Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Микрофлюидная платформа для стимулирования хондроцитов с динамическим сжатием

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

В этой статье приводятся подробные методы изготовления и характеристики пневматически актуального микрофлюидного устройства для сжатия хондроцитов.

Abstract

Механические стимулы, как известно, модулировать биологические функции клеток и тканей. Недавние исследования показали, что сжатие стресса изменяет архитектуру пластины роста и приводит к модуляции роста длинных костей детей. Чтобы определить роль сжатия в росте костей, мы создали микрофлюидное устройство, действие которого сопровождается пневматическим давлением, чтобы динамически (или статически) сжать рост плиты хондроциты, встроенные в альгинатные гидрогелевые цилиндры. В этой статье мы описываем подробные методы изготовления и характеристики этого устройства. Преимущества нашего протокола: 1) Пять различных величин сжатия стресса могут быть созданы на пяти технических репликатов в одной платформе, 2) Легко визуализировать морфологию клеток с помощью обычного светового микроскопа, 3) Клетки могут быть быстро изолированы от устройства после сжатия для облегчения вниз по течению анализы, и 4) Платформа может быть применена для изучения механобиологии любого типа клеток, которые могут расти в гидрогелях.

Introduction

Микро-инженерные платформы являются ценными инструментами для изучения молекулярной, клеточной и тканевой биологии уровня, поскольку они позволяют динамический контроль как физической и химической микросреды1,2,3 ,4,5,6,7,8. Таким образом, несколько гипотез могут быть одновременно проверены в строго контролируемой манере. В случае роста пластины хряща, Есть все больше доказательств важной роли сжатия стресса в модуляции роста костей через действие на рост пластины хряща9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Однако механизм действия сжимаемого стресса - в частности, как стресс направляет образование хондроцитов в ростовой пластине - плохо понятен.

Целью этого протокола является создание пневматически актуирующего микрофлюидного хондроцитного компрессионного устройства26 для выяснения механизмов механобиологии в хондроцитах пластины роста(рисунок 1a-c). Устройство состоит из двух частей: пневматического актуационного блока и конструкции альгината геля. Микрофлюидный пневматический актуационный блок изготавливается с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) на основе фото- и мягкой литографии. Это устройство содержит 5 х 5 массив тонких PDMS мембранных шаров, которые могут быть завышены по-разному в зависимости от их диаметров. Конструкция гель-альгината состоит из хондроцитов, встроенных в массив альгината гель 5, а все конструкции альгината-хондроцитов собраны с помощью актуационного блока. Конструкции гель альгината сжаты пневматически надутыми воздушными шарами PDMS(рисунок 1b). Микрофлюидическое устройство может генерировать пять различных уровней сжатия одновременно в одной платформе на основе различий в диаметре шарика PDMS. Таким образом, возможно высокое пропускное тестирование хондроцитной механобиологии при множественных условиях сжатия.

Микрофлюидическое устройство, описанное в этом протоколе, имеет много преимуществ перед обычным истрижным устройством сжатия, таким как внешние фиксаторы14,21,23 и макроскопические устройства сжатия16, 19 лет , 27 , 28 для изучения хондроцитов механобиологии: 1) Микрофлюидическое устройство является экономически эффективным, поскольку оно потребляет меньший объем образцов, чем макроскопическое устройство сжатия, 2) Микрофлюидическое устройство является эффективным временем, потому что он может проверить несколько условия сжатия одновременно, 3) Микрофлюидическое устройство может комбинировать механические и химические стимулы, образуя градиент концентрации химических веществ на основе ограниченного смешивания в микроканалах, и 4) Различные методы микроскопии (временной промежуток микроскопии и флуоресценции конфокальной микроскопии) могут быть применены с микрофлюидным устройством из прозрачного PDMS.

Мы приняли и модифицировали метод Moraes et al.7,29 для создания различных уровней сжатия в одном устройстве, чтобы обеспечить высокопроизводительные исследования механобиологии сжатия хондроцитов. Наш подход подходит для клеток (например, хондроцитов), которым необходима трехмерная (3D) культурная среда и для биологических анализов после сжатия клеток. Хотя некоторые микрофлюидные устройства сжатия клеток могут сжимать клетки, культивированные на двухмерных (2D) субстратах30,31,32, они не могут быть использованы для хондроцитов, потому что 2D культивированные хондроциты dedifferentiate. Существуют микрофлюидные платформы для сжатия 3D-культурных клеток в фотополимеризованных гидрогелях7,33,но они ограничены в изоляции клеток после экспериментов по сжатию, потому что изолирующие клетки от фотополимеризованных гидрогель не легко. Кроме того, влияние ультрафиолетового (УФ) воздействия и фото перекрестных инициаторов на клетки, возможно, потребуется оценить. В отличие от этого, наш метод позволяет быструю изоляцию клеток после экспериментов по сжатию для постбиологических анализов, потому что альгинатные гидрогели могут быть быстро деполимеризированы хеляторами кальция. Подробные методы изготовления и характеристики устройства описаны в этом протоколе. Краткая процедура изготовления микрофлюидного устройства сжатия хондроцитов показана на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты (PPE), такие как перчатки и лабораторное пальто для каждого шага в этом протоколе.

1. Мастер формовка изготовления

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 1.1 - 1.3 в капюшоне дыма.

  1. Стеклянная обработка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Носите щит, перчатки и лабораторное пальто для шага 1.1.
    1. Сделать Piranha раствор (60 мл) путем смешивания серной кислоты (H2SO4) и перекиси водорода (H2O2) с коэффициентом объема 3:1.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте раствор Piranha и ацетон в том же капоте дыма из-за опасности взрыва.
    2. Поместите стеклянную пластину (50,8 мм и 76,2 мм и 1,2 мм) в раствор Пиранья в течение 30 минут при 40 градусах Цельсия.
    3. Промыть стеклянную тарелку деионизированной водой (diH2O).
    4. Поместите стеклянную тарелку в ацетон при комнатной температуре в течение 10 мин.
    5. Промыть стеклянную пластину изопропанолом и высушить с помощью азота (N2) газа.
    6. Выпекать стеклянную тарелку при температуре 200 градусов по Цельсию в течение 20 минут на горячей тарелке. Все последующие шаги выпечки используют горячую тарелку.
  2. Формирование семенного слоя СУ-8 на стеклянной пластине
    1. Распространение SU-8 5 на стеклянной пластине с одноразовой пипеткой, чтобы покрыть около 2/3 поверхности пластины.
    2. Спин стеклянная пластина с SU-8 5 photoresists на 500 об/мин для 35 с (первоначальный цикл вращения), а затем 2500 об /мин для 40 s (окончательный цикл вращения) с помощью спин-шут. Все последующие шаги спинного покрытия включают один и тот же начальный цикл вращения.
    3. Выпекать Су-8 5 покрытием стеклянной пластины на 65 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
    4. Вынаняем стеклянную пластину SU-8 5 покрытой ультрафиолетовым светом (60 мВт/см2,расстояние между ультрафиолетовой лампой и фотомаской составляет 20 см, общее количество энергии УФ-излучения 60 мДж/см2)на 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время воздействия УФ-излучения должно быть скорректировано в соответствии с мощностью используемого УФ-излучения.
    5. Выпекать су-8 5 покрытием стеклянной пластины на 65 градусов по Цельсию в течение 2 мин и при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
    6. Поместите запеченную стеклянную пластину в застройщика СУ-8 на 2 мин.
    7. Выпекать стакан SU-8 5 с покрытием при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
  3. Изготовление шаблона канала СУ-8 с использованием фотолитографии(рисунок 2a Шаг 1-3)
    1. Налейте SU-8 100 на СУ-8 5 посеянной стеклянной пластине, чтобы покрыть около 2/3 площади поверхности пластины.
    2. Спин стеклянная пластина с SU-8 100 при 3000 об/мин на 38 с (толщиной 90 мкм).
    3. Выпекать су-8 100 покрытием стеклянной пластины на 65 градусов по Цельсию в течение 10 мин, а затем при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Если СУ-8 100 все еще липкая после этой процедуры, выпекать стеклянную пластину в течение более длительного времени при температуре 95 градусов по Цельсию, пока Su-8 100 не станет нелипкой.
    4. Поместите фотомаску микроканала высокого разрешения (25 400 dpi, см. Дополнительную рисунок 1) на стеклянной пластине SU-8 100 и разоблачите фотомаску, покрытую стеклянной пластиной, на уф-свет для 4 с (общее количество энергии УФ-излучения 240 мДж/см2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время воздействия УФ-излучения должно быть скорректировано в соответствии с мощностью используемого УФ-излучения.
    5. Снимите фотомаску со стеклянной тарелки и выпекайте стеклянную тарелку при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем 95 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
    6. Держите запеченную стеклянную пластину в контейнере, который обернут алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать любой свет, для ночного лечения.
    7. Разработка узоров канала СУ-8 100 на стеклянной пластине в разработчике СУ-8 за 15 мин.
    8. Вымойте цузорную стеклянную пластину SU-8 (мастер-плесень) с изопропиловым спиртом и высушите ее газом N2. Если белые частицы остаются во время этого процесса, повторите шаг 7 в течение 5 минут.

2. Пневматический актуационный блок

  1. Слой микроканала (слой 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 2.1.1 - 2.1.2 в капюшоне дыма.
    1. Падение 200 Зл (Tridecafluoro-1,1,2,2-Тетрагидрооктил)-1-Трихлоросилан на крышку и поместите его в вакуумную камеру с мастер-плесень.
    2. Нанесите вакуум на 2 мин в камере и ждать 6 ч (или на ночь) для силанизации формы.
    3. Смешайте PDMS с соотношением веса 10:1 (преполимер: лечебное средство) в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаглить PDMS содержит такое же отношение веса prepolymer и лечебного агента (10:1).
    4. Налейте PDMS на мастер плесени и дегазPD в вакуумной камере в течение 30 минут.
    5. Сэндвич PDMS с куском пленки прозрачности.
    6. Зажим выше зажатой сборки со стеклянной пластиной, пены колодки и плексиглас пластин(рисунок 2a Шаг 4).
    7. Лечить PDMS в духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 6 ч.
    8. Изолировать слой PDMS (слой 1) с прозрачной пленкой из зажатой структуры(рисунок 2a Шаг 5).
    9. Активируйте поверхности слоя 1 и чистую стеклянную пластину (Стеклянная пластина 1; 50,8 мм и 76,2 мм и 1,2 мм) с помощью плазменного очистителя на 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время очистки плазмы может варьироваться в зависимости от мощности используемого плазменного очистителя.
    10. Скрепление Слой 1 на стеклянную пластину 1 и поместите их в духовку при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
    11. Удалите пленку прозрачности с слоя 1.
  2. Тонкая мембрана PDMS (слой 2)
    1. Спин пальто невылеченных PDMS на пленку прозрачности на 1000 об/ ч в течение 1 мин, чтобы получить 60 мкм толщиной слой PDMS.
    2. Частично вылечить спин покрытием PDMS (слой 2) в духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 20-30 мин.
    3. Активируйте слой 1 на стеклянной пластине 1 и слой 2 с помощью плазменного очистителя в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время очистки плазмы может варьироваться в зависимости от мощности используемого плазменного очистителя.
    4. Скрепите слой 2 на слой 1 и поместите их в духовку при температуре 80 градусов цельсия на ночь.
  3. Трубчатый блок
    1. Поместите металлические трубки вертикально на чашку Петри.
    2. Аккуратно залить PDMS в блюдо, чтобы погрузить около 3/4 металлических труб.
    3. Лечить PDMS в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 6 ч (или на ночь).
    4. Вырежьте кусок блока PDMS, содержащий одну металлическую трубку.
    5. Пронизойи отверстие на слое 2 для входе.
    6. Активируйте блок PDMS и слой 2 с помощью плазменного очистителя в течение 1 мин.
    7. Прикрепите блок PDMS на входе в часть слоя 2 и поместите весь актуационный блок в духовку при температуре 80 градусов по Цельсию на ночь.

3. Алгинат-хондроцит (или бисиня) конструкций

  1. Амино-силаносизированная стеклянная пластина
    1. Разрежьте стеклянную пластину (50,8 мм и 76,2 мм и 1,2 мм) на две полуразмерные стеклянные пластины (50,8 мм и 38,1 мм и 1,2 мм) с помощью алмазного писца.
    2. Поместите стеклянные пластины в 0,2 М хлорида водорода (HCl) и осторожно встряхните (например, 55 об/мин) их на ночь.
    3. Промыть стеклянные пластины с diH2O.
    4. Встряхните стеклянные пластины в 0,1 М гидроксида натрия (NaOH) в течение 1 ч при 55 об/мин и промойте их диГ2О.
    5. Встряхните стеклянные пластины в 1% (v/v) 3-аминопропилтриметоксилана (APTES) на 1 ч при 55 об/мин и промойте их диГ2О.
    6. Высушите амино-иланизированные стеклянные пластины в дымовом капюшоне на ночь.
  2. Агарозе гель плесень для альгината гель конструкций
    1. Смешайте 5% (w/v) агароз и хлорид кальция 200 мм (CaCl2) в diH2O.
    2. Отварить раствор геля агарозы микроволновой печи (или горячей тарелкой). Время кипения варьируется в зависимости от объема раствора геля агарозы и мощности микроволновой печи (или температуры горячей тарелки).
    3. Налейте вареный раствор геля агарозы на алюминиевую форму (см. Дополнительную рисовую форму S2),и зажгите его стеклянной тарелкой.
    4. Подождите 5 минут и unmold затвердеваемого геля агарозы из алюминиевой формы.
  3. Урожай плиты роста
    1. Изолировать рост пластин от задних конечностей неонатальных мышей.
    2. Поместите пластины роста в 1 мл 0,25% коллагенеза на 3 ч в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 8% углекислого газа (CO2),чтобы удалить внеклеточной матрицы (ECM).
    3. Centrifuge переваренный образец в течение 5 мин на 125 х г, чтобы сделать хондроцита гранулы и удалить супернатант из образца. Здесь 1 х г - это ускорение гравитации.
    4. Отрептуйте гранулы хондроцита в 1 мл модифицированной среды Орла Dulbecco (DMEM).
    5. Подсчитайте количество хондроцитов в DMEM с помощью счетчика клеток.
    6. Centrifuge хондроцитов в DMEM в течение 5 мин на 125 х г, чтобы сделать хондроцита гранулы снова и удалить супернатант из образца.
    7. Дополнительно, resuspend хондроцита гранулы в хондроцитов культуры средств массовой информации (CCM)34, содержащий 2 мкм кальцина AM, и инкубировать образец на 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Повторите шаг 3.3.6 и перейти к шагу 3.3.8.
    8. Приостановите гранулы хондроцита в нужном объеме СКК и держите их в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 8% CO2 перед использованием.
  4. Алгинат-хондроцит (или бисины) конструкции(Рисунок 2c)
    1. Смешайте 1,5% (w/v) альгинат в фосфатно-буферизированном солене (PBS) с 5 мг/мл сульфо-ГСЗ, 10 мг/мл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодимидгидроид гидрохлорид (ЭДК).
    2. Добавьте 8 х 106 хондроцитов в 1 мл раствора альгината геля (или Добавьте 3 л из 1 мкм-диаметр флуоресцентных бусин (542/612 нм) в 1 мл раствора альгината геля (0,3% (v/v)) .
    3. Поместите 150 л раствора альгинат-хондроцита (или бисера) на амино-иланизированную стеклянную пластину, изготовленную в шаге 3.1.
    4. Обложка раствор гель альгината с формой геля агарозы в течение 3 мин.
    5. Удалите чрезмерное раствор гель альгината переполнены из формы геля агарозы с лезвием бритвы и удалить форму геля агарозы. Затем на амино-исилано-стеклянной пластине получаются цилиндрические альгинатно-хондроцитные конструкции (или бисера).
    6. Поместите конструкции альгината-хондроцита в кросс-связывающее решение (50 мМ CaCl2 / 140 мМ NaCl в diH2O) в течение 1 мин для дальнейшей полимеризации.

4. Сборка устройства (рисунок 2d)

ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS прокладки и 3D печатные зажимы должны быть подготовлены отдельно.

  1. Найдите четыре PDMS-пространства толщиной 1 мм на четырех углах слоя 2 приводного блока.
  2. Поместите 700 кл Л СКК, чтобы покрыть воздушные камеры слоя 2.
  3. Поместите альгинат-хондроциты (или бисо) конструкции на слой 2 при тщательном выравнивании конструкций с воздушными камерами.
  4. Зажим устройства с 3D печатных зажимов(рисунок 1c).

5. Активация устройства

  1. Соедините розетку воздушного насоса (см. Таблица Материалов)с впуском соленоидного клапана с кремниевым трубкой.
  2. Соедините розетку соленоидного клапана с впуском собранного устройства с помощью кремниевых труб.
  3. Соедините соленоидный клапан с генератором функции.
  4. Манипулируйте соленоидным клапаном с помощью квадратной волны (например, 1 Гц), генерируемой генератором функций.
  5. Включите воздушный насос, чтобы включить устройство пневматически.

6. Изображение хондроцитов в устройстве

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить хорошее качество изображения, изображения хондроцитов (или флуоресцентных бусин) в альгината гель через стеклянную пластину 2, потому что расширенные PDMS воздушные шары и воздушные камеры могут исказить оптические изображения. Если перевернутый микроскоп используется для визуализации, устройство должно быть настроено таким образом, чтобы стеклянная пластина 2 была обращена вниз.

  1. Приготовьте устройство с хондроцитами (или флуоресцентными бусинами), как показано на предыдущих разделах.
  2. Возьмите z-stackизображения хондроцитов (или флуоресцентных бусин) с конфокальный микроскоп до и под сжатием, соответственно. Выберите размер z-шагна основе глубины поля используемой системы конфокальной визуализации.
  3. Высота хондроцитов (или конструкции альгината-биса) может быть измерена с помощью автоматического метода обработки изображений, показанного в предыдущих литературах26,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этой статье показаны подробные шаги микрофлюидного хондроцита компрессионного устройства изготовления(рисунок 2). Устройство содержит 5 х 5 массивов цилиндрических конструкций альгината-хондроцитов, и эти конструкции могут быть сжаты с пятью различными величинами сжатия (Рисунок 1, Рисунок 3 и Рисунок 4). Высота пневматического микроканала составляет около 90 мкм, а диаметр ы pdMS шара 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 и 2,0 мм, соответственно. Производительность устройства была количественно с помощью конфокальной микроскопии с статическими условиями сжатия и обработки изображений. Статическое сжатие было использовано для микроскопической визуализации, потому что изображения z-stackс конфокальной микроскопией занимает несколько минут, поэтому это слишком медленно для количественной визуализации во время динамического сжатия.

На рисунке 3а показаны 5 и 5 массивов альгинатных гидрогелевых колонн (диаметр: 0,8 мм, высота: 1 мм), отлитые на стеклянной пластине 2. Эти гель конструкции были изображены путем добавления флуоресцентные бусы в гель. На рисунке 3b показан пример, что столбец геля был сжат на 33,8% в высоту крупнейшим воздушным шаром PDMS. Резцовый сжатие струй геля конструкций увеличилось примерно на 5% на 0,2 мм приращения в диаметре шара PDMS, как показано на рисунке 3c.

Компрессионная деформация хондроцитов была определена путем визуализации клеток в 613 мкм 613 мкм 40-55 мкм(х й й й z) объем вблизи центра конструкции геля, как показано на рисунке 4a. На рисунке 1d показанпримерный образ хондроцита, который был сжат на 16% самым большим воздушным шаром PDMS. На рисунке 4b показано распределение измеренных значений штамма сжатия клеток, а общие клетки были сжаты более более большими воздушными шарами PDMS. Таким образом, количество альгината гель и хондроцитов сжатия контролировались диаметром PDMS шары(Рисунок 3 и Рисунок 4) с постоянным давлением 14 кПа.

Figure 1
Рисунок 1. Микрофлюидный хондроцитов компрессионное устройство.
()Схема собранного устройства. Массив альгинатно-хондроцитных конструкций 5 и 5 хондроцитов выровнены на воздушных шарах PDMS с 5 различными диаметрами(D 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 и 2,0 мм), где D представляет диаметр воздушного шара PDMS (или воздушной камеры). (b)Схема работы устройства. Устройство приводится в действие пневматическим давлением, которое расширяет воздушные шары PDMS. (c)Изображение фактического устройства (диаметр монеты - 19 мм). (d)Вертикальные поперечные сечения хондроцита до (слева) и под (справа) сжатия на самом большом шарике PDMS(D 2.0 мм) (клеточный компрессионный штамм,ячейка , изменение высоты клетки /начальная высота ячейки. Эта цифра воспроизводится из 26.

Figure 2
Рисунок 2. Детальные шаги производства микрофлюидного хондроцитного компрессионного устройства.
()Фотолитография для генерации су-8 мастер плесени и после мягкой литографии для создания слоя PDMS с пневматическими микроканалами (слой 1). (b)Тонкая мембрана PDMS (слой 2) на пленке прозрачности, генерируемой спин-покрытием. (c)Цилиндрический метод литья геля на стекле (Стеклянная пластина 2). (d)Сборка микрофлюидного устройства сжатия хондроцитов. Эта цифра воспроизводится из 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Измерение деформации гель альгината при статичном сжатии.
(a) 5 х 5 массивов цилиндрических альгината гель конструкций (диаметр: 800 мкм, высота: 1 мм). (b)Гель-альгинат, сжатый самым большим воздушным шаром PDMS(D и 2,0 мм). Сжатие штамма гель-альгината составляет 33,8%. (c)Компрессивный штамм альгината гель(гель) увеличивается примерно на 5% на 0,2 мм приращения диаметра шарика PDMS (D). Панель ошибок: стандартное отклонение. Красная линия: линейная фитинговая линия Эта фигура воспроизводится из 26.

Figure 4
Рисунок 4. Измерение деформации хондроцитов при статичном сжатии.
(a ) Az-stack изображение no 613 мкм 613 мкм и 40-55 мкм(х й й й z z)» было получено в середине конструкции геля, 300-400 мкм от дна геля. (b) Различные величины хондроцитов сжатия штамма(ячейки) в результате, как функция диаметра шара PDMS (D). Icon : средние значения. Icon : каждая точка данных. Верхние (или нижние) и средние линии коробки являются стандартным отклонением и средним значением, соответственно. Эта цифра воспроизводится из 26.

Рисунок S1. Дизайн фотомаски микроканала для шага 1.3.4 (единица и мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Рисунок S2. Алюминиевая плесень дизайн для шага 3.2.3 (единица мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Рисунок S3. Постоянная деформация альгината геля (1,5%, ж/в) при динамике 1 ч -1 Гц и статическом сжатии. Эта цифра воспроизводится из 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы проверить влияние сжатия на хондроциты пластины роста, мы разработали микрофлюидный хондроцитов компрессионного устройства (Рисунок 1) применять различные уровни сжатия стресса хондроцитов в альгината гидрогель эшафот для 3D культуры высокой пропускной всей Чтобы помочь другим исследователям принять наше устройство или разработать аналогичные устройства, мы предоставили подробную информацию о шагах изготовления устройства в этой статье протокола.

Ключевыми шагами в этом протоколе являются 1) изготовление слоя PDMS с пневматическими микроканалами (слой 1) без пузырьков воздуха, так как пузырьки воздуха в слое 1 могут повредить пневматические микроканалы, в то время как пленка прозрачности поддержки снимается, 2) поддержание постоянная температура (например, 80 градусов по Цельсию) для лечения воздушных шаров PDMS (слой 2), потому что эластичность PDMS, как известно, зависит от температуры лечения36, 3) выравнивание альгината гель конструкций с PDMS шары, и 4) с использованием свежих амино-силовалстекла пластина (Стеклянная пластина 2) для склеивания алгинатных гелевых колонн на стеклянной пластине 2 в течение двух дней после засоления.

Основным ограничением этого протокола является то, что он является относительно трудоемким, чтобы изготовить устройство, потому что процесс включает в себя фотолитографию и несколько этапов мягкой литографии. Кроме того, производительность микрофлюидных устройств сжатия клеток, изготовленных на основе нашего протокола, должна оцениваться всякий раз, когда используются различные типы гидрогелей и клеток. Это связано с тем, что любые различия в механических свойствах гидрогелей и клеток будут влиять на производительность устройства.

Хотя наше устройство сжатия микрофлюидных клеток предназначено для применения динамического сжатия к хондроцитам, его производительность была оценена путем визуализации статически сжатых гелей и клеток. Это потому, что было трудно изображение гелей и клеток при динамическом сжатии с обычной конфокальной микроскопии. Мы сравнили статическое (14 кПа, 1 ч) и динамическое сжатие (14 кПа, 1 Гц, 1 ч) с точки зрения постоянной деформации альгината геля и обнаружили, что постоянная деформация геля при динамическом сжатии была незначительной по сравнению со статическим сжатием (см. Дополнительная фигура S3).

Одним из преимуществ нашего метода является то, что он может быть использован для других типов клеток, которые нуждаются в 3D-среде культуры. В результате сжатия устройства может быть модулирована в зависимости от применения путем изменения диаметра и толщины воздушных шаров PDMS и / или давление в воздушном шаре. Также можно изменить эластичность шарика PDMS, регулируя соотношение микширования между преполимером и лечебным агентом. Клетки в этом устройстве могут быть изображены в режиме реального времени с помощью световой/ флуоресценции микроскопии, и устройство может быть быстро разобран для сбора клеток, чтобы позволить вниз по течению анализа. Другим преимуществом является способность генерировать пять различных уровней механического стресса с пятью техническими репликациями на каждый уровень стресса с помощью одного устройства. Сочетание репликации и анализа дозы-реакции обеспечивает высокую степень строгости и воспроизводимости в результатах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим докторов Кристофера Мораеса и Стивена А. Морина за их поддержку в разработке и изготовлении устройств. Это исследование было поддержано биоинженерии для здоровья человека грант из Университета штата Небраска-Линкольн (UNL) и Университета штата Небраска медицинский центр (UNMC), и грант AR070242 от NIH / NIAMS. Мы благодарим Дженис А. Тейлор и Джеймса Р. Таласу (Janice A. Taylor) и Джеймса Р. Таласу (Janice A. Taylor) из Фонда расширенной микроскопии медицинского центра Университета штата Небраска за помощь в предоставлении помощи в обеспечении конфокальной микроскопии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).

Tags

Биоинженерия Выпуск 151 Микрофлюитика фотолитография мягкая литография хондроциты на основе роста механобиология клеточная механика алгинат гидрогель конфокальная микроскопия анализ изображений
Микрофлюидная платформа для стимулирования хондроцитов с динамическим сжатием
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A.… More

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter