ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.
Abstract
מחקר התרופות הפרה-קליני של מחלות כלי הדם דורש במודלים של ואצלב שamendable להקרנה בתפוקה גבוהה. עם זאת, במודלים מסוימים של הקרנת מבחנה שאין להם תפוקה מספיקה יש להם רלוונטיות פיזיולוגית מוגבלת, המעכבת את תרגום הממצאים מחוץ לvivo. מצד שני, פלטפורמות תרבות התאים המיקרופלואידיc הראו רלוונטיות פיזיולוגית שאין כמוה במבחנה, אך לעתים קרובות חסרה התפוקה, המדרגיות והסטנדרטיזציה הנדרשים. אנו מדגימים פלטפורמה איתנה לחקר אנגיוגנזה של תאי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה על ידי האדם (ipsc-ecs) בסביבה פיסיולוגית תאית רלוונטית, כולל זלוף ומעברי צבע. IPSC-ECs הם מתורבתים כמו 40 המכונה 3D מיקרוכלי מיקרו נגד הגרדום קולגן-1. עם יישום של הדרגתי של גורמים אנגיוגנטיים, הסימנים החשובים של אנגיוגנזה ניתן ללמוד, כולל הבידול לתוך תא קצה וקנה והיווצרות של לומן מבשם. Perfusion עם צבע מעקב פלורסנט מאפשר ללמוד חדירות במהלך ואחרי ההשקה של נבטי אנגיוגנטית. לסיכום, שיטה זו מציגה את הכדאיות של ECs-הנגזרים מתוך מתקן מתוקננת ומדרגי תלת-ממדי, המשלב את תנאי התרבות הרלוונטיים הפיסיולוגיים בפלטפורמה בעלת החוסן והמדרגיות הנדרשים שישולבו בתוך תשתית סינון הסמים.
Introduction
במודלים של חוץ גופית ממלאים תפקיד בסיסי בגילוי ובתיקוף של מטרות סמים חדשות של מחלות כלי דם. עם זאת, במודלים מסוימים של הקרנת מבחנה שלהם יש תפוקה מספקת יש רלוונטיות פיזיולוגית מוגבלת1, המעכבת את תרגום הממצאים מחוץ לvivo. כך, כדי לקדם קליני מראש מחקר התרופות כלי דם, שיפור במודלים החוץ-גופית של יום יש צורך לשלב הקרנת תפוקה גבוהה עם מיקרו-הסביבה הרלוונטית הסלולר 3d.
במהלך העשור האחרון, נעשה התקדמות משמעותית כדי להגביר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים מתחום החוץ של הvasקולטורה. במקום תאים אנדותל שטוח על משטחים שטוחים כגון פלסטיק רקמות הרקמה, תאים אנדותל יכול להיות מוטבע בתוך מקפלים תלת-ממד, כגון פיברוב ו ג'ל קולגן2. בתוך מטריצות אלה, התאים האנדותל להראות פנוטיפ רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית הקשורים השפלה מטריקס היווצרות לומן. עם זאת, מודלים אלה מדגימים רק קבוצת משנה של התהליכים הרבים המתרחשים במהלך לבלוב האנגיוגנטי כמו רמזים חשובים מהסביבה הסלולרית עדיין חסרים.
פלטפורמות התרבות התא מיקרופלואידיג מתאימים באופן ייחודי כדי להגדיל עוד יותר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים של מבחנה של ואסילטטורה. לדוגמה, ניתן לחשוף את תאי האנדותל למתח הטיה, שהוא גירוי ביומכאני חשוב עבור ואסילטורה. גם, את האפשרות מרחב שליטה נוזלים בתוך מיקרופלואידיקה מאפשר היווצרות של מעברי צבע ביוקולריות3,4,5,6. מעברי צבע כאלה ממלאים תפקיד חשוב בvivo במהלך היווצרות והתהוות במהלך האנגיוגנזה. עם זאת, בעוד מיקרופלואידיג תא התרבות פלטפורמות הראו רלוונטיות פיזיולוגית ללא תחרות על המסורתי 2D ו-3D שיטות תרבות התא, הם לעתים קרובות חסר התפוקה הנדרשת, המדרגיות והתקינה הנדרשת עבור הקרנת סמים 7. גם, רבים של פלטפורמות אלה אינם זמינים מסחרית ודורשים את הקצה משתמשי למיקרו המכשירים שלהם לפני השימוש8. זה לא רק דורש מכשיר הייצור והידע הטכני, אלא גם מגביל את רמת בקרת איכות לרעה משפיע על התוכסות9.
עד היום, התאים הראשוניים של האדם הראשי נשארים מקור התאים הנפוץ ביותר למודל אנגיוגנזה בתוך מבחנה10. עם זאת, לתאים אנושיים ראשוניים יש מספר מגבלות המעכבו את היישום השגרתי בגישות ההקרנה. ראשית, קיימת אפשרות מוגבלת להגדיל ולהרחיב את התרבויות הראשיות הנגזרות תאים. כך, עבור ניסוי בקנה מידה גדול, קבוצות של תורמים שונים צריך להיות בשימוש, מה שגורם הבדלים גנומית ו אצווה-to-אצווה וריאציות. שנית, לאחר כמה קטעים, תאי האנדותל הראשוניים מאבדים בדרך כלל נכסים רלוונטיים כאשר הם מתורבתים בתוך מבחנה11,12.
תאים אנדותל שמקורם בתאי גזע המושרה על ידי האדם (iPSC) הם חלופה מבטיחה: הם דומים התאים הראשוניים, אבל עם גנוטיפ יציבה יותר כי הוא גם נוטה לעריכת הגנום מדויק. יתר על כן, iPSCs מסוגלים לחדש את עצמי ולכן ניתן להרחיב כמויות כמעט בלתי מוגבל, אשר להפוך את התאים הנגזרים iPSC חלופה אטרקטיבית תאים ראשוניים לשימוש בתוך מודלים מחוץ לתחום הסינון13.
כאן, אנו מתארים שיטה לתאי התרבות האנדותל ככלי תלת-ממד תלת-ממדי בפלטפורמת מיקרופלואידיc מתוקננת עם תפוקה גבוהה של תאים. Perfusion מוחל על ידי הצבת המכשיר על פלטפורמת נדנדה, אשר מבטיח פעולה חזקה ומגדיל את המדרגיות של התהליך. כאשר המיקרוכלים מנוצלים באופן רציף וחשופים למעבר של גורמי אנגיוגנטיים, לבלוב אנגיוגנטי מחקר בסביבה פיזיולוגית יותר של מיקרואקולוגיה סלולרית. בעוד הפרוטוקול תואם מקורות שונים של (הראשי) בתאי האנדותל14,15, התמקדנו בשימוש ב-ipsc האנושי-ecs הנגזר על מנת להגביר את הסטנדרטיזציה של השיטה ולהקל על שילובם בתוך מחקר של תרופות כלי דם.
Protocol
1. הכנת המכשיר
- העבר את המיקרופלואידיג 384-צלחת היטב למכסה זרימה סטרילית.
- הסר את המכסה ולהוסיף 50 μL של מים או פוספט באגירה מלוחים (PBS) לכל אחד מתוך 40 בארות התצפית (איור 1b, היטב B2) באמצעות צינורות רב-ערוצי או חוזרת.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. השאר את הצלחת עם המכסה בארון התרבות הסטרילי בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכנת ג'ל וציפוי
- הכינו 2.5 mL של 10 μg/mL fibronectin (FN) פתרון ציפוי. לדלל 25 μL של 1 mg/mL fibronectin פתרון מניות 2.5 mL של הPBS של דולבקה (dPBS, סידן ומגנזיום חינם). מניחים את התמיסה במקווה המים ב-37 מעלות צלזיוס עד השימוש.
- הכינו 100 μL של פתרון קולגן -1. הוסף 10 μL של HEPES (1 מ ') כדי 10 μL של נחקו3 (37 g/L) ולערבב על ידי ליטוף. מניחים את הצינור על הקרח ולהוסיף 80 μL של קולגן -1 (5 מ"ג/mL) כדי להניב ריכוז קולגן מנוטרל 1 של 4 מ"ג/mL. השתמש בפיפטה כדי לערבב בזהירות ולהימנע מהיווצרות בועות.
- הוסף 1.5 μL של הפתרון קולגן -1 (4 מ"ג/mL) לתוך השקע ג'ל של כל יחידת microfluidic (איור 1b, גם B1). ודא כי ה-droplet של ג'ל ממוקם באמצע כל באר כדי שהג ייכנס לערוץ (ראה איור 2a).
הערה: מדריכים מונעים מילוי הערוצים הסמוכים ומאפשרים הפנינג ג'ל. טעינת ג'ל נכון יכול להיות מאושר תחת מיקרוסקופ ברייטפילד על ידי התבוננות על היווצרות מניסקוס דרך חלון התצפית (גם B2) או על ידי היפוך הצלחת הפוך. אם ג'ל לא לחלוטין למלא את הערוץ, droplet נוסף של 1 μL ניתן להוסיף. - מניחים את הצלחת microfluidic בחממה (37 ° c, 5% CO2) עבור 10 דקות כדי פולימוניזציה קולגן -1.
הערה: עיתוי הפילמור הינו קריטי; בשל הכרכים הנמוכים המשמשים microfluidics התאיידות יכול כבר להיות נצפתה לאחר 15 דקות של דגירה, אשר תוצאות התמוטטות ג'ל או הצטמקות. - קח את הצלחת מהאינקובטור והעבר. למכסה של זרימה סטרילית
- הוסף 50 μl של 10 μg/mL מטפל בפתרון כיסוי לשקע היטב של הערוץ זלוף העליון של כל יחידת microfluidic (איור 1b, היטב A3). הקישו על הפיפטה כנגד הצד של הבאר למילוי נכון של הבאר מבלי ללכוד בועות אוויר (ראו איור 2b). הערוץ צריך למלא, ואת הנוזל צריך להצמיד על השקע (גם C1) ללא מילוי היטב לשקע.
- מניחים את הצלחת בחממה (37 ° c, 5% CO2) לפחות 2 ימים.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן, כמו קולגן-1 ג'ל יחד עם תערובת ציפוי יציב לפחות 5 ימים בחממה. אם תערובת הציפוי מרועננת, ייתכן שתקופות ארוכות יותר יהיו אפשריות, אך פעולה זו לא נבדקה. קריטי הוא הרמה של כיסוי FN, כי זה מונע התייבשות של ג'ל קולגן-1.
