Standardiseret og skalerbar analyse til undersøgelse af Perfuserende 3D Angiogen spiring af iPSC-afledte endotelceller in vitro

Summary

Denne metode beskriver kulturen af IPSC-afledte endotelceller som 40 perfbrugte 3D mikrofartøjer i en standardiseret mikrofluidisk platform. Denne platform muliggør studiet af gradient-drevet angiogen spiring i 3D, herunder anastomose og stabilisering af de angiogene spirer i en skalerbar og høj gennemløb måde.

Abstract

Præ-klinisk stof forskning af Vaskulære sygdomme kræver in vitro-modeller af Vaskulaturen, der kan ændres til high-gennemløb screening. Nuværende in vitro-Screenings modeller, der har tilstrækkelig kapacitet, har kun begrænset fysiologisk relevans, hvilket hindrer oversættelsen af fund fra in vitro til in vivo. På den anden side, mikrofluidisk cellekultur platforme har vist uovertruffen fysiologisk relevans in vitro, men ofte mangler den nødvendige gennemløb, skalerbarhed og standardisering. Vi demonstrerer en robust platform til at studere angiogenese af endotelceller afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC-ECs) i et fysiologisk relevant cellulært mikromiljø, herunder perfusion og gradienter. IPSC-ECs dyrkes som 40 perfbrugte 3D-mikrofartøjer mod et mønstret kollagen-1-stilladset. Ved anvendelse af en gradient af angiogene faktorer, vigtige kendetegn af angiogenese kan undersøgt, herunder differentiering i spids-og stilk celle og dannelsen af perfbrugelige lumen. Perfusion med fluorescerende Tracer farvestoffer gør det muligt at studere permeabilitet under og efter anastomose af de angiogene spirer. Afslutningsvis, denne metode viser gennemførligheden af iPSC-afledte ECs i en standardiseret og skalerbar 3D angiogen analyse, der kombinerer fysiologiske relevante kulturforhold i en platform, der har den nødvendige robusthed og skalerbarhed, der skal integreres i lægemiddel screening infrastrukturen.

Introduction

In vitro-modeller spiller en grundlæggende rolle i opdagelsen og validering af nye Drug mål for Vaskulære sygdomme. Nuværende in vitro-Screenings modeller, der har tilstrækkelig kapacitet, har kun begrænset fysiologisk relevans¹, hvilket hindrer oversættelsen af fund fra in vitro til in vivo. Således, at fremme præ-klinisk vaskulære stof forskning, forbedrede in vitro-modeller af Vaskulaturen er nødvendige, der kombinerer High-gennemløb screening med en fysiologisk relevante 3D cellulære mikro-miljø.

Inden for det seneste årti er der gjort betydelige fremskridt for at øge den fysiologiske relevans af in vitro-modeller af Vaskulaturen. I stedet for dyrkning endotelceller på flade overflader såsom væv-kultur plast, endotelceller kan indlejres i 3D stilladser, såsom fibrin og kollagen gels². Inden for disse matricer viser endotelcellerne en mere fysiologisk relevant fænotype forbundet med matrix nedbrydning og lumen dannelse. Men disse modeller kun demonstrere en delmængde af de mange processer, der opstår under angiogen spiring som vigtige signaler fra cellulære mikromiljø er stadig mangler.

Mikrofluidic cellekultur platforme er unikt egnet til yderligere at øge den fysiologiske relevans af in vitro-modeller af vasculature. For eksempel kan endotelceller blive udsat for forskydnings stress, som er en vigtig Biomekanisk stimulus til vasculature. Muligheden for at kontrollere væsker inden for mikrofluidics giver også mulighed for dannelse af biomolekulære gradienter^3,4,5,6. Sådanne gradienter spiller en vigtig rolle in vivo under dannelsen og mønstret under angiogenesis. Men mens mikrofluidisk cellekultur platforme har vist uovertruffen fysiologisk relevans over traditionelle 2D og 3D cellekultur metoder, de ofte mangler den nødvendige gennemløb, skalerbarhed og standardisering, der er nødvendig for Drug screening ⁷. også, mange af disse platforme er ikke kommercielt tilgængelige og kræver, at slutbrugerne til at mikrofabrikere deres enheder før brug⁸. Dette kræver ikke kun fremstillings apparater og teknisk viden, men begrænser også kvalitetskontrol niveauet og påvirker reproducerbarhed⁹negativt.

Til dato, primære humane endotelceller forbliver den mest udbredte celle kilde til model angiogenese in vitro¹⁰. Men, primære humane celler har en række begrænsninger, der hindrer deres rutine anvendelse i screening tilgange. For det første er der en begrænset mulighed for at skalere op og udvide primær celle-afledte kulturer. For store forsøg skal der således anvendes partier fra forskellige donorer, hvilket resulterer i genomforskelle og variationer fra batch til batch. For det andet, efter et par passager, primære endotelceller generelt mister relevante egenskaber, når kultiveret in vitro^11,12.

Endotelceller afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC) er et lovende alternativ: de ligner primære celler, men med en mere stabil genotype, der også er modtagelig for præcis genomredigering. Desuden, iPSCs er i stand til at selv forny og dermed kan udvides i næsten ubegrænsede mængder, som gør iPSC-afledte celler et attraktivt alternativ til primære celler til brug inden in vitro screening modeller¹³.

Her beskriver vi en metode til kultur endotelceller som perfbrugelige 3D-mikrobeholdere i en standardiseret, højt gennemløb mikrofluidisk cellekultur platform. Perfusion påføres ved at placere enheden på en rocker platform, som sikrer robust drift og øger skalerbarheden af analysen. Da mikroskibene kontinuerligt anvendes og udsættes for en gradient af angiogene faktorer, undervises angiogen spiring i et mere fysiologisk relevant cellulært mikromiljø. Mens protokollen er kompatibel med mange forskellige kilder til (primære) endotelceller^14,15, fokuserede vi på at bruge humane IPSC-afledte ECs for at øge standardiseringen af denne analyse og for at lette dens integration inden for vaskulære stof forskning.

Protocol

1. klargøring af enheden

1. Overfør mikrofluidisk 384-brønd pladen til en steril laminar-flow hætte.
2. Fjern låget, og tilsæt 50 μL vand eller fosfat-bufferet saltvandsopløsning (PBS) til hver af de 40 observation brønde (figur 1b, godt B2) ved hjælp af en multikanals eller gentaget pipette.
   Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Lad pladen stå med låget på i det sterile kultur kabinet ved stuetemperatur (RT).

2. Forbered gel og belægning

1. Forbered 2,5 ml 10 μg/ml fibronektin (FN) belægning opløsning. 25 μl 1 mg/ml fibronektin stamopløsning fortyndes i 2,5 ml dulbecco's PBS (dpbs, calcium og magnesium frit). Placer opløsningen i vandbad ved 37 °C indtil brug.
2. Forbered 100 μL kollagen-1 opløsning. Der tilsættes 10 μL HEPES (1 M) til 10 μL NaHCO₃ (37 g/L) og blandes med pipettering. Anbring røret på is, og tilsæt 80 μL kollagen-1 (5 mg/mL) for at give en neutraliseret kollagen-1-koncentration på 4 mg/mL. Brug en pipette til at blande omhyggeligt og undgå dannelse af bobler.
3. Tilsæt 1,5 μL kollagen-1 opløsning (4 mg/mL) til gel indløb af hver mikrofluidic enhed (figur 1b, brønd B1). Sørg for, at den dråbe gel er placeret i midten af hver brønd, for at gelen kan komme ind i kanalen (Se figur 2a).
   Bemærk: Phaseguides forhindrer påfyldning af de tilstødende kanaler og muliggør gel-mønster. Korrekt gel loading kan bekræftes under en lysfelt mikroskop ved at observere menisk dannelse gennem ' observation vindue ' (godt B2) eller ved at vende pladen på hovedet. Hvis gelen ikke fuldstændigt fylder kanalen, kan der tilsættes en ekstra dråbe på 1 μL.
4. Mikrofluidic pladen placeres i en inkubator (37 °C, 5% CO₂) i 10 min til polymeriserer kollagen-1.
   Bemærk: Timingen af Polymeriseringen er afgørende; på grund af de lave mængder, der anvendes i mikrofluidics, kan fordampning allerede observeres efter 15 min inkubation, hvilket resulterer i gel kollaps eller svind.
5. Tag pladen ud af inkubator og Overfør til en steril laminar-flow hætte.
6. Tilsæt 50 μl 10 μg/ml FN-overfladebehandlings opløsning til udløbet af den øverste perfusions kanal for hver mikrofluidisk-enhed (figur 1b, godt a3). Tryk pipettespidsen mod siden af brønden for korrekt fyldning af brønden uden at fælde luftbobler (Se figur 2b). Kanalen skal fyldes, og væsken skal fastgøre på stikkontakten (godt C1) uden at fylde stikkontakten godt.
7. Pladen placeres i inkubator (37 °C, 5% CO₂) i mindst 2 dage.
   Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her, da kollagen-1 gel sammen med belægningen blandingen er stabil i mindst 5 dage i inkubator. Hvis belægningen blandingen er forfrisket, længere perioder kunne være muligt, men dette er ikke blevet testet. Afgørende er niveauet af FN-belægning, da dette forhindrer dehydrering af kollagen-1 gel.

