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Bioengineering

मानकीकृत और स्केलेबल परख का अध्ययन करने के लिए 3 डी एंजियोजेनिक अंकुरण iPSC-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के विट्रो में

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/59678
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Internal Medicine (Nephrology) and the Einthoven Laboratory for Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 2Division of Systems Biomedicine and Pharmacology, Department of Analytical BioSciences and Metabolomics, Leiden University, 3Ncardia, 4Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 5Mimetas

ERRATUM NOTICE

Summary

यह विधि आईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन करती है क्योंकि मानकीकृत माइक्रोफ्लूइडिक प्लेटफॉर्म में 40 पर्फ्यूज 3डी माइक्रोवेसल्स हैं। यह मंच 3 डी में ढाल-चालित एंजियोजेनिक अंकुरण के अध्ययन को सक्षम बनाता है, जिसमें एनेस्टोमोसिस और एंजियोजेनिक स्प्राउट्स का स्केलेबल और हाई-थ्रूपुट तरीके से स्थिरीकरण शामिल है।

Abstract

संवहनी रोगों के पूर्व नैदानिक दवा अनुसंधान के लिए वैक्यूलेचर के इन विट्रो मॉडल की आवश्यकता होती है जो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग में संशोधित होते हैं। हालांकि, वर्तमान इन विट्रो स्क्रीनिंग मॉडल जिनमें पर्याप्त थ्रूपुट है, केवल सीमित शारीरिक प्रासंगिकता है, जो इन विट्रो से वीवो में निष्कर्षों के अनुवाद में बाधा डालता है। दूसरी ओर, माइक्रोफ्लूइडिक सेल कल्चर प्लेटफार्मों ने विट्रो में अद्वितीय शारीरिक प्रासंगिकता दिखाई है, लेकिन अक्सर आवश्यक थ्रूपुट, स्केलेबिलिटी और मानकीकरण की कमी होती है। हम मानव प्रेरित प्लुरीपोटल स्टेम सेल (आईपीएससी-ईसी) से प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं के एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदर्शित करते हैं, जिसमें पेरिलॉजिकल प्रासंगिक सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट शामिल है, जिसमें परफ्यूजन और ग्रेडिएंट शामिल हैं। आईपीएससी-ईसीएस को एक पैटर्न वाले कोलेजन-1 पाड़ के खिलाफ 40 पर्फ्यूज 3डी माइक्रोवेसल्स के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है। एंजियोजेनिक कारकों के ढाल के आवेदन पर, एंजियोजेनेसिस की महत्वपूर्ण पहचान का अध्ययन किया जा सकता है, जिसमें टिप-और डंठल सेल में भेदभाव और परफ्यूसेबल लुमेन का गठन शामिल है। फ्लोरोसेंट ट्रेसर रंगों के साथ परफ्यूजन एंजियोजेनिक स्प्राउट्स के एनास्टोमोसिस के दौरान और बाद में सामर्थ्य के अध्ययन को सक्षम बनाता है। निष्कर्ष में, यह विधि एक मानकीकृत और स्केलेबल 3 डी एंजियोजेनिक परख में आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसीएस की व्यवहार्यता दिखाती है जो एक मंच में शारीरिक प्रासंगिक संस्कृति की स्थिति को जोड़ती है जिसमें भीतर एकीकृत होने के लिए आवश्यक मजबूती और स्केलेबिलिटी है दवा स्क्रीनिंग बुनियादी ढांचे।

Introduction

इन विट्रो मॉडल संवहनी रोगों के नए दवा लक्ष्यों की खोज और सत्यापन में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं। हालांकि, वर्तमान इन विट्रो स्क्रीनिंग मॉडल जिनमें पर्याप्त थ्रूपुट है, केवल सीमित शारीरिक प्रासंगिकता1है, जो इन विट्रो से वीवो में निष्कर्षों के अनुवाद में बाधा डालता है। इस प्रकार, प्री-क्लीनिकल वैस्कुलर ड्रग रिसर्च को आगे बढ़ाने के लिए, वास्कुलचर के इन विट्रो मॉडल में सुधार आवश्यक है जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3डी सेलुलर माइक्रो-वातावरण के साथ उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को जोड़ते हैं।

पिछले दशक के भीतर, वास्कुलचर के इन विट्रो मॉडलकी शारीरिक प्रासंगिकता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति हुई है । ऊतक-संस्कृति प्लास्टिक जैसे फ्लैट सतहों पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को संयोजित करने के बजाय, एंडोथेलियल कोशिकाओं को 3 डी मचान में एम्बेडेड किया जा सकता है, जैसे फिब्रिन और कोलेजन जैल2। इन मैट्रिस के भीतर, एंडोथेलियल कोशिकाएं मैट्रिक्स क्षरण और ल्यूमेन गठन से जुड़े अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक फेनोटाइप दिखाती हैं। हालांकि, ये मॉडल केवल कई प्रक्रियाओं का एक सबसेट प्रदर्शित करते हैं जो एंजियोजेनिक अंकुरण के दौरान होते हैं क्योंकि सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट से महत्वपूर्ण संकेतों की अभी भी कमी है।

माइक्रोफ्लूइडिक सेल कल्चर प्लेटफॉर्म विशिष्ट रूप से वेक्यूलेचर के इन विट्रो मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता को बढ़ाने के लिए उपयुक्त हैं। उदाहरण के लिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं को कतरनी तनाव के संपर्क में लाया जा सकता है, जो वास्कुलचर के लिए एक महत्वपूर्ण जैव यांत्रिक उत्तेजना है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लूइडिक्स के भीतर तरल पदार्थों को स्थानिक रूप से नियंत्रित करने की संभावना बायोमॉलिक्यूलर ग्रेडिएंट3,4,5,6के गठनकीअनुमति देती है। एंजियोजेनेसिस के दौरान गठन और पैटर्निंग के दौरान इस तरह के ढाल वीवो में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, जबकि माइक्रोफ्लूइडिक सेल संस्कृति प्लेटफार्मों पारंपरिक 2 डी और 3 डी सेल संस्कृति विधियों पर अद्वितीय शारीरिक प्रासंगिकता दिखाई है, वे अक्सर आवश्यक थ्रूपुट, स्केलेबिलिटी और मानकीकरण की कमी है जो दवा स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक है 7.इसके अलावा, इनमें से कई प्लेटफ़ॉर्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं और 8काउपयोग करने से पहले अंतिम उपयोगकर्ताओं को अपने उपकरणों को माइक्रोफैब्रिकेटर करने की आवश्यकता होती है। यह न केवल विनिर्माण तंत्र और तकनीकी ज्ञान की आवश्यकता है, लेकिन यह भी गुणवत्ता नियंत्रण के स्तर को सीमित करता है और नकारात्मक प्रजननक्षमता 9को प्रभावित करता है ।

आज तक, प्राथमिक मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं विट्रो10में एंजियोजेनेसिस मॉडल करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सेल स्रोत बनी हुई हैं। हालांकि, प्राथमिक मानव कोशिकाओं की कई सीमाएं होती हैं जो स्क्रीनिंग दृष्टिकोण में उनके नियमित अनुप्रयोग में बाधा डालती हैं। सबसे पहले, प्राथमिक सेल-व्युत्पन्न संस्कृतियों को बढ़ाने और विस्तारित करने की सीमित संभावना है। इस प्रकार, बड़े पैमाने पर प्रयोग के लिए, विभिन्न दानदाताओं के बैचों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप जीनोमिक मतभेद और बैच-टू-बैच भिन्नताएं होती हैं। दूसरा, कुछ मार्गों के बाद, प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाएं आम तौर पर प्रासंगिक गुणों को खो देते हैं जब विट्रो11,12में सुसंस्कृत होता है।

मानव प्रेरित प्लुरीपोटस्टेम सेल (आईपीएससी) से प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाएं एक आशाजनक विकल्प हैं: वे प्राथमिक कोशिकाओं के समान हैं, लेकिन एक अधिक स्थिर जीनोटाइप के साथ जो सटीक जीनोम संपादन के लिए भी उत्तरदायी है। इसके अलावा, आईपीएससी स्वयं को नवीनीकृत करने में सक्षम हैं और इस प्रकार लगभग असीमित मात्रा में विस्तारित किया जा सकता है, जो आईपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं को इन विट्रो स्क्रीनिंग मॉडल13के भीतर उपयोग के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाते हैं।

यहां, हम एक मानकीकृत, उच्च थ्रूपुट माइक्रोफ्लूइडिक सेल संस्कृति मंच में परफ्यूसेबल 3 डी माइक्रोवेसल्स के रूप में एंडोथेलियल कोशिकाओं को संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। परफ्यूजन डिवाइस को रॉकर प्लेटफॉर्म पर रखकर लागू किया जाता है, जो मजबूत ऑपरेशन सुनिश्चित करता है और परख की स्केलेबिलिटी को बढ़ाता है। चूंकि सूक्ष्मवेसल्स लगातार छिद्रित होते हैं और एंजियोजेनिक कारकों के ढाल के संपर्क में आते हैं, इसलिए एंजियोजेनिक अंकुरण का अध्ययन अधिक शारीरिक प्रासंगिक सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट में किया जाता है। जबकि प्रोटोकॉल (प्राथमिक) एंडोथेलियल कोशिकाओं14,15के कई अलग-अलग स्रोतों के साथ संगत है, हमने इस परख के मानकीकरण को बढ़ाने और इसके एकीकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसीएस का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया संवहनी दवा अनुसंधान के भीतर।

Protocol

1. डिवाइस तैयारी

  1. माइक्रोफ्लूइडिक 384-वेल प्लेट को बाँझ लेमिनार-फ्लो हुड में स्थानांतरित करें।
  2. ढक्कन निकालें और एक मल्टीचैनल या दोहरा पाइपेट का उपयोग करके 40 अवलोकन कुओं(चित्रा 1b,अच्छी तरह से B2) में से प्रत्येक में 50 माइक्रोन पानी या फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) जोड़ें।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। कमरे के तापमान (आरटी) पर बाँझ संस्कृति कैबिनेट में ढक्कन के साथ थाली छोड़ दें ।

2. जेल और कोटिंग तैयार करें

  1. 10 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) कोटिंग सॉल्यूशन के 2.5 mL तैयार करें। Dulbecco के PBS (dPBS, कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त) के 2.5 एमएल में 1 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान के 25 μL पतला। उपयोग तक 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में समाधान रखें।
  2. कोलेजन-1 समाधान के 100 माइक्रोन तैयार करें। हेप्स (1 एम) के 10 माइक्रोन को नाहको3 (37 ग्राम/एल) के 10 माइक्रोन में जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। बर्फ पर ट्यूब रखें और कोलेजन के ८० μL जोड़ें-1 (5 मिलीग्राम/mL) एक बेअसर कोलेजन-1 4 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता उपज । ध्यान से मिश्रण करने और बुलबुले के गठन से बचने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  3. प्रत्येक माइक्रोफ्लूइडिक यूनिट(चित्रा 1b,अच्छी तरह से B1) के जेल इनलेट में कोलेजन-1 समाधान (4 मिलीग्राम/mL) के 1.5 माइक्रोन जोड़ें। सुनिश्चित करें कि जेल की बूंद चैनल में प्रवेश करने के लिए प्रत्येक कुएं के बीच में रखी गई है (चित्रा 2aदेखें)।
    नोट: चरणगाइड आसन्न चैनलों को भरने से रोकते हैं और जेल पैटर्निंग को सक्षम बनाता है। सही जेल लोडिंग 'अवलोकन खिड़की' (अच्छी तरह से B2) के माध्यम से या प्लेट उल्टा फ्लिपिंग द्वारा meniscus गठन देख कर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि की जा सकती है। यदि जेल ने चैनल को पूरी तरह से नहीं भरा है, तो 1 माइक्रोन की एक अतिरिक्त बूंद जोड़ी जा सकती है।
  4. कोलेजन-1 को पॉलीमरेज करने के लिए 10 मिन के लिए माइक्रोफ्लूइड प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
    नोट: बहुलीकरण का समय महत्वपूर्ण है; माइक्रोफ्लूइडिक्स में उपयोग की जाने वाली कम मात्रा के कारण, वाष्पीकरण पहले से ही 15 मिन ऊष्मायन के बाद देखा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप जेल पतन या सिकुड़न होता है।
  5. इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और बाँझ लेमिनार-फ्लो हुड में स्थानांतरित करें।
  6. हर माइक्रोफ्लूइडिक यूनिट के टॉप परफ्यूजन चैनल(फिगर 1बी,वेल A3) के आउटलेट को 10 μg/mL FN कोटिंग सॉल्यूशन के ५० μL जोड़ें । हवा बुलबुले फँसाने के बिना अच्छी तरह से सही भरने के लिए अच्छी तरह से के पक्ष के खिलाफ पिपेट टिप दबाएं (चित्रा 2bदेखें)। चैनल भरना चाहिए, और तरल आउटलेट पर पिन (अच्छी तरह से C1) आउटलेट अच्छी तरह से भरने के बिना चाहिए ।
  7. प्लेट को कम से कम 2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, क्योंकि कोलेजन-1 जेल कोटिंग मिश्रण के साथ इनक्यूबेटर में कम से कम 5 दिनों के लिए स्थिर है। यदि कोटिंग मिश्रण ताजा है, तो लंबी अवधि संभव हो सकती है, लेकिन इसका परीक्षण नहीं किया गया है। महत्वपूर्ण एफएन-कोटिंग का स्तर है, क्योंकि यह कोलेजन-1 जेल के निर्जलीकरण को रोकता है।

3. सेल सीडिंग/माइक्रोवेसल कल्चर

  1. भ्रूण बछड़े सीरम के 5 मिलीएल और पेन के 2.5 मिलील/ इस माध्यम को अब बेसल मीडियम कहा जाता है।
  2. वैस्कुलर ग्रोथ मीडियम तैयार करें: बेसल मीडियम के 5 एमजी में 50 माइक्रोन/एमएल वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीजीएफ) और 20 माइक्रोन/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर्स (बीएफजीएफ) के 2 माइक्रोन को 3 माइक्रोन जोड़ें ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जमे हुए आईपीएससी-ईसीएस को तेजी से (<1 min) में पिघलाकर 15 मीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और बेसल माध्यम के 10 एमएल में पतला हो जाएं।
  4. कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: एक एकल शीशी में 0.5 मिलियन 0.5 मिलियन कोशिकाएं होती हैं और 90% व्यवहार्यता के साथ।
  5. 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित करें। 2 x 107 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पैदा करने के लिए बेसल माध्यम में सेल पैलेट को परेशान किए बिना एस्पिरेट सुपरनेटेंट।
  6. इनक्यूबेटर से माइक्रोफ्लूइडिक 384-वेल प्लेट को बाँझ लेमिनार-फ्लो हुड में स्थानांतरित करें।
  7. परफ्यूजन इनलेट (अच्छी तरह से A1) से एस्पिरेट एफएन-कोटिंग समाधान। इनलेट कुओं (अच्छी तरह से A1) में बेसल माध्यम के 25 μL जोड़ें ।
  8. हर शीर्ष परफ्यूजन इनलेट में सेल निलंबन की 1 μL बूंद अच्छी तरह से जोड़ें(चित्रा 1b,अच्छी तरह से A1)। बूंद कुछ ही सेकंड में समतल होना चाहिए (इस 'निष्क्रिय पंपिंग' विधि के चित्रण के लिए चित्रा 3ए, बी देखें)।
    नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें कि सीडिंग सजातीय है या नहीं। यदि नहीं, तो आउटलेट में एक और 1 μL जोड़ें और बूंद सपाट होने तक इंतजार करें।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 1 घंटे के लिए माइक्रोफ्लूइडिक वेल-प्लेट को इनक्यूबेट करें। इसके बाद कोशिकाओं का पालन करना चाहिए था। यदि नहीं, तो एक और 30 मिन का इंतजार करें।
  10. शीर्ष परफ्यूजन आउटलेट कुओं(चित्रा 1b,अच्छी तरह से A3) से बेसल माध्यम निकालें। शीर्ष परफ्यूजन इनलेट और आउटलेट(चित्रा 1b,वेल्स A1 और A3) में गर्म पोत संस्कृति माध्यम जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रॉकर प्लेटफॉर्म (7 डिग्री कोण, 8 मिन कमाल के अंतराल पर सेट) पर रखें।
  11. छवि 1 दिन में स्वचालित चरण के साथ एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्लेट और 2 के बाद सीडिंग सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए । 2 दिनों के बाद कोलेजन-1 पाड़ के खिलाफ एक समप्रवाह मोनोलेयर बनाना चाहिए था।
    नोट: यदि चैनल समान रूप से समप्रवाह नहीं दिखाई देते हैं, तो माइक्रोवेसल्स को अतिरिक्त 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है।

4. टिप और डंठल-सेल गठन सहित एंजियोजेनिक अंकुरण का अध्ययन करें

  1. VEGF के 4.5 माइक्रोन (50 μg/mL स्टॉक), phorbol 12-myristate-13-एसीटेट (पीएमए) (2g/mL स्टॉक) के 4.5 माइक्रोन के साथ बेसल मीडियम सप्लीमेंट करके एंजियोजेनिक स्प्फूइंडिंग मीडियम का 4.5 मिलील तैयार करें और स्फिंगोसिन-1-फॉस्फेट (एस1पी) (1एम स्टॉक) के 4.5 माइक्रोन लंकेश तैयार करें।
  2. पोत विकास माध्यम (बेसल मीडियम 30 एनजी/एमएल जीजीएफ और 20 एनजी/एमएल बीएफएफएफएफ के साथ पूरक) का 8.5 मिलील तैयार करें।
  3. कुओं से एस्पिरेट माध्यम और शीर्ष perfusion इनलेट और आउटलेट कुओं और जेल इनलेट और आउटलेट कुओं में ताजा पोत संस्कृति माध्यम के 50 μL जोड़ें(चित्रा 1b,वेल्स A1, A3, B1 और B3) ।
  4. नीचे perfusion चैनल इनलेट और आउटलेट कुओं में से प्रत्येक के लिए एंजियोजेनिक अंकुर मिश्रण के 50 μL जोड़ें(चित्रा 1b,वेल्स C1 और C3)।
  5. डिवाइस को एंटीजियोजेनिक विकास कारकों के ढाल बनाने के लिए रॉकर प्लेटफॉर्म पर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में वापस रखें।
  6. इमेज 1 दिन और 2 दिन स्वचालित चरण के साथ ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एंजियोजेनिक विकास कारकों के अलावा।
    नोट: एनास्टोमोसिस का अध्ययन करने के लिए माइक्रोवेसल्स को समेटना जारी रखें (धारा 5 में जाएं) या 2 दिन और 6 दिन (धारा 6 में जाएं) में अंकुरित लंबाई और आकृति विज्ञान की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइक्रोवेसल्स को ठीक और दाग दें।

5. एनास्टोमोसिस और स्प्राउट स्टेबिलाइजेशन का अध्ययन करें

  1. स्वचालित चरण के साथ एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि।
  2. फ्लोरोसेंटी लेबल एल्बुमिन (0.5 मिलीग्राम/mL) के शीर्ष परफ्यूजन इनलेट(चित्रा 1b,अच्छी तरह से A1) में 1 μL जोड़ें और 50 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके मिलाएं।
  3. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित चरण और इनक्यूबेटर सेट के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर स्थानांतरित करें। 10x ऑब्जेक्टिव और सही एक्सपोजर सेटिंग्स (जैसे, tetramethylrhodamine [TRITC]-चैनल, 20 एमएस एक्सपोजर) पर माइक्रोस्कोप सेट करें। 10 मिनट के लिए हर मिनट समय चूक छवियों का अधिग्रहण।
  4. माइक्रोस्कोप से प्लेट निकालें और प्लेट को बाँझ लेमिनार-फ्लो हुड में स्थानांतरित करें।
  5. कुओं से सभी माध्यम निकालें और इसी कुओं में पोत संस्कृति माध्यम और एंजियोजेनिक अंकुरण माध्यम दोनों को प्रतिस्थापित करें (चरण 4.3 और 4.4 देखें)।
  6. एंजियोजेनिक अंकुरण जारी रखने के लिए डिवाइस को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में वापस रखें।
  7. 6 दिन में सामर्थ्य का अध्ययन करने के लिए चरण 5.1−5.6 दोहराएं।

6. फिक्सेशन, धुंधला, और इमेजिंग

  1. सभी कुओं से सभी संस्कृति मीडिया Aspirate ।
    नोट: माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों में अवशिष्ट माध्यम या तरल पदार्थ 1−2 माइक्रोन की कम मात्रा के कारण निर्धारण को प्रभावित नहीं करता है।
  2. सभी परफ्यूजन इनलेट(चित्रा 1b,A1 और C1) और आउटलेट कुओं(चित्रा 1b,A3 और C3) के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 25 माइक्रोन जोड़ें। आरटी में 10 min के लिए इनक्यूबेट करें। डिवाइस को एक ढक्कन पर प्लेट के एक तरफ रखकर प्रवाह (जैसे) को प्रेरित करने के लिए एक मामूली कोण (± 5 डिग्री) के तहत रखें।
  3. कुओं से एस्पिरेट पीएफए। हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) के 50 माइक्रोन के साथ सभी परफ्यूजन इनलेट और आउटलेट को दो बार धोएं। कुओं से एस्पिरेट एचबीएसएस।
  4. सभी परफ्यूजन इनलेट ्समें और आउटलेट्स में 0.2% nonionic सर्फेक्टेंट के 50 माइक्रोन जोड़कर 10 मिन के लिए आरटी पर Permeabilize।
  5. कुओं से nonionic surfactant aspirate। सभी परफ्यूजन इनलेट और आउटलेट कुओं में एचबीएसएस के 50 माइक्रोन जोड़कर परफ्यूजन चैनलों को दो बार धोएं। कुओं से एस्पिरेट एचबीएसएस।
  6. एचबीएसएसएस में फेलोडिन (1:200) का उपयोग करके होलेस्ट (1:2,000) और एफ-ऐक्टिन का उपयोग करके नाभिक को दाग दें। 40 इकाइयों के लिए 2.2 mL तैयार करें, और प्रत्येक परफ्यूजन इनलेट और आउटलेट में 25 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को मामूली कोण के नीचे रखें और कम से कम 30 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  7. सभी परफ्यूजन इनलेट और आउटलेट में एचबीएसएस के 50 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं।
  8. स्वचालित चरण के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीधे छवि या बाद में उपयोग के लिए प्रकाश से संरक्षित प्लेट को स्टोर करें।

Representative Results

माइक्रोफ्लूइडिक 3डी सेल कल्चर प्लेटफॉर्म में 40 पर्फेटेड माइक्रोफ्लूइडिक यूनिट्स(फिगर 1ए, बी)शामिल हैं, जिनका उपयोग पैटर्न वाले कोलेजन-1 जेल(चित्रा 1c)के खिलाफ पर्फ्यूज किए गए माइक्रोवेसल्स के एंजियोजेनिक अंकुरण का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इन सूक्ष्म वेसल्स को लगातार परफ्यूड किया जाता है और एंजियोजेनिक ग्रोथ फैक्टर्स(चित्रा 3ए-डी)के ढाल के संपर्क में आता है। एंजियोजेनिक स्प्राउट्स का अध्ययन करने के लिए ढाल जोखिम के बाद 2 दिन या एनास्टोमोसिस और स्प्राउट स्थिरीकरण (टाइमलाइन देखें, चित्रा 1डी)के बाद 5 दिनों से अधिक समय तक संस्कारित किया जा सकता है।

निष्क्रिय पंपिंग विधि का उपयोग करके आईपीएससी-ईसीएस को सीडिंग करने से समरूप सीडिंग घनत्व(चित्र4, बी)में परिणाम होना चाहिए। निरंतर परफ्यूजन के तहत संस्कृति के परिणामस्वरूप 2 दिनों में समप्रवाह माइक्रोवेसल्स हुए, कोशिकाओं ने माइक्रोफ्लूइडिक चैनल की परिधि को पूरी तरह से अस्तर और पैटर्न वाले कोलेजन-1 जेल के खिलाफ एक समप्रवाह मोनोलेयर का गठन किया।

एंजियोजेनिक कारकों के ढाल के संपर्क में आने से पैटर्न वाले कोलेजन-1 जेल(चित्रा 5ए-जी)के भीतर माइक्रोवेसल के दिशात्मक एंजियोजेनिक अंकुरण हुआ। स्पष्ट टिप सेल गठन और कोलेजन-1 जेल में आक्रमण एंजियोजेनिक ढाल के अलावा 24 घंटे दिखाई दे रहा था, जबकि ल्यूमेन गठन सहित डंठल कोशिकाओं 48 घंटे(चित्रा 5a)के बाद दिखाई दे रहे थे।

निर्धारण और धुंधला होने के बाद, केशिका नेटवर्क को एफ-ऐक्टिन को दाग देने और नाभिक(चित्रा 5b, c)को दागने के लिए हॉलोइडिन का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। इन अंकुरित अनाज की मात्रा निर्धारित की जा सकती है (उदाहरण के लिए, आकार और लंबाई14)। विकास कारकों के अलावा, कोलेजन-1 जेल में कोई आक्रमण नहीं देखा जाना चाहिए(चित्र5डी)। कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग अंकुर व्यास का निर्धारण करने और ल्यूमेन गठन(चित्रा 5e-ग्राम)की पुष्टि करने के लिए किया गया था।

अंकुरित लोग ढाल की दिशा की ओर बढ़ते रहते हैं और एंजियोजेनिक विकास कारकों को जोड़ने के बाद 3−4 दिनों के भीतर विपरीत परफ्यूजन चैनल तक पहुंचते हैं। इसके परिणामस्वरूप वैस्कुलर नेटवर्क की रीमॉडलिंग होती है, जिसमें एंजियोजेनिक स्प्राउट्स(चित्रा 6ए)की संख्या में स्पष्ट कमी आती है। लुमेन गठन का मूल्यांकन फ्लोरोसेंटी लेबल वाले मैक्रोमॉलिक्यूल्स (जैसे, एल्बुमिन या डेक्सट्रांस) के साथ संवहनी नेटवर्क के परफ्यूजन द्वारा किया गया था। एनास्टोमोसिस से पहले और बाद में ०.५ मिलीग्राम/mL लेबल एल्बुमिन के साथ माइक्रोवेसल्स को perfusing करने से 10 मिन(चित्रा 6b-e)के बाद अंकुरीय सामर्थ्य में स्पष्ट अंतर का पता चला, जिससे पता चलता है कि केशिकाएं एनास्टोमोसिस के बाद स्थिर और परिपक्व होती हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: आईपीएससी-व्युत्पन्न माइक्रोवेसल्स के लिए माइक्रोफ्लूइडिक सेल कल्चर प्रोटोकॉल। (क)माइक्रोफ्लूइडिक सेल कल्चर डिवाइस के नीचे 40 माइक्रोफ्लूइडिक इकाइयों को प्रदर्शित किया गया है जो 384-वेल प्लेट के नीचे एकीकृत हैं। बड़ा दृश्य 40 माइक्रोफ्लूइडिक इकाइयों में से एक प्रदर्शित करता है। (ख)प्रत्येक माइक्रोफ्लूइडिक इकाई 9 कुओं के नीचे 3 इनलेट कुओं और 3 आउटलेट कुओं के साथ तैनात है । माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों को लकीरें ('चरणबद्ध' द्वारा अलग किया जाता है, जो केंद्रीय चैनल ('जेल चैनल') में हाइड्रोगेल की पैटर्निंग को सक्षम करता है, जबकि अभी भी आसन्न चैनलों ('परफ्यूजन चैनलों') के साथ संपर्क है। (ग)माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के भीतर एक छिद्रित माइक्रोवेसल को संस्कृति बनाने की विधि, जिसका उपयोग पैटर्न वाले कोलेजन-1 मैट्रिक्स के माध्यम से ग्रेडिएंट चालित एंजियोजेनिक अंकुरण का अध्ययन करने के लिए किया जाता है । (d)एंजियोजेनिक अंकुरण और/या एनास्टोमोसिस का अध्ययन करने के लिए टाइमलाइन । इस आंकड़े को वैन डुइनेन एट अल14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जेल और मध्यम के लिए लोडिंग प्रक्रियाएं। (क)सही और गलत जेल बयान के उदाहरण। सही फाइलिंग परिणाम मध्य चैनल में एक नमूनों कोलेजन-1 जेल में बदल ताहै, जिसे बाद में बहुलीकृत किया जाता है। (ख)कुओं को सही और गलत भरने के उदाहरण । माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के भीतर हवा-बुलबुला फंसाने को रोकने के लिए 1−4 के क्रम में कुएं भरे जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: निरंतर हाइड्रोस्टैटिक दबाव संचालित प्रवाह और ढाल स्थिरीकरण। (क)कुओं के बीच हाइड्रोस्टैटिक दबाव के अंतर के परिणामस्वरूप निष्क्रिय समतलीकरण होता है और माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के भीतर प्रवाह होता है । (ख)डिवाइस को 7 डिग्री और 8 मिनट चक्र समय पर सेट किए गए रॉकर प्लेटफॉर्म पर रखने से माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के भीतर निरंतर, द्वि-दिशात्मक परफ्यूजन होता है । (ग)कुओं के भीतर दो अलग-अलग सांद्रता शुरू करके ग्रेडिएंट बनाए जाते हैं, जो निष्क्रिय समतलीकरण से लगातार ताजा होते हैं। (d)फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (फिटसी) -dextran का उपयोग करके ग्रेडिएंट विज़ुअलाइज़ेशन। द्वि-दिशात्मक प्रवाह 3 दिनों तक ढाल को स्थिर करता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े को वैन डुइनेन एट अल14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सेल सीडिंग के लिए निष्क्रिय पंपिंग विधि। (क)निष्क्रिय पंपिंग दबाव मतभेदों से प्रेरित होती है जो सतह तनाव में अंतर के कारण होती है। इसके परिणामस्वरूप जलाशय (कम आंतरिक दबाव) की ओर बूंद (उच्च आंतरिक दबाव) से प्रवाह होता है। (ख)माइक्रोफ्लूइडिक चैनल (नीली रूपरेखा) के इनलेट (सफेद रूपरेखा) के शीर्ष पर रखी गई एक बूंद (ग्रे आउटलाइन) का समय चूक। इसके अलावा के ठीक बाद(चित्रा 4b, मैं),इनलेट के शीर्ष पर बूंद सिकुड़ती है(चित्रा 4b, ii:1 एस इसके बाद; iv:2 एस इसके बाद), जिसके परिणामस्वरूप आउटलेट की ओर प्रवाह होता है। यह तब तक जारी रहता है जब तक कि बूंद मेनिसकस इनलेट(चित्रा 4b, iv)पर टिकी न हो। स्केल बार = 400 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: आईपीएससी-ईसी माइक्रोवेसल्स की मजबूत 3डी अंकुरण। (क)समय के साथ आईपीएससी-ईसी का अंकुरण। माइक्रोवेसल्स ४८ एच (दाएं) के लिए उगाए गए थे और फिर एक एंजियोजेनिक कॉकटेल के साथ उत्तेजित हुए जिनमें ५० एनजी/एमएल VEGF, ५०० एनएम S1P और 2 एनजी/एमएल पीएमए शामिल थे । कोलेजन-1 पाड़ (मध्य) पर आक्रमण करने वाली पहली टिप-कोशिकाएं एक्सपोजर के बाद 24 घंटे दिखाई देती हैं। पहले ल्यूमेंस (तीर) एक्सपोजर (दाएं) के बाद 48 एच दिखाई देते हैं जबकि टिप-कोशिकाएं ढाल की दिशा में आगे बढ़ गई हैं। (ख)15 माइक्रोवेसलों की सरणी जिन्हें 2 दिनों के लिए VEGF, S1P और पीएमए के साथ उत्तेजित किया गया था और एफ-ऐक्टिन (पीला) और नाभिक (नीला) के लिए दाग दिया गया था । स्केल बार = 200 माइक्रोन.(ग)उत्तेजित माइक्रोवेसल (सकारात्मक नियंत्रण)। (d)अउत्तेजित माइक्रोवेसल (नकारात्मक नियंत्रण)। (ई)जेल के भीतर एक केशिका का अधिकतम प्रक्षेपण। (च)वही(जी)के रूप में लेकिन बीच पर ध्यान केंद्रित किया । बिंदीदार रेखा पैनल जी स्केल बार (ए-डी: 200 माइक्रोन; ई-जी: 20 माइक्रोन) में ऑर्थोगोनल दृश्य की स्थिति को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एनास्टोमोसिस से पहले और बाद में एंजियोजेनिक अंकुर सामर्थ्य का दृश्य। (क)बेसल चैनल के साथ एनास्टोमोसिस एंजियोजेनिक स्प्राउट्स की छंटाई और परिपक्वता को ट्रिगर करता है । एंजियोजेनिक विकास कारकों के साथ उत्तेजना के बाद 2, 4, 6 और 7 दिनों में केशिका बिस्तर का क्लोजअप। (ख)एंजियोजेनिक विकास कारकों को जोडऩे के 2 दिनों के बाद एंजियोजेनिक स्प्राउट्स। एंजियोजेनिक स्प्राउट्स जेल के भीतर बनते हैं, लेकिन अभी तक बॉटम परफ्यूजन चैनल से जुड़े नहीं हैं। (ग)05 मिलीग्राम/एमएल एल्बुमिन-एलेक्सा 555 समाधान के साथ माइक्रोवेसल का परफ्यूजन। फ्लोरोसेंट छवियां 0 और 10 मिन में प्राप्त की जाती हैं।(डी,ई)पैनलबी और सी में समान है, लेकिन 7 दिनों की उत्तेजना के बाद। अंकुरित दूसरी तरफ से जुड़े होते हैं और बेसल परफ्यूजन चैनल में एक कन्फ्लोरेंट माइक्रोवेसल बनते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समस्या कारण समाधान
कोलेजन-1 चैनल को पूरी तरह से दर्ज या भरने नहीं देता है कोलेजन-1 बूंद इनलेट के शीर्ष पर नहीं रखा गया है ध्यान से जेल चैनल से इनलेट के शीर्ष पर बूंद जगह
कोलेजन-1 की मात्रा बहुत कम है चैनल को पूरी तरह से भरने के लिए जेल के 1.5 माइक्रोन का उपयोग करें
कोलेजन-1 बहुत चिपचिपा है कोलेजन-1 के एक और बैच का उपयोग करें
कोलेजन-1 परफ्यूजन चैनलों में बहती है कोलेजन-1 सीधे जेल चैनल के प्रवेश में पाइप किया जाता है ध्यान से जेल चैनल से इनलेट के शीर्ष पर बूंद जगह
कोलेजन-1 स्पष्ट नहीं है/ कोलेजन-1 ठीक से संग्रहीत नहीं है 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कोलेजन-1, फ्रीज न करें
कोलेजन-1 जोड़ने से पहले NaHCO3 और HEPES अच्छी तरह से मिश्रित नहीं कर रहे है कोलेजन-1 जोड़ने से पहले पाइपिंग द्वारा नाहको3 और हेप्स को ध्यान से मिलाएं
पैसलेट निष्क्रिय पंपिंग विधि का उपयोग करके सिकुड़नहीं जाता है बूंद कुएं के पक्ष का पालन करता है एस्पिरेट ड्रॉपलेट और इनलेट के शीर्ष पर नई बूंद जोड़ें
सुनिश्चित करें कि आउटलेट अच्छी तरह से मध्यम के कम से कम 20 μL से भर जाता है
कोई अंकुरण नहीं देखा जाता है विकास कारकों को नहीं जोड़ा जाता है या एलिकोट ठीक से संग्रहीत नहीं किए जाते हैं ताजा एंजियोजेनिक अंकुरण माध्यम तैयार करें
एयर बबल ब्लॉक perfusion/ढाल गठन एक P20 या P200 पिपेट का उपयोग कर हवा बुलबुले निकालें
कुओं के बीच मात्रा अंतर सभी कुओं में मात्रा के लिए एक रैखिक ढाल बनाने के लिए बराबर होने की जरूरत है
कोशिकाएं व्यवहार्य नहीं रॉकर प्लेटफॉर्म/रॉकर प्लेटफॉर्म पर नहीं रखी गई प्लेट बंद सुनिश्चित करें कि झूली कुरसी मंच पर है और सही चक्र समय है/
हवा के बुलबुले की उपस्थिति के कारण कोई परफ्यूजन संभव नहीं एक P20 या P200 पिपेट का उपयोग कर हवा बुलबुले निकालें
कोई ल्यूमेंस नहीं बनता है, कोशिकाएं एकल कोशिकाओं के रूप में माइग्रेट होती हैं मोनोलेयर बनने से पहले एंजियोजेनिक अंकुरित मिश्रण जोड़ा गया था एंजियोजेनिक विकास कारकों को जोड़ने से पहले एक अतिरिक्त 24 घंटे रुको
अंकुरण घनत्व में प्रमुख भिन्नता सीडिंग के बाद सेल घनत्व में अंतर जांच करें कि सेल घनत्व सूक्ष्म पदार्थ इकाइयों के बीच समरूप और तुलनीय है या नहीं। यदि आवश्यक हो तो सेल निलंबन की एक और बूंद जोड़ें

तालिका 1: सामान्य त्रुटियों का निवारण करना।

Discussion

यह विधि एक मजबूत और स्केलेबल माइक्रोफ्लूइडिक सेल संस्कृति मंच के भीतर 40 परफ्यूसेबल एंडोथेलियल माइक्रोवेसल की संस्कृति का वर्णन करती है। पारंपरिक 2डी और 3डी सेल संस्कृति विधियों की तुलना में, इस विधि से पता चलता है कि कैसे एक शारीरिक प्रासंगिक सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट जिसमें ढाल और निरंतर परफ्यूजन शामिल है, स्क्रीनिंग के लिए पर्याप्त थ्रूपुट के साथ 3डी सेल संस्कृति के साथ जोड़ा जा सकता है प्रयोजनों.

तुलनीय माइक्रोफ्लूइडिक परख ों पर प्रमुख फायदों में से एक यह है कि यह विधि परफ्यूजन के लिए पंपों पर भरोसा नहीं करती है लेकिन एक साथ सभी माइक्रोफ्लूइडिक इकाइयों में निरंतर परफ्यूजन को प्रेरित करने के लिए एक घुमाव मंच का उपयोग करती है। यह सुनिश्चित करता है कि परख मजबूत और स्केलेबल है: प्लेटों को रॉकर प्लेटफॉर्म पर खड़ी किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, सभी माइक्रोफ्लूइडिक इकाइयां व्यक्तिगत रूप से पता योग्य रहती हैं, जो इस विधि को खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की पीढ़ी सहित दवा स्क्रीनिंग के भीतर लागू करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, एक पंप के बिना, इमेजिंग और मध्यम प्रतिस्थापन (क्रॉस) संदूषण के कम जोखिम के साथ कहीं आसान है।

इस विधि का एक अन्य लाभ एक मानकीकृत, पूर्व-निर्मित मंच का उपयोग है, जबकि तुलनीय माइक्रोफ्लूइडिक सेल संस्कृति प्लेटफार्मों को अंतिम उपयोगकर्ताओं द्वारा निर्मित करने की आवश्यकता है। यह उपलब्धता अन्य अकादमिक और दवा अनुसंधान समूहों के बीच इस परख को अपनाने की सुविधा प्रदान करती है, जिससे मानकीकरण होता है । इसके अलावा, माइक्रोफ्लूइडिक प्रोटोटाइप के विपरीत, 384-वेल प्लेट इंटरफ़ेस वर्तमान प्रयोगशाला उपकरण (जैसे, एस्पिरेटर, प्लेट हैंडलर्स और मल्टीचैनल पिपेट) के साथ अनुकूलता सुनिश्चित करता है, जो वर्तमान स्क्रीनिंग बुनियादी ढांचे के भीतर एकीकरण को सुविधाजनक बनाता है .

इस परख को अंजाम देने में कई अहम कदम हैं। कोलेजन-1 जेल को पूरी तरह से जेल चैनल भरना चाहिए। जेल लोडिंग के दौरान, इस भरने को अवलोकन खिड़की(चित्रा 2a)के माध्यम से या प्लेट को उल्टा फ्लिप करके माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों का निरीक्षण करके या प्लेट को उल्टा करके देखा जा सकता है (जैसा कि चित्रा 1aमें दिखाया गया है)। भरते समय, कोलेजन जेल केंद्र चैनल में रहना चाहिए, आसन्न परफ्यूजन चैनलों में बहने के बिना। हमने देखा कि उचित परख प्रदर्शन के लिए कोलेजन-1 जेल की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। बहुत अधिक चिपचिपाहट वाले कोलेजन-1 बैच जेल चैनल को अधूरा भरने का कारण बनेंगे। 37 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीमराइजेशन के 10 मिन के बाद, जेल समरूप और स्पष्ट होना चाहिए। यदि कोलेजन-1 को ठीक से संग्रहीत नहीं किया जाता है (उदाहरण के लिए, फ्रिज में तापमान में उतार-चढ़ाव के कारण), कोलेजन स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले फाइबर गठन के साथ चैनलों के भीतर बहुलक होगा। इसके परिणामस्वरूप एंजियोजेनिक कारकों के अलावा ईसीएस को जेल में आक्रमण किया जा सकता है, लेकिन उचित लुमेन विकास के बिना।

जब कोशिकाओं को वरीयता दी जाती है, तो फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान कुओं से हटा दिया जाता है, जिससे केवल कोटिंग समाधान से भरे माइक्रोफ्लूइडिक चैनल होते हैं। माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों से कोटिंग समाधान की आकांक्षा जेल व्यवधान या जेल आकांक्षा का कारण बन सकती है। सेल निलंबन को इस कोटिंग समाधान को बदलने/विस्थापित करने की जरूरत है । यह सबसे अच्छा काम करता है जब सेल निलंबन निष्क्रिय पंपिंग विधि का उपयोग कर वरीयता प्राप्त है, के रूप में सीधे चैनलों में सेल निलंबन पाइपिंग कम प्रजनन बोने घनत्व दिखाते हैं ।

चूंकि माइक्रोवेसल्स जेल के खिलाफ एक स्थिर मोनोलेयर बनाते हैं, इसलिए ये छोटे अंतर केवल कन्फ्लोरेंसी तक पहुंचने के लिए आवश्यक विभिन्न समयों में परिणाम देते हैं। इस प्रकार, परख शुरू बिंदु संस्कृति समय के बजाय उत्साह से निर्धारित होता है । यदि आवश्यक हो, तो जलते के खिलाफ स्पष्ट मोनोलेयर बनने तक सत्तकार समय बढ़ाया जा सकता है।

कुओं के भीतर, हवा के बुलबुले कुओं के गलत भरने से फंस सकते हैं (चित्रा 2bदेखें)। ये हवा के बुलबुले मध्यम के प्रवाह को प्रतिबंधित करेंगे, यहां तक कि जब डिवाइस को रॉकर प्लेटफॉर्म पर रखा जाता है, और परिणामस्वरूप माइक्रोवेसल और अनुचित ढाल गठन का पतन होता है। कुओं की साइड वॉल के खिलाफ पिपेट टिप दबाने से कुएं को पूरी तरह से भरने की सफलता में वृद्धि होगी। यदि एक हवा बुलबुला कुओं के भीतर फंस गया है, तो इसे धीरे से ग्लास के नीचे में बाँझ पिपेट टिप डालकर हटाया जा सकता है। माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के भीतर हवा के बुलबुले भी हो सकते हैं। जब कुओं से मध्यम हटा दिया गया है, तो मध्यम का वाष्पीकरण 30 मिनट के बाद माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों से ध्यान देने योग्य होता है (चैनलों के भीतर माइक्रोलीटर की मात्रा के कारण)। इस प्रकार, मध्यम परिवर्तन अधिमानतः जितनी जल्दी हो सके किया जाता है। जब मध्यम सुखाया माध्यम के साथ एक चैनल में जोड़ा जाता है, हवा बुलबुले माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के भीतर फंस जाएगा । माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के भीतर इन हवा बुलबुले को मैन्युअल रूप से या तो इनलेट या आउटलेट पर सीधे पी20 पिपेट रखकर हटाया जा सकता है और विपरीत कुएं से माइक्रोफ्लूइडिक्स के माध्यम से माध्यम को मजबूर कर सकता है। हवा के बुलबुले को सफलतापूर्वक हटाने के परिणामस्वरूप दूसरी अच्छी तरह से मात्रा में एक छोटी लेकिन ध्यान देने योग्य कमी होती है। तालिका 1 सामान्य त्रुटियों को सूचीबद्ध करती है और उन्हें कैसे परेशान करना है।

एक पंप की कमी एक सीमा है जब निरंतर इमेजिंग की आवश्यकता है, के रूप में झूली कुरसी मंच अनुक्रमिक समय अंतराल पर छवि के लिए उपयोगकर्ता सीमा । इसके अलावा, इस मंच में मध्यम के परफ्यूजन में कतरनी तनाव के निम्न स्तर के साथ द्वि-दिशात्मक प्रवाह होता है, जबकि वीवो में वैकुलचर कतरनी तनाव के उच्च स्तर के साथ एकदिशात्मक प्रवाह के संपर्क में आता है। जबकि हम एंजियोजेनिक अंकुरण के संबंध में द्वि-दिशात्मक प्रवाह के नकारात्मक प्रभावों का पालन नहीं करते हैं, प्रवाह एक महत्वपूर्ण जैव यांत्रिक उत्तेजना है और अधिमानतः नियंत्रित है। हालांकि, जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पंप सेटअप हैं, 384-अच्छी प्लेट के साथ इंटरफेसिंग चुनौतीपूर्ण रहता है और पंप सेटअप इस परख की स्केलेबिलिटी को गंभीर रूप से बाधित करते हैं।

एंजियोजेनिक अंकुरण का अध्ययन करने के लिए आईपीएससी-ईसीएस का उपयोग करने की संभावना रोग मॉडलिंग और दवा अनुसंधान में नए अवसरों को खोलती है। प्राथमिक ईसी के विपरीत, इन कोशिकाओं को एक स्थिर जीनोटाइप के साथ लगभग असीम मात्रा में उत्पन्न किया जा सकता है और जीनोम संपादन तकनीकों का उपयोग करके, कोशिकाओं को उत्पन्न किया जा सकता है कि जीन नॉकआउट और दस्तक-ins सहित । हालांकि, चूंकि आईपीएससी से ईसी में अंतर करने के प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत नए हैं, इसलिए यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि आईपीएससी-ईसी की ओर क्या होता है जो प्राथमिक ईसी को सबसे अच्छा प्रतिबिंबित करता है और जो उपप्रकार के ईसी हैं या उत्पन्न किए जा सकते हैं । इसके अलावा, उनकी प्रासंगिकता के बारे में अभी भी शेष प्रश्न हैं । उदाहरण के लिए, क्या आईपीएससी-ईसीएस अभी भी एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट प्लास्टिसिटी का प्रदर्शन करते हैं? और आईपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाएं किस हद तक अपने सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट का जवाब देती हैं और बातचीत करती हैं? यहां प्रस्तुत मानकीकृत मंच का उपयोग इनमें से कुछ प्रश्नों के उत्तर देने के लिए किया जा सकता है ताकि विट्रो में आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसीएस के उपयोग को और मान्य किया जा सके ।

इस परख के लिए सबसे सीधे-आगे भविष्य की दिशा अन्य सेल प्रकारों का एकीकरण होगा जो एंजियोजेनेसिस के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे पेरिसाइट्स और मैक्रोफेज। इससे अंकुरित अनाज के बीच एनास्टोमोसिस के दौरान मैक्रोफेज की भूमिका का अध्ययन करने या केशिका बनने के बाद पेरिसाइट्स के पालन की क्षमता में आसानी होगी। इसके अलावा, एक बाह्य मैट्रिक्स के भीतर या उसके खिलाफ विभिन्न अन्य सेल प्रकारों को संस्कृति करना संभव है (उदाहरण के लिए, हमने न्यूरॉन्स और विभिन्न एपिथेलियल संरचनाओं जैसे समीपस्थ ट्यूबल और छोटी आंतों की संस्कृति दिखाई है), जिसे संवहनी के साथ जोड़ा जा सकता है इस विधि का उपयोग कर उत्पन्न बिस्तर। अंत में, सिंथेटिक हाइड्रोगेल में एंजियोजेनिक अंकुरण का अध्ययन करना दिलचस्प होगा, क्योंकि उनकी परिभाषित संरचना परख के मानकीकरण को और बढ़ाती है और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को प्रभावित करने वाली कठोरता और बाध्यकारी इरादों की ट्यूनिंग की अनुमति देती है।

निष्कर्ष में, यह विधि एक मानकीकृत और स्केलेबल 3 डी एंजियोजेनिक परख में आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसीएस की व्यवहार्यता दिखाती है जो एक मंच में शारीरिक प्रासंगिक संस्कृति की स्थिति को जोड़ती है जिसमें भीतर एकीकृत होने के लिए आवश्यक मजबूती और स्केलेबिलिटी है दवा स्क्रीनिंग बुनियादी ढांचे।

Disclosures

पी वल्टो और टी हैंकेमेयर मिमेटास बीवी के शेयरधारक हैं । वी बोर्गडोर्फ और ए रीजर्जर्र्क नाकार्डिया बीवी के कर्मचारी हैं । वी वान डुइनन, डब्ल्यू स्टैम, वी वी ओरलोवा और एजे वान जोनेवेल्ड के पास कोई खुलासे नहीं हुए हैं ।

Acknowledgments

यह काम ' Meer Kennis से मुलाकात Minder Dieren ' कार्यक्रम (परियोजना संख्या ११४०२२५०१) नीदरलैंड स्वास्थ्य अनुसंधान और विकास संगठन (ZonMw) और डच हार्ट फाउंडेशन CVON कंसोर्टियम अनुदान से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित भाग में है पुन : कनेक्ट.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette Sigma Z654566-1EA
1 M HEPES Gibco 15630-056
3-lane OrganoPlate Mimetas 4003-400B
4% PFA in PBS Alfa Aesar J61899
Basal culture medium NCardia
Collagen-1 Cultrex 3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL VWR 613-2071
dPBS Gibco 14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte VWR 613-2890
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759-1MG 1 mg/mL in milliQ water
HBSS Gibco 14025-050
Hoechst Molecular Probes H3569 10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells NCardia
NaHCO3 Sigma S5761 37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini Mimetas Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep Sigma P4333
Phalloidin Sigma P1951 1 mg/mL in DMSO
PMA Focus-Biomolecules 10-2165 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P Ecehelon Biosciences S-2000 1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin Invitrogen A34786
VEGF Peprotech 450-32-10 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA

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References

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Tags

बायोइंजीनियरिंग इश्यू 153 3डी सेल कल्चर माइक्रोफ्लूइडिक्स इन विट्रो ह्यूमन प्रेरित प्लुरीपोटल स्टेम सेल एंडोथेलियल सेल एंजियोजेनेसिस ग्रेडिएंट्स हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख विकास

Erratum

Formal Correction: Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro
Posted by JoVE Editors on 01/25/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. The Protocol section was updated.

Step 2.6 of the Protocol was updated from:

Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.

to:

Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.

Step 3.7 of the Protocol was updated from:

Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 µL of basal medium in the inlet wells (well A1).

to:

Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 µL of basal medium in the outlet well (well A3).

मानकीकृत और स्केलेबल परख का अध्ययन करने के लिए 3 डी एंजियोजेनिक अंकुरण iPSC-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के विट्रो में
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van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, … More

van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, V., Reijerkerk, A., Orlova, V., Vulto, P., Hankemeier, T., van Zonneveld, A. J. Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (153), e59678, doi:10.3791/59678 (2019).

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