3. שירעי תאים/מיקרוכלי
- הוסף 5 מ ל של סרום עגל עוברי ו 2.5 mL של עט/דלקת ל 500 מ ל של השוק הבסיס הטבעי בינונית התרבות ומסנן לעקר באמצעות מסנן העליון בקבוק עם 0.22 יקרומטר גודל הנקבוביות. מדיום זה מכונה כעת בינונית בסיס.
- הכנת בינוני גדילה כלי הדם: להוסיף 3 μL של 50 μg/mL כלי הדם מקדם הצמיחה (בתוספת) ו-2 μL של 20 μg/mL בסיסי הצמיחה פיברומגרם (bFGF) כדי 5 מ ל של המדיום הבסיסי.
- הפשרת iPSC הקפואים-ECs במהירות (< 1 דקות) ב 37 מעלות Cwater ולהעביר לצינור 15 מ ל ולדלל ב 10 מ ל של המדיום הבזליים.
- . תספור את התאים
הערה: בקבוקון אחד מכיל 1,000,000 תאים ב 0.5 mL עם > 90% כדאיות. - צנטריפוגה את הצינור ב 100 x g עבור 5 דקות. מבלי להפריע את הגלולה התא ולהשעות מחדש בינונית בסיס כדי להניב ריכוז של 2 x 107 תאים/mL.
- העבר את המיקרופלואידיג 384-צלחת מהאינקובטור ועד למכסה המנוע הסטרילי.
- מזף את התמיסה FN-ציפוי מתוך כניסת הפרזיה (גם A1). הוסף 25 μL של מדיום בסיס בבארות מפרץ (גם A1).
- הוסף droplet 1 μL של השעיית תא לכל הפרזיה העליון היטב (איור 1b, גם A1). ה-droplet צריך לשטח תוך כמה שניות (ראה איור 3a, b להמחשה של שיטת ' שאיבה פסיבית זו ').
הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ אם הזריעה היא הומוגנית. אם לא, הוסף עוד 1 μL בשקע והמתן עד שהdroplet משטחת. - מודקת בצלחת המיקרופלואידיג עבור 1 h ב 37 ° צ', 5% CO2. לאחר מכן, התאים היו צריכים להיות מדבק. . אם לא, חכו עוד 30 דקות
- הסר את המדיום הבזאלי מתוך בארות לשקע העליון (איור 1b, היטב A3). הוסף מדיום תרבות הספינה חם באוויר העליון ולשקע (איור 1b, בארות A1 ו-A3). מניחים את הצלחת על פלטפורמת נדנדה (להגדיר על זווית 7 °, 8 דקות מרווח נדנדה) בחממה (37 ° c, 5% CO2).
- תמונה צלחת באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם שלב אוטומטי ביום 1 ו 2 לאחר זריעה כדי לאשר את הכדאיות של התא. לאחר יומיים, מונאולייר. היה צריך להיווצר כנגד הפיגום הקולגן
הערה: אם הערוצים אינם מופיעים באופן שווה, המיקרוכלים יכולים להיות מתורבתים לתוספת של 24 שעות.
4. לבלוב המחקר הכולל טיפ-ומבנה תא הקנה
- להכין 4.5 mL של לבלוב אנגיוגנטית בינוני על ידי להשלים בינונית בסיס עם 4.5 μL של ווארג (50 μg/mL מניות), 4.5 μL של פורבול 12-myristate-13-אצטט (PMA) (2 μg/mL מניות), ו-2.25 μL של ספיגוסינוס-1-פוספט (
- הכינו 8.5 mL של הצמיחה כלי בינונית (בסיס הבסיס שיושלם עם 30 ng/mL ו 20 ng/mL bFGF).
- שאוב מדיום מן הבארות ולהוסיף 50 μL של מדיום תרבות הספינה טרי בקצה העליון ובארות לשקע ובורות ג'ל ובארות לשקע (איור 1b, בארות A1, A3, B1 ו-B3).
- הוסף 50 μl של התערובת הנבט של אנגיוגנטי לכל אחד התחתון בערוץ זלוף ובארות שקע (איור 1b, בארות C1 ו-C3).
- מניחים את המכשיר חזרה בחממה (37 ° c, 5% CO2) על פלטפורמת הנדנדה על מנת ליצור הדרגתי של גורמי גדילה אנגיוגנטית.
- תמונה 1 יום ו 2 ימים לאחר הוספת גורמי הצמיחה אנגיוגנטית באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם שלב אוטומטי.
הערה: המשיכו להכין את המיקרוכלים כדי ללמוד השקה (לעבור לסעיף 5) או לתקן ולהכתים את המיקרוכלים כדי לכמת את אורך ומורפולוגיה ביום 2 וביום 6 (עבור לסעיף 6).
5. מחקר השקה וייצוב נבט
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם שלב אוטומטי.
- הוסף 1 μL של אלבומין בתווית (0.5 mg/mL) לקצה העליון של הפרזיה (איור 1b, גם A1) ולערבב באמצעות מעבד 50 μl.
- העבר את הצלחת למיקרוסקופ פלורסנט עם הבמה האוטומטית והחממה להגדיר ב 37 ° c. הגדר מיקרוסקופ בקביעות חשיפה נכונה של 10x ונכונות (לדוגמה, טטרמתילרודדין [TRITC]-ערוץ, 20 ms חשיפה). לרכוש תמונות מעידה בזמן בכל דקה עבור 10 דקות.
- הסירו את הצלחת מהמיקרוסקופ והעבירו את הצלחת למכסה זרימה סטרילית.
- להסיר את כל המדיום מן הבארות ולהחליף הן בינונית תרבות הספינה בינוני ולבלוב אנגיוגנטי בבארות המתאימות (ראה שלבים 4.3 ו 4.4).
- מניחים את המכשיר בחזרה לתוך החממה (37 ° c, 5% CO2) כדי להמשיך לבלוב אנגיוגנטית.
- חזור על הצעדים 5.1-5.6 כדי ללמוד את החדירות ביום 6.
6. קיבעון, כתמים, והדמיה
- ומכה את כל מדיית התרבות. מכל הבארות
הערה: שיורית מדיום או נוזלים בערוצים microflu, אינו משפיע על הקיבעון בגלל הנפח הנמוך של 1-2 ליטר μL. - הוסף 25 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS לכל הפרזיה (איור 1b, A1 ו C1) ובארות לשקע (איור 1b, A3 ו-C3). דגירה עבור 10 דקות ב RT. מניחים את המכשיר תחת זווית קלה (± 5 °) כדי לגרום לזרימה (למשל, על ידי הצבת צד אחד של הצלחת על מכסה).
- . מרוב הבארות לשטוף את כל האישופטים ושקעים פעמיים עם 50 μL של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS). . מביס את HBSS מבארות
- החדירות ב-RT עבור 10 דקות על-ידי הוספת 50 μl של 0.2% nonionic החומרים לכל האינלטס ושקעים.
- . מרוב החומרים מבארות לשטוף את ערוצי זלוף פעמיים על ידי הוספת 50 μl של hbss כדי כל מפרץ היתוך ובארות לשקע. . מביס את HBSS מבארות
- הכתם את הגרעינים באמצעות Hoechst (1:2000) ו-F-actin באמצעות phalloidin (1:200) ב HBSS. להכין 2.2 mL עבור 40 יחידות, ולהוסיף 25 μl לכל משקע זלוף ולפורקן היטב. מניחים את הצלחת תחת זווית קלה הדגירה ב RT עבור לפחות 30 דקות.
- שטוף פעמיים עם 50 μl של hbss בכל האינטזיטים והשקעים של זלוף.
- תמונה ישירה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עם שלב אוטומטי או לאחסן את הצלחת מוגן מפני אור ב 4 ° c לשימוש מאוחר יותר.
Representative Results
הפלטפורמה התלת-ממדית של מיקרופלואידיג מורכבת מ40 מיקרופלואידים (איור 1a, b), המשמשת לחקר לבלוב אנגיוגנטית של מיקרואוניות מיקרו נגד ג'ל קולגן-1 (איור 1a). המיקרוכלים הללו מנוצלים באופן רציף וחשופים למעבר של גורמי גדילה באמצעות אנגיוגנטיים (איור 3a-d). נבטי אנגיוגנטית ניתן ללמוד 2 ימים לאחר חשיפה הדרגתי או תרבותי במשך יותר מ 5 ימים לאחר חשיפה הדרגתי כדי ללמוד ההשקה וייצוב נבט (ראה ציר הזמן, איור 1d).
זריעת iPSC-ECs באמצעות שיטת שאיבה פסיבית צריך לגרום לצפיפויות זריעה הומוגנית (איור 4a, b). התרבות תחת הפרזיה רציפה הביאה לידי מיקרואוניות בתוך יומיים, כאשר התאים מצוידים לגמרי בהיקף של הערוץ המיקרו-פלואידיסי והיווצרות מונאולייר שוטפת נגד הג הקולגן-1.
חשיפה למעבר של גורמים אנגיוגנטיים הביא לבלוב אנגיוגנטית כיוונית של המיקרוכלים בתוך הקולגן בדוגמת-1 ג'ל (איור 5a-g). ברור היווצרות תא עצה והפלישה לתוך הג'ל קולגן-1 היה גלוי 24 שעות לאחר הוספת מעבר הצבע אנגיוגנטי, בעוד תאי גבעול כולל היווצרות לומן נראו לאחר 48 h (איור 5a).
לאחר קיבעון וכתמים, רשת קפילר ניתן לדמיין באמצעות phalloidin לכתם F-actin ובאמצעות Hoechst 33342 להכתים את הגרעין (איור 5b, c). ניצנים אלה ניתן לכמת (למשל, צורה ואורך14). ללא תוספת של גורמי גדילה, אין חדירה לתוך ג'ל קולגן-1 צריך להיות נצפתה (איור 5d). הדמיה confocal וקד שימש כדי לקבוע את קוטר נבט כדי לאשר היווצרות לומן (איור 5e-g).
הנבטים ממשיכים לצמוח לכיוון מעבר הצבע ולהגיע לתעלת הפרזיה הנגדית בתוך 3-4 ימים לאחר הוספת גורמי גדילה באמצעות אנגיוגנטית. התוצאה היא שיפוץ של רשת כלי הדם, עם ירידה ברורה במספר נבטי אנגיוגנטי (איור 6a). היווצרות לומן הוערך על ידי זלוף של הרשת כלי דם עם תווית fluorescently (למשל, אלבומין או דקטרנס). מבשם שירה המיקרוכלים עם 0.5 mg/mL המסומנים אלבומין לפני ואחרי ההשקה חשפה הבדל ברור חדירות נבט לאחר 10 דקות (איור 6b-e), אשר מרמז כי נימים לייצב ובוגרת לאחר ההשקה.
איור 1: פרוטוקול תרבות התאים המיקרופלואידיסי לכלי מיקרו של iPSC. (א) החלק התחתון של המכשיר התרבות התא microflu, מוצג הצגת היחידות מיקרופלואידיג 40 משולבים מתחת לצלחת 384-באר. תצוגה גדולה יותר מציגה את אחת היחידות של מיקרופלואידיג 40. (ב) כל יחידת microflu, ממוקמת מתחת 9 בארות עם 3 בארות כניסת ו 3 בארות שקע. הערוצים המיקרופלואידים מופרדים על-ידי רכסים (' מדריכים '), המאפשרים את הפגל של הידרוג בערוץ המרכזי (' ג'ל ערוץ '), בעוד שעדיין יש קשר עם הערוצים הסמוכים (' ערוצי perfusion '). (ג) שיטה לתרבות מיקרוכלי מיקרו בתוך המכשיר המיקרופלואידיג, המשמש לחקר לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי דרך מטריצה קולגן-1 מתבנית. (ד) ציר זמן ללימוד לבלוב אנגיוגנטי ו/או השקה. דמות זו שונתה מוואן דונן ואח '14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טעינת הליכי ג'ל ובינוני. (א) דוגמאות לתצהיר נכון ושגוי של ג'ל. הגשת התוצאות הנכונות ב קולגן-1 ג'ל בתוך הערוץ האמצעי, אשר לאחר מכן הפילמור. (ב) דוגמאות למילוי נכון ושגוי של הבארות. הבארות מולאו בסדר של 1-4 כדי למנוע השמנה של בועות אוויר בתוך הערוצים המיקרופלואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לחץ הידרוסטטי רציפה זרימה מונחה הדרגתי ייצוב. (א) שינוייםבלחץ הידרוסטטי בין הבארות הנובעים מזרימה פסיבית וזורמת בתוך הערוצים המיקרופלואידים. (ב) הצבת המכשיר על פלטפורמת נדנדה להגדיר ב 7 ° ו 8 דקות מחזור הזמן התוצאות ברציפות, דו-כיווני בתוך הערוצים מיקרופלואידיc. (ג) מעברי צבע נוצרות על ידי החדרת שני ריכוזים שונים בתוך הבארות, אשר מרעננים ברציפות על ידי איזון פסיבי. (ד) הדמיית הדרגתי באמצעות fluorescein isothiocyanate (fitc)-dextran. זרימה דו-כיוונית מייצבת את מעבר הצבע עד 3 ימים. סרגל קנה מידה = 200 μm. דמות זו שונתה מוואן דונן ואח '14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שיטת שאיבה פסיבית לזריעת תאים. (א) שאיבה פסיבית מונעת על ידי הבדלים בלחץ הנגרמים על ידי הבדלים מתח פני השטח. התוצאה היא זרימה מ-droplet (לחץ פנימי גבוה) לעבר המאגר (לחץ פנימי נמוך). (ב) מעידה על הזמן של droplet (מיתאר אפור) הממוקם על גבי החלק העליון (קו מיתאר לבן) של ערוץ microfluidic (מיתאר כחול). מיד לאחר הוספה (איור 4b, i), את ה-droplet על גבי כניסת האוויר מכווץ (איור 4b, ii: 1 לאחר הוספה; iv: 2 s לאחר התוספת), אשר גורמת לזרימה לכיוון השקע. זה נמשך עד ה-droplet מניסקוס מוצמד על ידי מפרץ (איור 4b, iv). סרגל בקנה מידה = 400 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: לבלוב חזק תלת-ממדי של מיקרוכלים iPSC-EC. (א) לבלוב של ipsc-EC לאורך זמן. מיקרואוניות גדלו עבור 48 h (מימין) ולאחר מכן מגורה עם קוקטייל אנגיוגנטי המכיל 50 ng/mL, 500 nM S1P, ו-2 ng/mL PMA. הקצה הראשון-תאים הפולשים קולגן-1 פיגום (באמצע) הם גלויים 24 h לאחר החשיפה. לומן הראשון גלויים (חיצים) 48 h לאחר החשיפה (מימין) בזמן שתאי הקצה היגרו עוד יותר לכיוון מעבר הצבע. (ב) מערך של 15 מיקרואוניות שהיו מוסטימולציה ב-S1P ו-pma במשך יומיים ומוכתם ב-F-actin (צהוב) ובגרעינים (כחול). סרגל בקנה מידה = 200 μm. (ג) מגורה מיקרוכלי (שליטה חיובית). (ד) מיקרו-כלי לא מגורה (שליטה שלילית). (ה) ההטלה המקסימלית של נימי אחד בתוך הג. (ו) כמו (ז) אבל מרוכז באמצע. קו מנוקד מציין את מיקומו של התצוגה האורתוגונלית בלוח g. סרגלי קנה מידה (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הדמיה של חדירות נבט-אנגיוגנטי לפני ואחרי ההשקה. (א) השקה עם ערוץ בסיס מעורר גיזום והתבגרות של נבטי אנגיוגנטי. Closeup של מיטה קפילר ב 2, 4, 6 ו -7 ימים לאחר גירוי עם גורמי צמיחה אנגיוגנטית. (ב) אנגיוגנטי נבטי לאחר יומיים לאחר הוספת גורמי צמיחה אנגיוגנטיים. נבטי אנגיוגנטיים נוצרים בתוך ג'ל, אך עדיין אינם מחוברים לערוץ הפרפיוז התחתון. (ג) perfusion של מיקרוכלי עם 0.5 Mg/mL אלבומין 555 פתרון. תמונות פלורסנט שהתקבלו ב -0 ו -10 דקות (d, e) זהה לחלוניות b ו-c, אך לאחר 7 ימים של גירוי. נבטים מחוברים לצד השני ויצרו מיקרוכלי מיקרו בערוץ הפרפיוז הבזלי. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| עיה | כי | פתרון |
| קולגן -1 לא להיכנס או למלא את הערוץ לחלוטין | הקולגן-1 droplet אינו ממוקם על גבי כניסת | בזהירות למקם את ה-droplet על גבי השקע מערוץ ג'ל |
| נפח של קולגן-1 נמוך מדי | השתמש 1.5 μL של ג'ל כדי למלא את הערוץ לחלוטין | |
| קולגן-1 הוא יותר מדי צמיגי | השתמש באצווה אחרת של קולגן -1 | |
| קולגן -1 זורם לתוך ערוצי זלוף | קולגן-1 הוא מצינורות ישירות לתוך הערוץ של ג'ל | בזהירות למקם את ה-droplet על גבי השקע מערוץ ג'ל |
| קולגן -1 הוא לא ברור/סיבים היווצרות | קולגן -1 לא מאוחסן כראוי | חנות קולגן -1 ב 4 ° c, לא להקפיא |
| נחקו3 ו-hepes אינם מעורבים היטב לפני הוספת קולגן -1 | בזהירות לערבב את נחקו3 ו hepes ידי ליטוף לפני הוספת קולגן -1 | |
| Droplet אינה מכווץ באמצעות שיטת שאיבה פסיבית | Droplet דבקה לצד הבאר | מנושף את droplet ומוסיפים droplet חדש על גבי כניסת האוויר |
| ודא היטב לשקע מתמלא לפחות 20 μL של בינוני | ||
| לבלוב לא נצפתה | גורמי גדילה אינם נוספים או שאינם מאוחסנים כראוי | הכנת מבנה לבלוב אנגיוגנטי טרי |
| בועת אוויר בלוקים perfusion/מעבר הדרגתי היווצרות | הסרת בועות אוויר באמצעות P20 או P200 פיפטה | |
| הבדלי נפח בין בארות | כרכים בכל הבארות צריכים להיות שווים כדי ליצור מעבר צבע ליניארי | |
| תאים שאינם ניתנים לקיימא | הצלחת לא מונחת על פלטפורמת נדנדה/פלטפורמת נדנדה כבוי | ודא פלטפורמת נדנדה הוא על ויש לו את הזמן/זווית מחזור הנכון (8 דקות/7 °) |
| לא ניתן לפרזיה בשל נוכחות של בועות אוויר | הסרת בועות אוויר באמצעות P20 או P200 פיפטה | |
| אין לומן נוצרות, תאים העוברים כתאים בודדים | לבלוב של אנגיוגנטית התווסף לפני שמונאולייר הוקם | המתן 24 שעות נוספות לפני הוספת גורמי הגדילה האנגיוגנטיים |
| וריאציה מרכזית בדחיסות הנביטה | הבדלים בין צפיפויות תאים לאחר זריעת | בדוק אם צפיפות התא היא הומוגנית ומקבילה בין יחידות microfluidic. הוסף עוד droplet של השעיית תא במקרה הצורך |
טבלה 1: פתרון בעיות של שגיאות נפוצות.
Discussion
שיטה זו מתארת את התרבות של 40 מיקרוסייבל המיקרו-כלי בתוך פלטפורמת תרבות תא מיקרופלואידיסי חזקה ומדרגית. לעומת שיטות התרבות 2D ו-3D המסורתית, שיטה זו מראה כיצד הסביבה הפיזיולוגית הרלוונטית הסלולר הכוללת מעברי צבע ופרזיה רציפה ניתן לשלב עם תרבות תא תלת-ממד עם תפוקה נאותה להקרנה מטרות.
אחד היתרונות העיקריים על פני מיקרופלואידיג המקבילה הוא כי שיטה זו אינה מסתמכת על משאבות עבור זלוף אבל משתמש פלטפורמת נדנדה כדי לגרום זלוף רציפה בכל יחידות microfluidic בו. הדבר מבטיח כי השיטת הפעולה איתנה ומדרגית: לוחיות הרישוי יכולות להיות מוערמות בפלטפורמת נדנדה. חשוב לעשות זאת, כל יחידות microflu, להישאר בנפרד למיעון, אשר מאפשר שיטה זו להיות מיושם בתוך הקרנת סמים כולל הדור של עקומת תגובה מינון. יתר על כן, ללא משאבה, הדמיה החלפת בינונית הוא הרבה יותר פשוט עם פחות סיכון (cross)-זיהום.
יתרון נוסף של שיטה זו הוא שימוש של פלטפורמה סטנדרטית, מיוצר מראש, בעוד מיקרופלואידיג תאים המקבילה פלטפורמות התרבות צריך להיות מפוברק על ידי משתמשי הקצה. זמינות זו מקלה על אימוץ העניין בקרב קבוצות המחקר האקדמיות והפרמצבטיות האחרות, המובילות לסטנדרטיזציה. כמו כן, בניגוד מיקרו-טיפוס מיקרופלואידים, ממשק הצלחת 384-באר מבטיח תאימות עם ציוד המעבדה הנוכחי (למשל, משמרים, מטפלים בצלחות ו פיפטות רב-ערוצי), הקלה על האינטגרציה בתוך תשתית ההקרנה הנוכחית .
קיימים מספר שלבים קריטיים בביצוע הפעולה. ג'ל קולגן-1 צריך למלא לחלוטין את ערוץ ג'ל. במהלך טעינת ג'ל, ניתן לצפות במילוי זה על-ידי בדיקת הערוצים המיקרופלואידים דרך חלון התצפית (איור 2a) או על-ידי היפוך הצלחת הפוך (כפי שמוצג באיור 1a). בזמן המילוי, ג'ל הקולגן צריך להישאר במרכז הערוץ, מבלי לזרום לתוך ערוצי זלוף סמוכים. שמנו לב כי איכות ה-קולגן-1 ג'ל היא חיונית לביצוע הביצועים הנכונים. קולגן-1 אצוות עם צמיגות גבוהה מדי יוביל למילוי לא שלם של הערוץ ג'ל. לאחר 10 דקות של פולימוניזציה ב-37 ° c, הג צריך להיות הומוגנית וברור. אם קולגן -1 לא מאוחסן כראוי (למשל, עקב הטמפרטורות לתנודות במקרר), קולגן יהיה לפולימו בתוך הערוצים עם היווצרות סיבים גלויים בבירור. זה יכול לגרום לפלישה של ECs לתוך הג ללא תוספת של גורמים אנגיוגנטיים, אך ללא התפתחות נאותה לומן.
כאשר התאים הם נזרע, הפתרון ציפוי fibronectin מוסר מן הבארות, משאיר רק את ערוצי microflu, מלאים בפתרון ציפוי. שאיפה של פתרון ציפוי מצינורות microflu, יכול לגרום הפרעה ג'ל או שאיפה ג'ל. ההשעיה התא צריך להחליף/להחליפו זה פתרון ציפוי. זה עובד בצורה הטובה ביותר כאשר ההשעיה התא הוא נזרע באמצעות שיטת שאיבה פסיבית, כמו באופן ישיר ללטף את ההשעיה התא לתוך הערוצים להראות צפיפות הזריעה פחות.
כאשר המיקרוכלים יוצרים מונאולייר יציב כנגד הג, הבדלים קטנים אלה מהווים בזמנים שונים הדרושים לצורך הגעה לשטף. לפיכך, נקודת ההתחלה של הקביעה נקבעת בשטף ולא בזמן התרבות. במידת הצורך, ניתן להאריך את זמן התפירה עד שמונאולייר ברור נוצר כנגד הג.
בתוך הבארות, בועות אוויר יכול להיות לכוד על ידי מילוי שגוי של הבארות (ראה איור 2b). אלה בועות אוויר יהיה להגביל את זרימת המדיום, גם כאשר המכשיר ממוקם על פלטפורמת נדנדה, וכתוצאה מכך קריסה של מיקרוכלי מעבר הדרגתי היווצרות המעבר. לחיצה על עצת הפיפטה כנגד הקיר הצדדי של הבארות תגדיל את ההצלחה של מילוי מלא של הבאר. אם בועת אוויר לכודה בתוך הבארות, זה יכול להיות מוסר על ידי החדרת בעדינות קצה הצנרת סטרילי לתחתית הזכוכית. בועות אוויר יכולות להתרחש גם בתוך הערוצים microfluidic. כאשר המדיום הוסר מן הבארות, אידוי של בינוני מורגש מתוך הערוצים microflu, לאחר 30 דקות (עקב כרכים מיקרוליטר בתוך הערוצים). לפיכך, שינויים בינוניים רצוי לבצע במהירות האפשרית. כאשר המדיום מתווסף בערוץ עם בינוני התאדה, בועות האוויר יהיה לכוד בתוך ערוצי microfluidic. אלה בועות אוויר בתוך הערוצים microflu, ניתן להסיר באופן ידני על ידי הצבת מP20 הצינורות ישירות על מפרץ או לשקע ולאלץ בינוני דרך microfluidic מתוך הבאר הפוכה. הסרה מוצלחת של בועות האוויר מביא לירידה קטנה אך ניכרת בנפח הטוב האחר. טבלה 1 מפרטת שגיאות נפוצות וכיצד לפתור אותן.
חוסר משאבה היא מגבלה כאשר הדמיה רציפה נדרשת, כמו פלטפורמת הנדנדה מגביל את המשתמש לתמונה במרווחי זמן רציפים. יתרה מזאת, הפרזיה של המדיום בפלטפורמה זו מורכבת מזרימה דו-כיוונית עם רמות נמוכות של מתח הטיה, ואילו יום נחשף לזרימה חד כיוונית עם רמות גבוהות יותר של מתח הטיה. בעוד אנו לא מתבוננים בהשפעות שליליות של הזרימה הדו-כיוונית ביחס לליבלוב האנגיוגנטית, הזרימה היא גירוי ביומכאני חשוב ורצוי לשליטה. עם זאת, בעוד יש כיוונוני משאבה זמינים מסחרית, ממשק עם צלחת 384-באר נשאר מאתגרת והגדרות המשאבה לעכב באופן חמור את המדרגיות של שיטת הפעולה.
האפשרות להשתמש iPSC-ECs ללמוד לבלוב אנגיוגנטית פותח הזדמנויות חדשות במידול מחלות ומחקר הסמים. בניגוד ECs הראשי, תאים אלה יכולים להיווצר כמויות כמעט ללא גבולות עם גנוטיפ יציבה, על ידי שימוש בטכניקות עריכת הגנום, התאים ניתן ליצור כי כולל הסתרה גן ו טוק-ins. עם זאת, כמו הפרוטוקולים להבדיל ECs מ-iPSC הם חדשים יחסית, זה עדיין לא ברור מה מוביל iPSC-ECs כי הטוב ביותר לשקף ECs הראשי ואילו תתי-משנה של EC או ניתן ליצור. בנוסף, עדיין נותרו שאלות לגבי הרלוונטיות שלהם. לדוגמה, האם ה-iPSC-ECs עדיין מפגין את הפלסטיות האופייני לתאי האנדותל? ולאיזו מידה התאים הנגזרים מגיבים ופועלים עם המיקרו-סביבה הסלולרית שלהם? הפלטפורמה הסטנדרטית המוצגת כאן יכולה לשמש כדי לענות על כמה מהשאלות הללו כדי לאמת עוד יותר את השימוש של ECs-הנגזרים מתוך מבחנה.
הכיוון העתידי הישיר ביותר לצורך מעשה זה יהיה שילוב של סוגי תאים אחרים המשחקים תפקיד חשוב במהלך אנגיוגנזה, כגון קרום הלב ומקרופאגים. זה יקל על היכולת ללמוד את התפקיד של מקרופאגים בזמן ההשקה בין נבטים או הדבקות של קרום הלב לאחר היווצרות נימי. כמו כן, ניתן לתרבות סוגים שונים של תאים אחרים בתוך או נגד מטריצה המומנת (למשל, הראינו את התרבות של הנוירונים ומבנים אפיתל שונים כגון tubules האבוליים ומעיים קטנים), אשר ניתן לשלב עם כלי הדם מיטות שנוצרות באמצעות שיטה זו. לבסוף, יהיה זה מעניין ללמוד לבלוב אנגיוגנטי בהידרוגים סינתטיים, כיוון שהרכב המוגדר שלהם מגדיל עוד יותר את התקינה של המבנה ומאפשר כוונון נוקשות ומניעים מחייבים המשפיעים על אינטראקציות מטריצות של תאים.
לסיכום, שיטה זו מציגה את הכדאיות של ECs-הנגזרים מתוך מתקן מתוקננת ומדרגי תלת-ממדי, המשלב את תנאי התרבות הרלוונטיים הפיסיולוגיים בפלטפורמה בעלת החוסן והמדרגיות הנדרשים שישולבו בתוך תשתית סינון הסמים.
Disclosures
פ. Vulto ו-T. Hankemeier הם בעלי המניות של Mimetas BV. V. בורדורף ו-A. Reijerkerk הם עובדים של Ncardia BV. ו. ואן דוהן, מ. ו. אורלובה ו-איי. אן. או. ואן Zonneveld אין כל גילוי.
Acknowledgments
העבודה הזאת היא חלק נתמך על ידי מענק מחקר של התוכנית של מאגר מצליח של "Meer Kennis" (פרויקט מספר 114022501) של ארגון הולנד לחקר ופיתוח בריאות (ZonMw) וקרן הלב ההולנדית הקונסורציום CVON חבר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).
- Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
- Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).
- Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).
- Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
- Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).
Tags
ביו-הנדסה סוגיה 153 תרבית תאים תלת-ממדיים microfluidics בתוך מבחנה בתאי גזע המושרה על ידי האדם תאים אנדותל אנגיוגנזה מעברי צבע הקרנת תפוקה גבוהה שיטת הפיתוחErratum
Formal Correction: Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro
Posted by JoVE Editors on 01/25/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. The Protocol section was updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 µL of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 µL of basal medium in the outlet well (well A3).