3. celle såning/Mikrofartøj kultur

1. Der tilsættes 5 ml føtal kalveserum og 2,5 ml pen/STREP til 500 ml basal endotel cellekulturmedium og filter sterilisering ved hjælp af et flaske topfilter med en porestørrelse på 0,22 μm. Dette medium er nu omtalt som basal medium.
2. Forbered vaskulær vækstmedium: Tilsæt 3 μl 50 μg/ml vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og 2 μl af 20 μg/ml grundlæggende fibroblast vækstfaktorer (bfgf) til 5 ml basal medium.
3. Tø den frosne iPSC-ECs hurtigt (< 1 min) i et 37 ° Cvandbad og Overfør til et 15 mL rør og fortyndes i 10 mL basal medium.
4. Tæl cellerne.
   Bemærk: Et enkelt hætteglas indeholder 1.000.000 celler i 0,5 mL med > 90% levedygtighed.
5. Centrifuger røret ved 100 x g i 5 min. Aspirér supernatanten uden at forstyrre celle pellet og resuspendere i basal medium for at give en koncentration på 2 x 10⁷ celler/ml.
6. Den mikrofluidiske 384-brønd plade overføres fra inkubator til en steril laminar-flow hætte.
7. Aspirere FN-coating opløsning fra perfusion indløb (brønd a1). Tilsæt 25 μL basal medium i indløbs brøndene (brønd a1).
8. Tilsæt en 1 μL dråbe cellesuspension til alle topperfusions indløbs brønden (figur 1b, godt a1). Dråbe skal flade i et par sekunder (Se figur 3a, b for en illustration af denne "passiv pumpe" metode).
   Bemærk: Kontrollér under et mikroskop, om såningen er homogen. Hvis ikke, tilsættes yderligere 1 μL i stikkontakten og vente indtil dråbe flattens.
9. Den mikrofluidiske brønd plade inkubates i 1 time ved 37 °C, 5% CO₂. Efter dette, cellerne skulle have overholdt. Hvis ikke, vente en anden 30 min.
10. Fjern det basale medium fra de øverste perfusions udløb brønde (figur 1b, godt a3). Tilsæt varmt fartøj kulturmedium i den øverste perfusion indløb og udløb (figur 1b, Wells a1 og a3). Anbring pladen på rocker platformen (sat på 7 ° vinkel, 8 min Rocking interval) i inkubator (37 °C, 5% CO₂).
11. Billede pladen ved hjælp af en lysfelt mikroskop med automatiseret fase på dag 1 og 2 efter såning for at bekræfte cellelevedygtighed. Efter 2 dage, en konfluent enkeltlags bør have dannet mod kollagen-1 stilladset.
    Bemærk: Hvis kanalerne ikke ser ud til at være lige så konflydende, kan mikroskibene dyrkes i yderligere 24 timer.

4. undersøgelse af Angiogen spiring, herunder tip-og stalk-celle dannelse

1. Forbered 4,5 mL angiogen spiring medium ved at supplere basal medium med 4,5 μL VEGF (50 μg/mL bestand), 4,5 μL phorbols 12-myristate-13-acetat (PMA) (2 μg/mL bestand), og 2,25 μL af sphingosine-1-phosphat (S1P) (1 mM bestand).
2. Forbered 8,5 mL fartøjs vækstmedium (basal medium suppleret med 30 ng/mL VEGF og 20 ng/mL bFGF).
3. Aspirer medium fra brøndene og tilsæt 50 μL frisk fartøj kulturmedium i de øverste perfusion indløb og udløb brønde og gel indløb og udløb brønde (figur 1b, brønde a1, a3, B1 og B3).
4. Tilsæt 50 μL angiogen spire blanding til hver af de nederste perfusions kanalers indløbs-og udløbs brønde (figur 1b, brønde C1 og C3).
5. Placer enheden tilbage i inkubator (37 °C, 5% CO₂) på rocker platformen for at danne en gradient af angiogeniske vækstfaktorer.
6. Billede 1 dag og 2 dage efter tilsætning af de angiogene vækstfaktorer ved hjælp af en lysfelt mikroskop med automatiseret fase.
   Bemærk: Fortsæt dyrkning af mikroskibene for at studere anastomose (gå til afsnit 5) eller fix og plette mikroskibene for at kvantificere spiring længde og morfologi på dag 2 og dag 6 (gå til punkt 6).

