mitochondrion die wordt gestimuleerd door femtosecondelaser laser. Bewaar het fluorescerende beeld van de fotostimulatiecel voor verdere gegevensanalyse.
  7. Schakel de confocale Microscoop na het experiment uit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De foto stimulatie kan gelijktijdig worden uitgevoerd samen met continue confocale scanning microscopie. De foto stimulatie kan beginnen bij elk vooraf gedefinieerd tijdslot in de time-lapse confocale microscopie sequentie. De confocale microscopie kan cellulaire moleculen monitoren door fluorescerende beeldvorming. De moleculaire responsen op foto stimulatie en andere dynamiek kunnen op deze manier worden geïdentificeerd. Theoretisch, als ERK wordt geactiveerd, het zal worden gefosforyleerd verplaatsen van het cytoplasma naar cel Nucleus27. De specifieke cel lot kan worden geregeld door de bepaalde patronen van deze ERK Signal28. In recente studies heeft optische modulatie op basis van optogentics een hoge nauwkeurige controle van het ERK-signaal in duur en omvang verschaft en bleek dat verontrust ERK-signaaltransmissie dynamiek een onjuiste proliferatie van kankercellen7stimuleert, 8. Hier demonstreren we de ERK2 translocatie in Nucleus na het behandelen van de cel met een korte flits van femtosecondelaser laser met behulp van de methode die in dit protocol wordt gepresenteerd. Zoals weergegeven in figuur 5abereikt ERK2-GFP fluorescentie het maximum na enkele minuten femtosecondelaser Laser simulatie. De ERK2 moleculen zal worden gedefosforyleerd na het activeren van downstream substraten in de Nucleus, en vervolgens de ERK2 komt terug naar het cytoplasma aangegeven door het verminderen van nucleaire GFP fluorescentie. ERK2 kan meerdere malen worden geactiveerd door meerdere fotostimulaties (Figuur 5b). Daarom is het in staat om het ERK2-signaal patroon precies te manipuleren door de intervaltijd tussen meerdere stimuli te regelen. Bovendien, ERK2 kan worden geactiveerd in aangrenzende cellen rond de gestimuleerde cel af en toe (figuur 5c). Deze observatie geeft aan dat sommige te diffundeerbaar moleculen kunnen vrijkomen door de cel die met femtosecondelaser laser wordt behandeld om ERK2 in de aangrenzende cellen te activeren. Fosforylering van ERK2 downstream proteïne eIF4E kan worden bevestigd en gevisualiseerd door immunofluorescentie microscopie (figuur 5d). Dit resultaat geeft aan dat femtosecondelaser Laser stimulatie ERK-signalerings traject met succes kan activeren. Meer gedetailleerde resultaten zijn in Wang S., et al.22.

Mitochondriale oxidatieve flitsen (mitoflashes) zijn oxidatieve uitbarstingen in mitochondriën die wortel van complexe mitochondriale moleculaire dynamiek. In de afgelopen tien jaar, mitoflashes worden gerealiseerd om een elementair mitochondriën signalering gebeurtenis en neem een belangrijke rol in de multitudineuze celfuncties29,30,31. Traditioneel, mitoflitsen worden meestal waargenomen bij toeval bij de behandeling van cellen met chemicaliën om indirecte stress te bieden aan mitochondriën29,30. Door dit photostimulatie schema te implementeren, bereiken we een regelbare en precieze manier om mitoflitsen op één mitochondriale buis niveau te prikkelen. De succesvolle mitoflash-excitatie wordt weergegeven in Figuur 6a. Interessant is dat de eigenschappen van mitoflitsen zoals Pulse Peak, width en Response duur32 nauw verwant zijn aan de femtosecondelaser Laser Power. Meer gedetailleerde kwantitatieve analyse van mitoflashes opgewonden door femtosecondelaser Laser stimulatie is in Wang S., et al.32. Deze foto stimulatie naar mitochondriën toont ook variëteiten van mitochondriale moleculaire dynamiek, met inbegrip van fragmentatie en herstel van de mitochondriale morfologie (Figuur 6b), en oscillatie van Mitochondriale membraanpotentiaal ( Figuur 6C). Net als bij foto-geactiveerde mitoflashes, deze mitochondriën gebeurtenissen hebben verschillende prestaties met verschillende vermogens intensiteiten van photostimulatie. Het verschilt van de activering van ERK signalering traject. De invloed van femtosecondelaser laser is sterk beperkt op een enkele mitochondriale buis. Meer gedetailleerde resultaten zijn in Wang Y., et al. 24 en Shi F., et al. 25.

Figure 1
Figuur 1: het fotostimulatie schema dat op een femtosecondelaser Laser koppeling is ingesteld in een confocale Microscoop. A) optische paden van (B) het fotostimulatie-en confocale beeldvormings systeem. De femtosecondelaser laser is op het eerste split door een 50/50 Beam splitter in twee stralen. De transmissie wordt uitgebreid door een relais telescoop en vervolgens weerspiegeld in de doelstelling om Stim-A te vormen. De reflectie straal wordt uitgelijnd door het scanning systeem van de Microscoop om Stim-B te vormen. Een CCD-camera wordt gebruikt om een helder-felid beeld te bieden om cellen en focus van femtosecondelaser laser in Stim-A-modus te bewaken. STIM-A = een vaste focus in het centrum van FOV; STIM-B = een speciaal scan frame op een vooraf ontworpen gebied. DM = dichroïde spiegel, BS = straal splitter, RM = reflecterende spiegel. De golflengte van confocale scanning laser is 488 nm/532 nm/635 nm, en het typische collectie golflengte interval van fluorescentie is < 560 Nm/560-625 nm/> 625 nm. De fiber femtosecondelaser laser (1.040 nm, 120 FS, 50 MHz, 1 W) kan worden vervangen door een Ti = saffier laser (810 nm, 80 MHz, 65 FS, 1 W) of andere commerciële femtosecondelaser Laser oscillatoren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: in Stim-A-modus, de lokalisatie en de grootte van femtosecondelaser laser focus op de doelcel op confocale Imaging vlak onder Bright-felid Imaging. (A) femtosecond laser wordt geblokkeerd door de sluiter. (B) femtosecond laser is ingeschakeld. Pijl: de referentie pijl is ingesteld in het midden van FOV om te bevestigen dat de femtosecondelaser laser focus de juiste positie lokaliseert. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: de Petri schaal gebruikt voor celkweek, transfectie en foto stimulatie experimenten. A) de 35 mm Petri schaal met een 15 mm diameter en 0,17 mm dikte glasbodem. B) de 35 mm Petri schaal met een glazen bodem en een bedrukt 500 μm cellocatie raster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: het incubatie systeem CO2 . A) de broed fase van co2 en (B) het bedieningspaneel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: ERK fotoactivering met behulp van de Stim-A-modus. (A) enkele foto stimulus (1.040 nm, 40 mW, 0,1 s) INDUCEERT ERK2-GFP translocatie in Nucleus en vervolgens terug naar cytoplasma. B) ERK2 signaal patroon gemedieerd door enkele femtosecondelaser Laser blootstelling (rode pijl, 1.040 nm, 40 mW, 0,1 s) en twee foto stimulaties (groene pijlen, 810 nm, 30 mW, 0,1 s). C) ERK-activering in omringende cellen door enkele korte femtosecondelaser Laser blootstelling in doelcel (witte pijl, 810 nm, 24 mW, 0,2 s). D) de immunofluorescentie van EIF4E-P vertoont een significante toename van 24 uur na een enkelvoudige foto simulatie (810 nm, 25 mW, 0,2 s). Schaal staaf = 10 μm (A) en 20 μm (B, C). De fluorescentie van ERK2-GFP en eIF4E-P wordt opgewekt door 488 nm excitatie laser en verzameld in < 560 Nm kanaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: meerdere mitochondriën gebeurtenissen geïnduceerd door foto stimulatie onder Stim-A modus. A) excitatie van mitoflash op de gestimuleerde mitochondriale tubulus door een enkele stimulus (810 nm, 16 mW, 0,1 s). B) mitochondriën morfologische fragmentatie en restauratie geïnduceerd door enkelvoudige foto stimulatie (1.040 nm, 30 mW, 0,1 s). C) oscillatie van het mitochondriale membraan potentieel door enkele femtosecondelaser Laser stimulatie (1040 nm, 20 mW, 0,1 s). De pijlen in a) B) en C) geven de positie van de fotostimulaties aan. Schaalbalk = 10 μm. De fluorescentie van Mito-GFP of MT-cpYFP wordt opgewekt door 488 nm excitatie laser en verzameld in < 560 Nm kanaal. De fluorescentie van TMRM wordt opgewekt door 532 nm excitatie laser en verzameld in 560-625 nm kanaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 FS, 80 MHz 20-65 mW 10-60 mW 5-50 mW 5-40 mW
1040 nm, 120 FS, 50 MHz 30-100 mW 20-80 mW 15-70 mW 10-60 mW

Tabel 1: Aanbevolen stimulatie duur en gemiddeld vermogen van femtosecondelaser laser in Stim-A-modus.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 FS, 80 MHz 25-40 mW 20-30 mW 15-25 mW 10-25 mW
1040 nm, 120 FS, 50 MHz 40-60 mW 30-50 mW 25-40 mW 20-30 mW

Tabel 2: Aanbevolen stimulatie duur en gemiddeld vermogen van femtosecondelaser laser in Stim-A-modus bij 2 x 2-3 x 3 μm 2 in cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We demonstreren een foto stimulatie strategie door een femtosecondelaser laser te combineren met een laser scanning confocale Microscoop systeem. De foto stimulatie kan direct werken als een twee-Fobe microscopie door Stim-B dienovereenkomstig te definiëren. We bieden een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een korte flits van femtosecondelaser laser om ERK-signalering of mitoflitsen in doelcellen te activeren. De verschillende stimulatie modi kunnen worden uitgevoerd volgens verschillende experimentele doeleinden en systemen. STIM-A kan eenvoudig worden ingesteld op basis van een confocale Microscoop. De femtosecondelaser laser kan worden gefocust op diffractie-limiet niveau in het FOV Center. Het subcellulaire doel moet handmatig naar de femtosecondelaser laser focus positie worden verplaatst en kan worden gestimuleerd voor willekeurige duur, volledig onafhankelijk van confocale microscopie. Daarom, STIM-A kan het monster dat is buiten het aandachtsgebied perfect te beschermen en is geschikt voor lange-duur foto stimulatie. Het stimulatie gebied van Stim-B kan vooraf worden gedefinieerd als elk gebied in de FOV. Het kan automatisch worden uitgevoerd. Maar de stimulatie duur en belichtingstijd kunnen alleen volgen met de confocale scanning. Nadat u de dwelltijd van elke pixel en de totale framegrootte hebt ingesteld, is de duur van de stimulatie in een enkel microscopie frame daadwerkelijk vast. De foto stimulatie kan ook periodiek per frame worden uitgevoerd. Het kan ook worden gebruikt om fotosensibilisatoren en optogenetische eiwitten te activeren die minder blootstellingsduur nodig hebben, maar een groot gebied.

Een kritische overweging in dit protocol is hoe de parameters van femtosecondelaser Laser stimulatie te bepalen. Volgens onze vorige studies, de cellulaire moleculaire activiteit wordt meestal geïnduceerd door multiphoton belastingsvorderingen17,21,22,23,24,25. Over het algemeen multiphoton belastingsvorderingen efficiency is gerelateerd aan alle femtosecondelaser laser parameters inclusief golflengte, pulsbreedte, herhalingssnelheid. De cellulaire respons is verder gerelateerd aan het Laser vermogen, de stimulatie positie/-regio en de blootstellingsduur tegelijk. In principe conflicteert de stimulatie efficiëntie met de celveiligheid. Sterkere foto stimulatie zoals een hoger gemiddeld vermogen, langere stimulatie duur en grotere totale incident laser energie draagt bij tot hogere stimulatie efficiëntie, maar brengt een hoger risico op celbeschadiging. Aangezien deze parameters ook relatief zijn met elkaar en allemaal bijdragen aan het effect van stimulatie en schade, is het onmogelijk om slechts één parameter te gebruiken, zoals de totale incident laser energie, of laser gemiddeld vermogen, om te definiëren dat het veilig is of niet. Gezien zowel de efficiëntie van de signaal activering als de celveiligheid, bieden we hier de aanbevolen gemiddelde kracht en stimulatie duur van twee femtosecondelaser-laserbronnen voor referentie in tabel 1 en tabel 2. Behalve, de parameters van femtosecondelaser Laser stimulatie moet worden gewijzigd volgens het eigenlijke optische systeem en biologisch monster.