5. undersøgelse af anastomose og spire stabilisering

1. Billede ved hjælp af et lysfelt-mikroskop med automatiseret fase.
2. Der tilsættes 1 μL fluorescently mærket albumin (0,5 mg/mL) til det øverste perfusions indtag (figur 1b, brønd a1) og blandes med en pipette på 50 μl.
3. Pladen overføres til et fluorescerende mikroskop med automatiseret fase og inkubator indstillet til 37 °C. Indstil mikroskop ved 10x objektiv og korrekte eksponeringsindstillinger (f. eks. tetramethylrhodamin [TRITC]-kanal, 20 MS eksponering). Få tidsforskudt billeder hvert minut i 10 minutter.
4. Fjern pladen fra mikroskopet, og Overfør pladen til en steril laminar-flow hætte.
5. Fjern alt medium fra brøndene, og Udskift både fartøjets kulturmedium og det angiogene spiring medium i de tilsvarende brønde (Se trin 4,3 og 4,4).
6. Placer enheden tilbage i inkubator (37 °C, 5% CO₂) for at fortsætte med angiogen spiring.
7. Gentag trin 5.1 − 5.6 for at studere permeabiliteten på dag 6.

6. fiksering, farvning og billeddannelse

1. Aspirer alle kultur medier fra alle brønde.
   Bemærk: Rest mediet eller væsker i de mikrofluidiske kanaler påvirker ikke optagelsen på grund af dens lave volumen på 1 − 2 μL.
2. 25 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS tilsættes til alle perfusions indløb (figur 1b, a1 og C1) og udløbs brønde (figur 1b, a3 og C3). Inkuber i 10 minutter ved RT. Anbring enheden under en lille vinkel (± 5 °) for at inducere strømmen (f. eks. ved at anbringe den ene side af pladen på et låg).
3. Aspirere PFA fra brøndene. Vask alle perfusions indløb og udtag to gange med 50 μl af hank's afbalancerede saltopløsning (hbss). Aspirere HBSS fra brønde.
4. Permeabilize ved RT i 10 min ved tilsætning af 50 μL 0,2% nonionisk overfladeaktivt stof til alle perfusions indløb og udtag.
5. Aspirer det nonioniske overfladeaktive stof fra brønde. Vask perfusions kanalerne to gange ved at tilsætte 50 μL HBSS til alle perfusions indløbs-og udløbs brønde. Aspirere HBSS fra brønde.
6. Plette kerner ved hjælp af Hoechst (1:2000) og F-actin ved hjælp af phalloidin (1:200) i HBSS. Forbered 2,2 mL til 40 enheder, og tilsæt 25 μL til hver perfusion indløb og udløb godt. Anbring pladen under en lille vinkel og Inkuber ved RT i mindst 30 minutter.
7. Vask to gange med 50 μL HBSS i alle perfusions indløb og udtag.
8. Direkte billede ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med automatiseret fase eller Opbevar pladen beskyttet mod lys ved 4 °C til senere brug.

Representative Results

Den mikrofluidiske 3D-cellekultur platform består af 40 perfalerede mikrofluidisk enheder (figur 1a, b), som anvendes til at studere angiogen spiring af perfbrugmikrobeholdere mod en mønstret kollagen-1 gel (figur 1c). Disse mikrobeholdere er kontinuerligt perfektionsog udsat for en gradient af angiogeniske vækstfaktorer (figur 3a-d). De angiogene spirer kan enten undersøgt 2 dage efter gradient eksponering eller dyrkes i mere end 5 dage efter gradient eksponering for at studere anastomose og spire stabilisering (Se tidslinje, figur 1d).

Såning af iPSC-ECs ved anvendelse af passiv pumpe metode bør resultere i homogene såningstæthed (figur 4a, b). Kultur under kontinuerlig perfusion resulterede i flydende-mikrokar i 2 dage, hvor cellerne helt lå i omkreds af den mikrofluidiske kanal og dannelsen af et konflydende enkeltlags mod den mønstrede kollagen-1 gel.

Udsættelse for en gradient af angiogene faktorer resulterede i retningsbestemt angiogen spiring af mikroskibene i den mønstrede kollagen-1 gel (figur 5a-g). Klar spids celle dannelse og invasion i kollagen-1 gel var synlig 24 h efter tilsætning af angiogen gradient, mens stilk celler herunder lumen dannelse var synlige efter 48 h (figur 5a).

Efter fiksering og farvning kan kapillar netværket visualiseres ved hjælp af phalloidin til farvning af F-actin og ved at bruge Hoechst 33342 til at plette kernen (figur 5b, c). Disse spirer kan kvantificeres (f. eks. form og længde¹⁴). Uden tilsætning af vækstfaktorer, bør ingen invasion i kollagen-1 gel observeres (figur 5D). Confocal Imaging blev brugt til at bestemme spire diameteren og til at bekræfte lumen dannelse (figur 5e-g).

Spirer fortsætter med at vokse i retning af gradient og nå den modsatte perfusion kanal inden for 3 − 4 dage efter tilsætning af angiogen vækstfaktorer. Dette resulterer i remodeling af det vaskulære netværk, med en klar reduktion i antallet af angiogene spirer (figur 6a). Dannelsen af lumen blev vurderet ved perfusion af det vaskulære netværk med fluorescently mærkede makromolekyler (f. eks. albumin eller dextrans). Perfusing mikrofartøjer med 0,5 mg/mL mærket albumin før og efter anastomose afslørede en klar forskel i spire permeabilitet efter 10 min (figur 6b-e), hvilket tyder på, at kapillærer stabilisere og modne efter anastomose.

Figur 1: protokol for Mikrofluidisk cellekultur for iPSC-afledte mikrofartøjer. a) bunden af mikrofluidic cellekultur enheden vises med de 40 mikrofluidisk-enheder, der er integreret under 384-brønd pladen. Større visning viser en af de 40 mikrofluidisk-enheder. (b) hver mikrofluidisk-enhed er placeret under 9 brønde med 3 indløbs brønde og 3 udløbs brønde. De mikrofluidiske kanaler adskilles af kamme (» phaseguides «), som muliggør mønstret af silicagelrogeler i den centrale kanal (» gel Channel «), mens der stadig er kontakt med de tilstødende kanaler (» perfusions kanaler «). c) metode til dyrkning af et perfaneret mikrofartøj inden for den mikrofluidiske anordning, som anvendes til at studere gradient drevet angiogen spiring gennem en mønstret kollagen-1 matrix. d) tidsplan for undersøgelse af angiogen spiring og/eller anastomose. Dette tal er blevet modificeret fra Van Duinen et al.¹⁴. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: læsse procedurer for gel og medium. a) eksempler på korrekt og ukorrekt gel deposition. Korrekt arkivering resulterer i en mønstrede kollagen-1 gel i den midterste kanal, som efterfølgende polymeriseres. b) eksempler på korrekt og ukorrekt fyldning af brøndene. Brønde fyldes i rækkefølgen 1 − 4 for at forhindre luftboble diffusering i de mikrofluidiske kanaler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: kontinuerlig hydrostatisk tryk styret flow og gradient stabilisering. a) hydrostatiske trykforskelle mellem brønde resulterer i passiv nivellering og flow inden for de mikrofluidiske kanaler. (b) placering af anordningen på en rocker platform, der er indstillet til 7 ° og 8 min. cyklustid, resulterer i kontinuerlig, tovejs perfusion inden for de mikrofluidiske kanaler. c) gradienter dannes ved at indføre to forskellige koncentrationer i brøndene, som kontinuerligt opdateres ved passiv nivellering. (d) gradient visualisering ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran. Bi-directional flow stabiliserer gradient op til 3 dage. Scale bar = 200 μm. Dette tal er blevet modificeret fra Van Duinen et al.¹⁴. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: passiv pumpe metode til celle såning. (a) passiv pumpe drives af trykforskelle, der skyldes forskelle i overfladespænding. Dette resulterer i et flow fra dråbe (højt indre tryk) mod reservoiret (lavt indre tryk). (b) tid bortfalder en dråbe (grå kontur), der er placeret på toppen af indløbet (hvid kontur) af den mikrofluidisk kanal (blå kontur). Lige efter tilsætning (figur 4b, i), den dråbe på toppen af indløbet krymper (figur 4b, II: 1 s efter tilsætning; IV: 2 s efter tilsætning), hvilket resulterer i et flow mod stikkontakten. Dette fortsætter, indtil dråbe menisk er fastgjort af indløbet (figur 4b, IV). Scale bar = 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: robust 3D-spiring af iPSC-EC-mikrofartøjer. a) spiring af IPSC-EC over tid. Mikrobeholdere blev dyrket til 48 h (højre) og stimuleret derefter med en angiogen cocktail indeholdende 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P og 2 ng/mL PMA. De første spids celler, der invaderer kollagen-1-stilladset (midten), er synlige 24 timer efter eksponering. De første lumen er synlige (pile) 48 h efter eksponering (højre), mens spids-cellerne er migreret yderligere i retning af gradient. (b) matrix af 15 mikrobeholdere, der blev stimuleret med VEGF, S1P og PMA i 2 dage og farves for F-actin (gul) og kerner (blå). Scale bar = 200 μm.c) stimuleret mikrofartøj (positiv kontrol). d) ustimuleret mikrofartøj (negativ kontrol). e) den maksimale projektion af en enkelt kapillar i gelen. (f) samme som (g), men fokuseret på midten. Punkteret linje angiver placeringen af den ortogonale visning i panel g. skala søjler (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: visualisering af angiogen spire permeabilitet før og efter anastomose. (a) anastomose med basal kanal udløser beskæring og modning af angiogene spirer. Nærbillede af kapillær seng ved 2, 4, 6 og 7 dage efter stimulation med angiogeniske vækstfaktorer. (b) angiogene spirer efter 2 dage efter tilsætning af angiogeniske vækstfaktorer. Angiogene spirer dannes i gel, men er endnu ikke forbundet med den nederste perfusions kanal. c) perfusion af mikrofartøjet med 0,5 mg/ml albumin-Alexa 555 opløsning. Fluorescerende billeder opnået ved 0 og 10 min. (d, e) samme som i paneler b og c, men efter 7 dages stimulation. Spirer er forbundet til den anden side og dannede en flydende Micro Vessel i basal perfusions kanalen. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Problem	Forårsage	Løsning
Kollagen-1 ikke indtaste eller fylde kanalen helt	Kollagen-1 dråbe er ikke placeret på toppen af indløbet	Anbring forsigtigt dråbe pladen oven på indløbet fra gelkanalen
	Mængden af kollagen-1 er for lav	Brug 1,5 μL af gelen til at fylde kanalen helt
	Kollagen-1 er for viskøs	Brug en anden batch af kollagen-1
Kollagen-1 strømmer ind i perfusion kanaler	Kollagen-1 er pipetteret direkte ind i indgangen af gel kanal	Anbring forsigtigt dråbe pladen oven på indløbet fra gelkanalen
Kollagen-1 er ikke klar/fiber dannelse	Kollagen-1 er ikke opbevaret korrekt	Opbevar kollagen-1 ved 4 °C, må ikke fryses
	NaHCO3 og Hepes er ikke blandet godt før tilsætning af kollagen-1	Bland forsigtigt NaHCO3 og Hepes ved pipettering, før du tilføjer kollagen-1
Dråbe krymper ikke ved hjælp af passiv pumpe metode	Droplet klæder til siden af brønden	Aspirere dråbe og tilføje ny dråbe på toppen af indløbet
		Sørg for, at stikkontakten er fyldt med mindst 20 μL medium
Der observeres ingen spiring	Vækstfaktorer tilføjes ikke, eller aliquoter lagres ikke korrekt	Forbered frisk angiogen spiring medium
	Luftboble blokerer perfusion/gradient dannelse	Fjern luftbobler ved hjælp af en P20-eller P200-pipette
	Volumen forskelle mellem brønde	Volumen i alle brønde skal være lige for at danne en lineær gradient
Celler ikke levedygtige	Plade ikke placeret på rocker platform/rocker platform slukket	Sørg for, at rocker platformen er tændt og har den rigtige cyklustid/vinkel (8 min/7 °)
	Ingen perfusion muligt på grund af tilstedeværelsen af luftbobler	Fjern luftbobler ved hjælp af en P20-eller P200-pipette
Der dannes ingen lumen, cellerne migrerer som enkeltceller	Der blev tilsat angiogen spiring-blanding, før en enkeltlags blev dannet	Vent yderligere 24 timer, før du tilføjer de angiogene vækstfaktorer
Større variation i spiring tæthed	Forskelle i celletæthed efter såning	Kontroller, om celletætheden er homogen og sammenlignelig mellem mikrofluidiske enheder. Tilføj endnu en dråbe cellesuspension, hvis det er nødvendigt

Tabel 1: fejlfinding af almindelige fejl.

Discussion

Denne metode beskriver kulturen i 40 perfbrugelige endotelmikrobeholdere inden for en robust og skalerbar mikrofluidisk cellekultur platform. Sammenlignet med traditionelle 2D-og 3D-celle dyrkningsmetoder viser denne metode, hvordan et fysiologisk relevant cellulært mikromiljø, der omfatter gradienter og kontinuerlig perfusion, kan kombineres med 3D-cellekultur med tilstrækkelig gennemløb til screening Formål.

En af de største fordele i forhold til sammenlignelige mikrofluidisk analyser er, at denne metode ikke er afhængig af pumper til perfusion, men bruger en rocker platform til at fremkalde kontinuerlig perfusion i alle mikrofluidisk enheder samtidigt. Dette sikrer, at analysen er robust og skalerbar: pladerne kan stables på en rocker platform. Det er vigtigt, at alle mikrofluidiske enheder forbliver individuelt adresserbare, hvilket gør det muligt at gennemføres denne metode inden for lægemiddel screening, herunder generering af en dosis-respons kurve. Desuden, uden en pumpe, billeddannelse og medium udskiftning er langt enklere med mindre risiko for (kryds)-kontaminering.

En anden fordel ved denne metode er brugen af en standardiseret, præ-fremstillede platform, mens sammenlignelige mikrofluidisk cellekultur platforme skal fremstilles af slutbrugerne. Denne tilgængelighed letter vedtagelsen af denne analyse blandt andre akademiske og farmaceutiske forskningsgrupper, hvilket fører til standardisering. I modsætning til mikrofluidiske prototyper sikrer 384-Well-plade interfacet også kompatibilitet med det nuværende laboratorieudstyr (f. eks. aspiratorer, plade handlere og multikanalpipetter), hvilket letter integrationen inden for den nuværende screening infrastruktur .

Der er flere kritiske trin i udførelsen af denne analyse. Collagen-1 gel skal fylde gelkanalen helt. Under pålæsning af gel kan denne fyldning observeres ved at inspicere de mikrofluidiske kanaler enten gennem observationsvinduet (figur 2a) eller ved at spejlvende pladen på hovedet (som vist i figur 1a). Mens påfyldning, kollagen gel bør forblive i midterkanalen, uden at flyde i tilstødende perfusion kanaler. Vi bemærkede, at kvaliteten af kollagen-1 gel er afgørende for korrekt analyse ydeevne. Kollagen-1 partier med for høj viskositet vil føre til ufuldstændig fyldning af gel-kanalen. Efter 10 minutters polymerisering ved 37 °C skal gelen være homogen og klar. Hvis kollagen-1 ikke opbevares korrekt (f. eks. på grund af svingende temperaturer i køleskab), vil kollagen polymerisere inden for kanalerne med klart synlige fiber dannelse. Dette kan resultere i invasion af ECs i gelen uden tilsætning af angiogene faktorer, men uden ordentlig lumen udvikling.

Når cellerne er seedet, er fibronektin coating opløsning fjernet fra brøndene, efterlader kun de mikrofluidisk kanaler fyldt med belægning løsning. Aspiration af overfladebehandlings opløsningen fra mikrofluidiske kanaler kan forårsage gel-forstyrrelse eller gel aspiration. Den cellesuspension skal erstatte/fortrænge denne belægning løsning. Dette fungerer bedst, når cellesuspensionen er seedet ved hjælp af den passive pumpe metode, da direkte Pipettering af cellesuspensionen i kanalerne viser mindre reproducerbare såning tætheder.

Da mikroskibene danner et stabilt enkeltlags mod gelen, resulterer disse små forskelle kun i forskellige tider, der er nødvendige for at nå konfluency. Således er analysen startpunktet bestemmes ved konfluency snarere end kultur tid. Om nødvendigt kan dyrknings tiden forlænges, indtil der er dannet en klar enkeltlags mod gelen.

I brøndene kan luftbobler fanges ved ukorrekt fyldning af brøndene (Se figur 2b). Disse luftbobler vil begrænse strømmen af medium, selv når enheden er placeret på en rocker platform, og resultere i kollaps af mikrofartøjet og forkert gradient dannelse. Ved at trykke pipettespidsen mod sidevæggen af brøndene vil øge succesen med helt at fylde brønden. Hvis en luftboble er fanget i brøndene, kan den fjernes ved forsigtigt at indsætte en steril pipettespids i glasbunden. Luftbobler kan også forekomme inden for de mikrofluidiske kanaler. Når mediet er blevet fjernet fra brøndene, er fordampning af medium mærkbar fra de mikrofluidiske kanaler efter 30 min (på grund af mikroliter volumener i kanalerne). Således udføres medium ændringer fortrinsvis så hurtigt som muligt. Når mediet tilsættes i en kanal med fordampet medium, vil luftbobler blive fanget i de mikrofluidiske kanaler. Disse luftbobler inden for de mikrofluidiske kanaler kan fjernes manuelt ved at placere en P20-pipette direkte på enten indløbet eller stikkontakten og tvinge medium gennem mikrofluidics fra det modsatte brønd. Vellykket fjernelse af luftbobler resulterer i en lille, men mærkbar nedgang i volumen i den anden brønd. Tabel 1 viser almindelige fejl, og hvordan du foretager fejlfinding af dem.

Manglen på en pumpe er en begrænsning, når kontinuerlig billeddannelse er påkrævet, da rocker platformen begrænser brugeren til billede i sekventielle tidsintervaller. Desuden består perfusion af medium i denne platform af bi-directional flow med lave niveauer af forskydnings stress, mens Vaskulaturen in vivo er udsat for ensrettede flow med højere niveauer af forskydnings stress. Mens vi ikke observere negative virkninger af bi-directional flow med hensyn til angiogen spiring, flow er en vigtig Biomekanisk stimulus og fortrinsvis kontrolleres. Men mens der er kommercielt tilgængelige pumpe opsætninger, grænseflade med 384-brønd pladen forbliver udfordrende og pumpe opsætninger alvorligt hæmmer skalerbarheden af denne analyse.

Muligheden for at bruge iPSC-ECs til at studere angiogen spiring åbner op for nye muligheder i sygdoms modellering og narkotikaforskning. I modsætning til primære ECs, kan disse celler genereres i næsten ubegrænsede mængder med en stabil genotype og ved hjælp af genomredigering teknikker, kan celler genereres, herunder gen knockouts og Knock-ins. Da protokollerne til at differentiere ECs fra iPSC er relativt nye, er det dog stadig uklart, hvad der fører til iPSC-ECs, som bedst afspejler primære ECs, og hvilke undertyper af EF der er eller kan genereres. Der er også stadig spørgsmål vedrørende deres relevans. For eksempel, gør iPSC-ECs stadig udviser plasticitet, der er typisk for endotelceller? Og i hvilken grad reagerer iPSC-afledte celler på og interagerer med deres cellulære mikromiljø? Den standardiserede platform præsenteret her kunne bruges til at besvare nogle af disse spørgsmål for yderligere at validere brugen af iPSC-afledte ECs in vitro.

Den mest ligefremme fremtidige retning for denne analyse vil være integrationen af andre celletyper, der spiller en vigtig rolle under angiogenese, såsom pericytes og makrofager. Dette vil lette evnen til at studere makrofager rolle under anastomose mellem spirer eller overholdelse af pericytes efter kapillær dannelse. Det er også muligt at kultur forskellige andre celletyper inden for eller mod en ekstracellulær matrix (f. eks. har vi vist kulturen af neuroner og forskellige epiteliale strukturer såsom proksimale tubuler og små tarme), som kan kombineres med den vaskulære senge genereret ved hjælp af denne metode. Endelig vil det være interessant at studere angiogen spiring i syntetiske hydrogels, som deres definerede sammensætning yderligere øger standardiseringen af analysen og tillader tuning af stivhed og bindende motiver, der påvirker celle-matrix interaktioner.

Afslutningsvis, denne metode viser gennemførligheden af iPSC-afledte ECs i en standardiseret og skalerbar 3D angiogen analyse, der kombinerer fysiologiske relevante kulturforhold i en platform, der har den nødvendige robusthed og skalerbarhed, der skal integreres i lægemiddel screening infrastrukturen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
3-lane OrganoPlate	Mimetas	4003-400B
4% PFA in PBS	Alfa Aesar	J61899
Basal culture medium	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte	VWR	613-2890
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/mL in milliQ water
HBSS	Gibco	14025-050
Hoechst	Molecular Probes	H3569	10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells	NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini	Mimetas		Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep	Sigma	P4333
Phalloidin	Sigma	P1951	1 mg/mL in DMSO
PMA	Focus-Biomolecules	10-2165	2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 μg/mL in water containing 0.1% BSA