Volgens de bovenstaande discussies zijn we van plan om meer gedetailleerde effectieve bereiken van photostimulatie parameters te presenteren. De golflengte van femtosecondelaser laser kan worden gewijzigd op het NIR-bereik dat wordt gebruikt voor foto stimulatie. De pulsbreedte moet kort zijn om een hoog piekvermogen en een hoge niet-lineaire exactie-efficiëntie te bieden. Lange pulsduur wordt niet aanbevolen voor dit protocol. Meestal is de typische pulsbreedte voor twee-photon microscopie (< 200 FS) de juiste keuze. De herhalingssnelheid van de laser is geen belangrijke factor. De herhalingsfrequentie tot MHz is geschikt voor dit protocol. De meest kritische factor voor cellulaire moleculaire responsen is de laser kracht en stimulatie duur van femtosecondelaser laser. Voor het activeren van ERK, volgens ons vorige werk22, zijn het gemiddelde vermogen bij 15 mw (810 nm) of 20 mW (1.040 nm) en de blootstellingsduur bij 0,2 s voldoende om voldoende stimulatie te bieden om ERK-signalering te activeren met behoud van de levensvatbaarheid van de ultrahoge cel in HeLa-cellen. Integendeel, het gemiddelde vermogen over 80 mW (810 nm) of 120 mW (1.040 nm) en de blootstellingsduur langer dan 1 s kan leiden tot onherstelbare schade aan cellen. Mitochondriën zijn over het algemeen gevoeliger voor foto stimulatie. De stimulatie met een gemiddeld vermogen hoger dan 40 mW (810 nm) of 80 mW (1.040 nm) en de blootstellingsduur over 0,2 s kan aanzienlijke schade veroorzaken, zoals onomkeerbare fragmentatie in gestimuleerde mitochondrion of zelfs in alle mitochondriën over de hele cel. Opgemerkt moet worden dat de lichtgevoeligheid van mitochondriën tot foto stimulatie veel varieert in verschillende celtypen. In HeLa-cellen heeft het Laser vermogen bijvoorbeeld slechts ongeveer 6 mW (810 nm, 0,1 s duur) nodig. Alle mitochondriën kunnen reageren op de foto stimulatie in de vorm van fragmentatie, mitoflashes, en MMP oscillaties. Maar in menselijke mesenchymale stamcellen, moet de kracht worden verhoogd tot ongeveer 15 mW (810 nm, 0,1 s duur), en nog steeds ongeveer half gestimuleerde mitochondriën vertonen geen reactie op foto stimulatie. In de Stim-B-modus kan een andere factor de efficiëntie van de foto-activering beïnvloeden en de celbeschadiging is het stimulatie gebied. De foto stimulatie kan celbeschadiging veroorzaken door op een klein stimulatie gebied te leveren. Maar dezelfde stimulatie kan de ERK niet activeren door op een groter stimulatie gebied te leveren. We raden aan dat het stimulatie gebied in de doelcel ongeveer 2 x 2-3 x 3 μm2 is en niet hoger is dan 25 μm2.

De lokalisatie van het stimulatie gebied is ook belangrijk voor de toepassing van dit protocol. Volgens eerdere werken17,22, de foto stimulatie in dat gebied kan afbreken de CA2 + opslaan in er effectief en activeer het CRAC-kanaal. Dan, de CA2 + toestroom kan ERK signalering traject vervolgens activeren. Daarom raden we aan om de foto stimulatie op de ER-regio in HeLa-cellen te leveren om een hoge ERK-activerings efficiëntie te bereiken. De ER-regio kan gemakkelijk worden onderscheiden van cytoplasma of Nucleus onder fel-veld microscopie door een fase-contrast doel. Met het oog op de invoering van mitochondriale signalering van gebeurtenissen, de focus van femtosecondelaser laser kan eenvoudig worden gemonteerd op de geselecteerde mitochondriale structuur na de bijbehorende procedures.

De in dit protocol beschreven fotostimulatie methoden kunnen ook worden gebruikt om andere meervoudige cellulaire gebeurtenissen te beïnvloeden, zoals het induceren van CA2 + en Ros-signalen17,20,21. Opgemerkt moet worden dat al die eerdere werken de evaluatie van de celveiligheid hebben gegeven na foto stimulatie. Bijvoorbeeld, belangrijke morfologische veranderingen van cellen, borrelen, mitochondriale fragmentatie en zwelling van de hele cel, verminderde proliferatie van cellen, en enkele andere ongewone veranderingen van de fluorescentie tijdens confocale microscopie impliceren een hoge celbeschadiging. Het moet heel voorzichtig zijn om de celstatus te bewaken. Niettemin, met goed beheer van de laser Power en stimulatie parameters, de levensvatbaarheid van de cel kan worden gehandhaafd op een zeer hoog niveau gelijktijdig met hoge stimulatie efficiëntie. Vandaar, deze fotostimualtion methode van femtosecondelaser laser is van goed potentieel om verder uit te breiden naar meer gebieden en toegepast in relevante toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgments

Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81571719 en 81661168014, 81673014 en 81870055), het Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 en 16XD1403100), en het National key R & D plan (2017YFA0104600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Tags

Biologie uitgave 149 femtosecondelaser laser foto stimulatie extracellulaire-Signal-gereguleerd kinase (ERK) mitochondriën mitoflash biofotonicalabs
Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H.… More

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter